1.1 Citología/biología celular, histología y anatomía microscópica

1.1.1 Citología/biología celularEn la actualidad el estudio de la célula a menudo

recibe el nombre de biología celular y se ocupa de laestructura y la función. La estructura celular seidentifica en detalle sobre todo con la ayuda de lamicroscopia electrónica moderna. La función celularpuede determinarse mediante los diferentes métodosde la biología celular, entre ellos las técnicas inmu-nohistoquímicas y citoquímicas. Los detalles funda-mentales de la estructura y la función de las célulasse presentan en forma abreviada en el capítulo 2,dado que la biología celular desempeña un papelimportante en todos los capítulos: es una clave funda-mental para la compresión de todas las funciones delos tejidos y los órganos. El término “citología”, queantes era sinónimo de biología celular, se utiliza cadavez menos en este contexto.

1.1.2 HistologíaEn sentido estricto la histología es el estudio de los

tejidos. Los tejidos corresponden a un plano interme-dio de organización del cuerpo y se prestan particu-larmente bien para el estudio con el microscopio. Lostejidos son “asociaciones de células con diferencia-ción semejante y sus derivados, las sustancias inter-celulares” (W. Bargmann, 1957), que pueden clasifi-carse según determinados criterios. En la actualidadse distinguen cuatro tejidos básicos: tejido epitelial,tejido conjuntivo (incluidos los tejidos de sostén),tejido muscular y tejido nervioso. Esta clasifica-ción se remonta a Albert Kölliker (1817-1905). Losconocimientos citobiológicos y ontogénicos moder-nos permiten otras clasificaciones; así, por ejemplo,los límites entre las células típicas del tejido conjun-tivo (los fibroblastos) y algunas células del tejidomuscular se desdibujan: los llamados miofibroblastostienen características específicas de los fibroblastospor un lado y de las células musculares por el otro.Las células musculares estriadas pueden ser célulasepiteliales y el tejido nervioso exhibe coincidencias

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1.1 Citología/biología celular, histología y anatomía microscópica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11.1.1 Citología/biología celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11.1.2 Histología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11.1.3 Anatomía microscópica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

1.2 . Microscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21.2.1 Órdenes de magnitud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21.2.2 Microscopia óptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21.2.3 Microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

1.3 Realización de preparados . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41.3.1 Fijación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41.3.2 Inclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

1.3.3 Corte y coloración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41.3.4 Artefactos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91.3.5 Preparados de tejidos vivos . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

1.4 Técnicas especiales de la microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91.4.1 Microscopia electrónica de transmisión . . . . . . .91.4.2 Microscopia electrónica de barrido . . . . . . . . . .11

1.5 Interpretación de los cortes histológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

1.6 Reglas básicas para el diagnóstico . . . . . . . . . . .12

1 Terminología, microscopia y técnica histológica

Introducción

El presente libro se ocupa de las células (citología/biología celular), los tejidos (his-tología) y los órganos (anatomía microscópica) de los seres humanos, el plano inter-medio de la morfología, entre la macroscopia y la bioquímica. Las conclusiones sedesprenden del razonamiento y de la investigación con los microscopios óptico yelectrónico. En este capítulo se describen principalmente los aspectos metódicosimportantes para la evaluación crítica de los preparados microscópicos ópticos yelectrónicos.

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específicas con el tejido epitelial. Todos los órganosestán compuestos por variantes específicas de loscuatro tejidos básicos.

1.1.3 Anatomía microscópicaLa anatomía microscópica también se conoce

como “histología de los órganos”, dado que requiereel conocimiento de la citología y la histología y loaplica a los órganos. Consiste en la comprensión dela funciones de los órganos bajo la consideraciónconcreta de las circunstancias morfológicas micros-cópicas ópticas y electrónicas. Claro que la anatomíamicroscópica también tiene un lado práctico diag-nóstico; provee los conocimientos de la estructuramicroscópica normal, sana, de los órganos que debendominarse en sus fundamentos y también en su desa-rrollo y en la extensión de su variabilidad para reco-nocer y comprender las alteraciones patológicas.

1.2 MicroscopiaLos microscopios son los instrumentos más impor-

tantes para la identificación y la comprensión de losprincipios generales y las particularidades especialesen lo que se refiere a la estructura de las células, lostejidos y los órganos. Los microscopios abren dimen-siones a las que no tiene acceso el ojo desnudo. Elmicroscopio óptico se inventó en el siglo XVII (Antonivan Leeuwenhoek, 1632-1723) y desde entonces seha perfeccionado en forma incesante. Permite unamagnificación de hasta 1.000 veces (1.000 ×). Elmicroscopio electrónico comenzó su desarrollo en ladécada del 30 del siglo XX y trajo consigo un aumen-to considerable de la resolución óptica. En la prácti-ca rutinaria permite obtener aumentos de bastantemás que 100.000 veces (100.000 ×). Los datossiguientes están orientados hacia los intereses prácti-cos del estudiante de medicina.

1.2.1 Órdenes de magnitudEl límite de resolución del ojo desnudo es de alre-

dedor de 0,08 mm, por lo cual puede identificarestructuras de no menos de 100 μm de diámetro.

El microscopio óptico o microscopio de luz tieneun límite de resolución de aproximadamente 0,3 μm(en la práctica, un aumento de alrededor de 1.000veces), con lo cual pueden identificarse bien célulasy bacterias. El límite de resolución depende de la lon-gitud de onda de la luz.

Los órdenes de magnitud habituales de la microsco-pia óptica oscilan entre unos pocos milímetros (mm) yalgunos micrómetros (μm, 1 mm = 1.000 μm).

El microscopio electrónico tiene un límite de reso-lución de alrededor de 0,3 nm; esto permite el estudiode virus y de la ultraestructura de las células y de lasaglomeraciones proteicas grandes (filamentos cito-plasmáticos) o los biopolímeros (p. ej., glucógeno).

Los órdenes de magnitud de la microscopia elec-trónica de rutina oscilan entre varios micrómetros yunos pocos nanómetros (nm, 1 μm = 1.000 nm).

En el cuadro 1-1 se ofrece un panorama generalsobre los órdenes de magnitud de diferentes células ycomponentes celulares.

1.2.2 Microscopia ópticaEl microscopio óptico común sigue siendo el ins-

trumento más importante para la enseñanza de la his-tología, para el diagnóstico clínico y anatomopatoló-gico y para la investigación en la biología celular.Funciona con una fuente luminosa eléctrica cuyosrayos iluminan y atraviesan el preparado desde abajo(microscopia de luz transmitida).

Un microscopio óptico en esencia está compuestopor una fuente luminosa incorporada en el pie delmicroscopio, cuya luz atraviesa el preparado y el sis-tema de lentes del microscopio, un sistema de lentescondensador, una platina, sobre la cual se coloca elpreparado histológico que se desea examinar, objeti-vos (en la mayoría de los casos 3 o 4, ubicados en undispositivo que rota para colocarlos uno a la vez, agusto, en el paso de los rayos) y un ocular. Sistemasde diafragmas aumentan la claridad del preparado.El aumento corriente de los objetivos en los cursos dehistología es de 4, 10, 20 y 40 ×. La imagen aumen-tada que producen los objetivos se aumenta todavíamás por la acción del ocular. El ocular está en la partesuperior del microscopio, por donde se mira. Elaumento del ocular en la mayoría de los casos es de10 ×. El aumento total, con el cual puede observarseun preparado, se obtiene del producto entre el aumen-to del objetivo y el aumento del ocular, o sea, en elejemplo anterior, 40 (= 4 × 10) ×, 100 (= 10 × 10) ×,200 (= 20 × 10) × y 400 (= 40 × 10) ×.

En la investigación se utilizan microscopios espe-ciales.

Microscopia de contraste de fase El microscopiode contraste de fase es particularmente útil para la

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Cuadro 1-1 Ejemplos de órdenes de magnitudde diferentes células y componentes celulares

Óvulo diferenciado

Célula del epitelio intestinal (altura)

Célula epitelial del hígado (según elestado funcional)

Linfocitos

Eritrocitos

Mitocondrias (longitud)

Microvellosidades (intestino delgado)

Bacterias

Virus

Partícula de glucógeno (partícula β)

Filamento de queratina

≅ 250-300 μm

≅ 20-25 μm

≅ 15-30 μm

≅ 8 μm

≅ 7,6 μm

≅ 2-5 μm

≅ 1-1,5 μm

≅ 1-2 μm

≅ 10-100 nm

≅ 20 nm

≅ 10 nm

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observación de células (de cultivos, protozoarios)vivas (no teñidas). Intensifica el contraste de lasestructuras celulares que apenas son visibles en elmicroscopio de luz transmitida corriente. El objeto(el preparado) mismo actúa como divisor del rayoluminoso para complementar trayectos de ondasluminosas capaces de interferir.

Microscopia de interferencia En la microscopiade interferencia (de Nomarski), el haz luminoso sedivide antes de atravesar el preparado por la acciónde un dispositivo optomecánico específico. Elmicroscopio de interferencia también es particular-mente apto para estudiar células vivas pero tambiénpuede aplicárselo para la observación de preparadosinmunohistoquímicos, en los cuales sólo están teñi-das células aisladas y su entorno carece de tinción.

Microscopia de fluorescencia Con la ayuda delmicroscopio de fluorescencia pueden analizarseestructuras celulares autofluorescentes o estructurasa las que se les unen fluorocromos. De una eficaciaparticular es la microscopia de epifluorescencia, enla cual los rayos excitadores llegan al objeto desdearriba. La técnica de la inmunofluorescencia indi-recta combina la gran sensibilidad de la microscopiade fluorescencia con la especificidad de los métodosinmunohistoquímicos. Una desventaja puede ser elrápido desvanecimiento de la imagen fluorescente.

Microscopia de polarización La luz polarizada(que vibra en un solo plano) se utiliza en el micros-copio de polarización para detectar y analizar estruc-turas muy bien ordenadas, por ejemplo, fibrillas colá-genas de distribución paralela o fascículos de fila-mentos de miosina organizados en forma paralela enlas bandas A de la célula muscular esquelética o car-díaca. En la luz polarizada estas estructuras con ungrado alto de orden se comportan como birrefringen-tes (anisótropas). Brillan con claridad cuando trans-curren diagonalmente entre dos filtros de polariza-ción cruzados. Los componentes estructurales con unorden irregular se comportan como monorrefringen-tes (isótropos) y permanecen siempre oscuros en elmicroscopio de polarización.

Videomicroscopia La videomicroscopia se realizacon la ayuda de una videocámara de gran resolución.La imagen visible en una pantalla puede manipularseelectrónicamente; por ejemplo, las manifestacionesluminosas (señales) muy débiles y pequeñas puedenintensificarse. El procedimiento recibe el nombre de“contraste de interferencia diferencial videopotencia-do” (VE-Dic = Video-enhanced-differential-interferen-ce-contrast). También puede aplicárselo con eficacia acélulas vivas y, por ejemplo, puede rastrearse la migra-ción de partículas minúsculas dentro de la célula.

Microscopia láser confocal La microscopia láserconfocal es un perfeccionamiento de la microscopia

de epifluorescencia. Un haz láser (la mayoría de lasveces un láser de criptón-argón) barre el preparado.El análisis se realiza con la ayuda del procesamientoelectrónico de la imagen. La estructura especial delmicroscopio permite el análisis de preparados grue-sos, los cuales pueden descomponerse ópticamenteen muchos planos (microtomografía). Las imágenesde los planos individuales pueden armarse técnica-mente en una imagen tridimensional.

1.2.3 Microscopia electrónicaSe distinguen los siguientes tipos de microscopioselectrónicos:■ Microscopio electrónico de transmisión■ Microscopio electrónico de barrido■ Microscopio electrónico de barrido de efecto túnel

El microscopio electrónico de transmisión per-mite resoluciones que superan mucho la del micros-copio óptico. Esto es posible porque en lugar de usar-se la luz visible, con su longitud de onda natural, seutilizan haces de electrones, cuya longitud de onda esmucho menor. En los microscopios óptico y electró-nico el trayecto de los rayos en principio es semejan-te. En lugar de lentes de cristal se usan las llamadaslentes electrónicas (bobinas electromagnéticas). Lafuente de electrones es un cátodo; el haz electrónicoes acelerado por alta tensión y transcurre por un tuboal gran vacío. La imagen se observa mediante unalente de aumento binocular sobre una pantalla fluo-rescente.

Con la ayuda del microscopio electrónico de tras-misión (MET) clásico pueden analizarse cortes detejido pequeños (1-3 mm2), muy delgados (30-80nm) (cortes ultrafinos), preparados mediante una téc-nica costosa y, en la práctica, como continuación dela microscopia óptica. El MET también permite elanálisis de las réplicas finísimas que se preparan en el ámbito de los métodos de criofractura.

Microscopio electrónico de barrido Con elmicroscopio electrónico de barrido (MEB) seobservan superficies naturales (o también artificia-les) de objetos (epitelios, células, fibras extracelu-lares, sustancias duras, órganos, animales enteros,etc.). Antes de la observación en el MEB el objetotiene que deshidratarse y cubrirse con una películadelgada de metal noble (sombreado). El MEB fun-ciona sin lentes formadoras de imágenes. Un prepa-rado se explora (“barre”) en líneas secuenciales conun haz de electrones compacto. Para la formaciónde la imagen sirven los electrones retrodispersados(electrones secundarios). El detector es un disquillode centelleo. Las señales luminosas de este disqui-llo son intensificadas por un fotomultiplicador yretroconvertidas en señales eléctricas. La imagendel MEB, que de nuevo se ve en una pantalla fluo-rescente, aparece sucedáneamente a través de unbarredor de líneas.

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Microscopio electrónico de barrido de efectotúnel El microscopio electrónico de barrido de efec-to túnel permite el análisis de superficies con unaresolución atómica. Aquí sólo pueden examinarsesuperficies de barrido minúsculas (de alrededor de1μm2).

1.3 Realización de preparadosLos métodos reseñados a continuación se utilizan

para realizar los preparados histológicos habitualesen la práctica de la anatomía, la anatomopatología yla investigación clínica así como en los cursos de his-tología. Una mirada a estas técnicas también deberíafomentar el conocimiento y la crítica de los métodos.Los pasos metodológicos descritos aquí son consecu-tivos (fig. 1-1):■ Fijación■ Inclusión■ Realización de los cortes■ Coloración.

1.3.1 Fijación

La fijación tiene por objetivo:■ Mantener en la medida de lo posible el tejido en

su estado natural y evitar su desintegración o suautólisis.

■ Endurecer el material y así conseguir una mejorcapacidad de corte.

■ Eliminar las bacterias u otros agentes etiológicosde enfermedades que existan en la muestra para elexamen.

Muchos medios de fijación, por ejemplo, la solu-ción de formaldehído neutra al 5%, el ácido pícrico,el sublimado corrosivo y el alcohol, son precipitantesde las proteínas y formadores de redes proteicas.Mediante la alteración de la estructura de las proteí-nas y otras acciones de los medios de fijación el esta-do celular inicial se modifica y se produce una trans-formación más o menos obvia de la estructura naturalde la célula viva. El resultado es una llamada imagende equivalencias de características constantes, con lacual puede trabajarse con confianza, según lodemuestra la experiencia de décadas. Sin embargo,no debe olvidarse nunca que se examinan célulasmuertas y con modificaciones químicas y que esimprescindible reunir intelectualmente los resultadosde muchos métodos diferentes para obtener una ima-gen de la célula viva y su dinámica. Con frecuencialas muestras de tejido sencillamente se sumergen enlas soluciones fijadoras (fijación por inmersión). Unresultado mejor se consigue con la ayuda de la fija-ción por perfusión, mediante la cual el órgano quedebe fijarse se infiltra con el medio de fijación a tra-vés de su propio sistema vascular y así se fija.

1.3.2 Inclusión

La preparación de cortes finos (de alrededor de 5-8μm en los preparados de rutina para la microscopiaóptica) de fragmentos de órganos fijados se realizacon la ayuda de instrumentos especiales (micróto-mos). Las muestras de tejido fijadas se colocan en undisolvente adecuado para poder incluirlas en parafinalíquida y luego cortarlas, una vez que la parafina sesolidifica. Como disolvente se usa una serie gradualde alcoholes de concentración creciente que no sóloconduce a la extracción completa del agua y así a unendurecimiento adicional del objeto sino que almismo tiempo también disuelve la mayor parte de loslípidos de las células y los tejidos. En esta fase de larealización del preparado hay amplias posibilidadesde que aparezcan artefactos, como retracciones y des-garros del tejido. Como medio de inclusión en lamicroscopia óptica habitualmente se utiliza la para-fina o mejor el Paraplast. Se logran preparados his-tológicos buenos en particular cuando para la inclu-sión se utiliza una resina sintética (p. ej., metacrila-to). En el texto que sigue y en los epígrafes de lasfiguras los preparados incluidos en esta forma seidentifican con la palabra “plástico”. Los cortes dematerial incluido en plástico tienen un espesor desólo 1-2 μm y muestran las estructuras celulares ehísticas más claramente que los cortes de materialincluido en parafina, en los cuales muchas estructurasaparecen superpuestas.

En la criomicroscopia también se logra el endure-cimiento de la muestra de tejido mediante la coloca-ción de los fragmentos de órganos frescos en nitróge-no líquido y el corte posterior en un micrótomo decongelación especial, pero se evita la extracción delagua (deshidratación) con el peligro de la retraccióndel tejido y los solventes que disuelven los lípidos.Así, muchos componentes moleculares de los tejidosse mantienen en su configuración natural y luegopueden demostrarse con métodos histoquímicos, porejemplo, las enzimas de la cadena respiratoria. Lapreparación de cortes por congelación puede realizar-se con mucha rapidez, de modo que es posible, porejemplo, efectuar un diagnóstico histológico intrao-peratorio.

1.3.3 Cortes y coloraciónLas muestras cortadas a un espesor de unos 5-8

μm con la ayuda de un micrótomo (fig. 1-1) y adhe-ridas con firmeza a portaobjetos deben colorearsepara lograr un contraste mejor de los componentescelulares e hísticos individuales. Sin embargo,como las soluciones colorantes habituales son en sumayoría soluciones acuosas el corte tiene que des-parafinarse y rehidratarse en pasos intermedios adi-cionales. Luego de este tratamiento previo losdiversos elementos celulares e hísticos captan los colorantes de las soluciones con afinidad varia-ble, en lo cual las fuerzas electrostáticas entre los

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colorantes y los componentes celulares e hísticoscon frecuencia cumplen un papel decisivo. Loscomponentes con cargas eléctricas negativas (com-ponentes aniónicos), como el DNA, captan coloran-tes básicos (catiónicos), por ejemplo la hematoxili-na, y se llaman basófilos. Son basófilos, por ejem-plo, el núcleo celular y las granulaciones de Nissl.Los componentes celulares e hísticos con cargaseléctricas positivas, o sea los componentes catióni-cos, captan los colorantes ácidos (aniónicos) y sedenominan acidófilos o eosinófilos, porque el colo-rante ácido de uso más frecuente se llama eosina.Los colorantes ácidos tiñen, por ejemplo, los eritro-citos y el colágeno. Además de unas pocas colo-raciones de rutina hay una gran cantidad de colora-ciones especiales.

Coloración de rutina La coloración de rutina típicaes la tinción con hematoxilina y eosina (H-E) (fig.1-2). La hematoxilina tiñe de azul violeta los núcleosy las partes del citoplasma con una abundancia deretículo endoplasmático rugoso. La eosina tiñe de rojo otras partes del citoplasma así como muchoscomponentes extracelulares fibrosos. El color azulvioleta se debe a la existencia de regiones con carganegativa en el preparado (ácidos nucleicos [DNA,RNA], algunas mucinas y proteoglucanos extracelu-lares).

Otras coloraciones de rutina (cuadro 1-2) son latinción con azán, la tricrómica de Masson (fig. 1-3)y la tricrómica de Goldner (fig. 1-4), las cuales per-miten identificar particularmente bien la distribucióndel colágeno.

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Obtención detejido fresco

Fragmentodel tejido obtenido

Cortes delfragmento aptospara la fijación

Fijación,p. ej., en formaldehído

Deshidratación en seriealcohólica de concentración

creciente

Inclusión,p. ej., en parafina

o Paraplast

Bloque deparafina listo

Corte en micrótomocon cuchilla de acero

Colocación y secadodel corte sobreun portaobjetos

Eliminación de la parafinacon xileno

Serie alcohólica deconcentración decreciente

Coloración de los cortes

Serie alcohólica deconcentración creciente

Montaje del corte coloreadoen un medio de montaje

bajo un cubreobjetos(preparado durable)

Fig. 1-1 Realización de preparados. Representación de los pasos consecutivos que se requieren para obtener, a partir de unamuestra de tejido fresco, un corte histológico coloreado apto para el examen microscópico óptico. (De [1])

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Las tinciones para elastina tornan visible la elas-tina de las fibras elásticas (fig. 1-5).

Métodos histoquímicos Entre las tinciones especia-les los métodos histoquímicos ocupan una posiciónprioritaria; en el cuadro 1-2 se reseñan las tincionesde uso frecuente. Con la ayuda de la histoquímica desustrato y enzima puede demostrarse una gran canti-dad de las más variadas sustancias químicas defini-das, como muchas enzimas, glucógeno, ácidos ribo-nucleico y desoxirribonucleico, proteínas, proteoglu-canos, lípidos, etc., en el sitio de su ubicación naturalen células y tejidos, con lo cual se obtiene una buenaidea de los acontecimientos celulares dinámicos (fig.1-6).

En el pasado reciente la inmunohistoquímica haexperimentado un desarrollo especial. Con la ayudade esta técnica pueden demostrarse enlaces químicosespecíficos, sobre todo de péptidos y proteínas, pormedio de una reacción antígeno-anticuerpo (fig. 1-7).Hay varias técnicas individuales, pero lo fundamentales que el corte de tejido en cual se desea demostrar uncomponente químico determinado (un antígeno)siempre se incuba con una solución que contiene un

anticuerpo específico contra el antígeno buscado. Elanticuerpo se une a los sitios de las células o del espa-cio extracelular en los cuales está el antígeno y así lodemuestra in situ.

La visualización de la reacción se consigue demodos diferentes; por ejemplo, el anticuerpo puedemarcarse con una sustancia fluorescente o pue-de demostrarse, en un segundo paso, en una reaccióncon otro anticuerpo marcado con una enzima (amenudo peroxidasa). La determinación de la enzimase realiza entonces con métodos enzimohistoquími-cos clásicos.

En la autorradiografía precursores radiactivos delDNA (3H-timidina) o del RNA (3H-uridina) se inyec-tan en forma intravenosa en animales de experimen-tación. Estos precursores se incorporan en los núcle-os (DNA) o en el nucléolo o los ribosomas (RNA).Los cortes de tejido se cubren con una emulsión foto-gráfica cuyos cristales con contenido de plata seennegrecen por la radiactividad y marcan los sitios deincorporación del precursor en cuestión. En el casode la marcación de DNA se exponen los núcleos en lafase S. Con este método también puede determinarsela velocidad del recambio celular.

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Fig. 1-2 Tinción con hematoxilina y eosina (H-E). Núcleoscelulares en azul oscuro o violeta; citoplasma y sustanciaintercelular en rojo. Glándulas cutáneas de un antílope(Aepyceros melampus): 1 glándulas odoríferas (apocrinas);2 glándulas sebáceas (holocrinas); 3 tejido conjuntivo.250 ×.

Fig. 1-3 Tinción tricrómica de Masson. Semejante a la colo-ración con azán (azocarmín + azul de anilina). Fibras colá-genas del tejido conjuntivo (1) en azul oscuro; componen-tes celulares en diversos tonos de rojo. Glándulas cutáneasde una antílope (Aepyceros melampus): 2 glándulas odorífe-ras (apocrinas); 3 glándulas sebáceas (holocrinas). 250 ×.

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Cuadro 1-2 Tinciones histológicas. (De [1])

Tinción rojo violeta. El ácido peryódico forma grupos aldehído en el glucógeno y en los componentessacáridos de las glucoproteínas. El reactivo de Schiff los tiñe de rojo violeta.

Tinción azul. Diversos componentes con carga eléctrica negativa (polianiones), p. ej., moco sulfata-do, glucosaminoglucanos, hialuronano.

Según el colorante, p. ej., naranja-rojo o pardo. Lípidos, p. ej., triacilgliceroles o lípidos de las vainasde mielina.

Tinción púrpura. El HCl forma grupos aldehído en la desoxirribosa, la pentosa del DNA. Los gruposaldehído reaccionan con el reactivo de Schiff, el cual tiñe selectivamente de púrpura la cromatinaque contiene DNA.

Tinción azul. El azul de toluidina, un colorante básico, se une selectivamente a los grupos fosfato decarga negativa del DNA y del RNA. En consecuencia, se tiñen la cromatina (DNA), el nucléolo y losribosomas (RNA).

Tinción

H-E(hematoxilina-eosina)

Azán(azocarmín/azul deanilina/naranja G)

Para elastina(resorcina-fucsina u orceína)

van Gieson(hematoxilina férrica/ácido pícri-co/fucsina ácida)

Tricrómica de Goldner(hematoxilina férrica/azofloxi-na/verde luz)

EH(hematoxilina férrica) deHeidenhain (particularmente aptapara la identificación de algunasestructuras celulares así como delas estriaciones transversalesmusculares)

Tinciones histoquímicas

Reacción del PAS

Azul alciano

Tinciones para lípidos(p.ej., Sudán III; Sudán negro;aceite rojo O)

Tinción de Feulgen para DNA

Azul de toluidina(basofilia selectiva)

Núcleos

Azul violeta

Rojo brillante

−

Azul negro

Pardo negro

Heterocromatina ynucléolo azul negro

Citoplasma

Rojo; regiones conabundancia de riboso-mas y RER azul violeta

Rosa pálido a azultenue

−

Amarillo a parduscoclaro

Rojo ladrillo

Algunos componentes,p. ej., centríolos, cino-cilios y haces de fila-mentos intermedios,aparecen de colornegro profundo

Fibras colágenas

Rojo

Azul

−

Rojo

Verde

Sin tinción especial ogris amarillento

Fibras elásticas

Sin tinción o rosa

Sin tinción (sólo siestán presentes engrandes cantidades,como en las membranaselásticas o los ligamen-tos elásticos: rojo a azulrojizo)

Negro violeta (resorcina-fucsina); rojo pardo(orceína)

Sin tinción especial(sólo si están presentesen aglomeraciones grue-sas, como en las mem-branas elásticas o losligamentos elásticos:amarillo)

A menudo sin tinciónespecial (en parte, ver-doso a rojo claro)

Gris tenue

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Fig. 1-4 Tinción de Goldner, coloración tricrómica de usocorriente que tiñe las fibras colágenas del tejido conjun-tivo (1) de verde turquesa y las porciones celulares de rojovioleta a rojo pardo. Duodeno de un gato: 2 mucosa; 3glándulas de Brunner en la submucosa. 200 ×.

Fig. 1-6 Tinción con PAS (ácido peryódico-reactivo deSchiff), identificación de moco y glucoproteínas neutras,así como glucógeno. Aquí el moco de las células mucosasde la glándula submandibular (humana) está teñido depúrpura intenso; otras estructuras poseedoras de gluco-proteínas, entre ellas las membranas basales, aparecenmás tenues. Coloración de contraste de los núcleos celu-lares con hemalumbre (tono semejante al de la hematoxi-lina). 200 ×.

Fig. 1-7 Determinación inmunohistoquímica de la cito-queratina 19 (CK19), un componente del citoesqueleto,en un bronquio pequeño humano. Sólo una parte de lascélulas epiteliales exhibe una reacción positiva (colora-ción parda); en su mayoría se trata de células basales océlulas en crecimiento. 250 ×.

Fig. 1-5 Tinción para elastina (resorcina-fucsina), detec-ción selectiva de membranas y fibras elásticas (→).Arteria muscular humana: 1 luz vascular; 2 membranaelástica interna, compuesta por una lámina elástica grue-sa de trayecto ondulado; 3 túnica media; 4 túnica adven-ticia. 400 ×.

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En la hibridación in situ pueden localizarse ácidosnucleicos en el corte histológico mediante sondascomplementarias (oligonucleótidos de DNA o RNAmarcados radiactivamente o no radiactivamente).Con la hibridación in situ pueden demostrarse en elcorte secuencias de DNA o RNA específicas. Elmétodo también puede aplicarse en cromosomas, enextendidos celulares o en preparados de cuerpo ente-ro de animales pequeños.

1.3.4 ArtefactosPor razones diversas (p. ej., mala fijación, solucio-

nes colorantes viejas, mellas en la cuchilla del micró-tomo) pueden aparecer alteraciones en los preparadoshistológicos (figs. 1-8 y 1-9) que son de causa pura-mente técnica y reciben el nombre de artefactos. Elconocimiento de estos artefactos es muy importanteen el examen de un preparado.

1.3.5 Preparados de tejidos ivosCon el microscopio también pueden estudiarse

células y tejidos vivos, lo que lamentablemente por

falta de tiempo casi nunca es posible en los cursos dehistología. En la investigación la microscopia de células vivas, por ejemplo en cultivos celulares, haexperimentado una gran expansión, sobre todo por-que se desarrollaron procedimientos microscópicosespeciales, como la microscopia de contraste de fasey la microscopia de interferencia, que intensifican elcontraste de las estructuras celulares vivas (fig. 1-10).En el microscopio de luz transmitida corriente estecontraste es muy débil pero con el uso de sustanciascoloreadas o marcadas con colorantes fluorescenteses posible, entre otras cosas, seguir la dinámica de losprocesos de endocitosis o la reestructuración de lasprolongaciones celulares. Las variantes de la micros-copia vital son, por ejemplo, la aplicación de la luzultravioleta, la microscopia de polarización y lamicroscopia de campo oscuro.

1.4 Técnicas especiales de lamicroscopia electrónica

1.4.1 Microscopia electrónica de transmisión

En la microscopia electrónica de transmisión senecesitan procedimientos de fijación particularmentecuidadosos para obtener una imagen lo más fiel posi-ble al original de la estructura de las células vivas. Eltejido debe colocarse rápidamente en la solución fija-dora, en lo posible de inmediato o al menos a lospocos minutos de la extracción o la muerte. Si se tra-baja con animales de experimentación, lo óptimo esla fijación por perfusión del animal anestesiado. Lasolución fijadora es el glutaraldehído amortiguado ya la fijación le sigue una posfijación con tetróxido deosmio. El metal pesado osmio se une a los lípidos yaumenta, por ejemplo, el contraste de las membranasbiológicas. La inclusión se realiza en resinas sintéti-

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Fig. 1-8 Hendidura por retracción (*) entre la base delepitelio y el zócalo de tejido conjuntivo de las vellosida-des intestinales, el denominado espacio de Grünhagen(yeyuno, humano). Azán; 270 ×.

Fig. 1-9 Defecto de corte. Pequeños desgarros del tejido(válvula aórtica humana) producidos por una mella en lacuchilla del micrótomo. Resorcina-fucsina; 100 ×. (De [1])

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cas como Araldita o Epon. Con ultramicrótomos serealizan cortes de 30 a 80 nm de espesor. Estos cor-tes son tan finos que las estructuras celulares quecontienen deben contrastarse (“teñirse”) (fig. 1-11)con acetato de uranilo, citrato de plomo y en ciertoscasos ácido fosfotúngstico.

En la investigación experimental pueden utilizar-se sustancias acopladas a metales (oro, hierro,cobre). Los metales en los preparados para lamicroscopia electrónica de transmisión tienen ungran contraste y, en consecuencia, se identificanbien. Así, por ejemplo, en una serie de investiga-ción temporal se puede seguir el trayecto de uncomponente invisible en sí mismo, como una glu-coproteína, desde su captación en la célula hasta sudegradación. Además, pueden localizarse compo-nentes moleculares definidos en forma precisa conla ayuda de métodos diversos, por ejemplo proteo-glucanos o glucosaminoglucanos.

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Fig. 1-11 Ultraestructuracelular en el microscopioelectrónico de transmi-sión. Célula epitelial delhígado de la rata con unnúcleo grande (1) y losorgánulos típicos. 2 retícu-lo endoplasmático rugoso;3 retículo endoplasmáticoliso; 4 aparato de Golgi; 5mitocondrias; 6 lisosomas.Estas células contienenmucho glucógeno (7) enforma de inclusiones. En lasuperficie que forma loscanalículos biliares (8) lacélula exhibe microvellosi-dades. → Nucléolo. 12.000 ×.

Fig. 1-10 Fibroblastos vivos en un cultivo celular, micros-copia de contraste de fase. Además del núcleo, algunosorgánulos granulares y el límite celular general, los deta-lles de la estructura de estas células apenas pueden dis-tinguirse. 450 ×.

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En la inmunoelectromicroscopia es posibledemostrar in situ en el microscopio electrónico detransmisión sustancias marcadas con oro.

En un procedimiento especial, la generación decontraste negativo, pueden ponerse sobre una pelí-cula transparente finísima partículas celulares, bacte-rias o virus. Los objetos se rodean de precipitados demetales pesados, con lo cual aparecen claros en unentorno oscuro.

En el método de la criofractura las superficiesliberadas de pequeñas muestras hísticas congeladas amuy baja temperatura se cubren con una películametálica finísima. La réplica obtenida de ese modo seobserva con el microscopio electrónico de transmi-sión (véanse pp. 20, 32, 34 y 38). Las membranascelulares se parten a lo largo de su centro hidrófobo,de modo que las caras interiores de las hojuelasexterna e interna de la membrana quedan libres ypueden analizarse.

1.4.2 Microscopia electrónica de barridoLa microscopia electrónica de barrido tiene su

fundamento en principios propios y permite el análi-sis de superficies celulares y epiteliales genuinas (fig. 1-12).

1.5 Interpretación de los cortes histológicos

Para poder realizar una evaluación más crítica delmensaje y las conclusiones de los cortes histológicos

siempre hay que tener en cuenta una serie de verda-des simples:■ El corte histológico provee sólo una instantánea,

producto del proceso de fijación, de un todo vivoen cambio continuo.

■ La gran mayoría de los cortes representan sólouna rodaja finísima de una parte casi siemprepequeña de un órgano tal vez muy grande, porejemplo, el hígado. La no homogeneidad en ladistribución de ciertas estructuras puede hacer aque no siempre se las encuentre en cada corte.

■ El corte histológico genera una imagen bidimen-sional plana de las células y los tejidos siempretridimensionales, de cuyo volumen es posibledarse una idea sólo con la implementación de téc-nicas determinadas (p. ej., el uso de cortes grue-sos), en este caso mediante el denominado tran-senfoque de los cortes.

No obstante, las conclusiones inmediatas sobre laforma real de los elementos estructurales de las célu-las y los tejidos o de formaciones organizadas supe-riores en el corte individual sólo son posibles encasos excepcionales y sólo puede extraérselas conprecaución. Algunos ejemplos simples aclaran esto(fig. 1-13). Para facilitar la comprensión se represen-tan los cortes en los planos diferentes de objetos bienconocidos. Por ejemplo, si un huevo cocido (duro) secorta en sentido transversal en la región de uno de susdos polos o se le practica un corte longitudinal muyperiférico en ninguno de esos cortes estará contenidala yema central, lo cual no niega su existencia.Asimismo, los cortes longitudinales o transversalesde un tubo recto o curvo dan como resultado imáge-

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Fig. 1-12 Microfotografíaelectrónica de barridode polen de avellano.1.700 ×.

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nes muy diferentes según dónde y cómo se incida eltubo. Cabe esperar imágenes de corte muy similarescuando se trata de tubos biológicos, por ejemplo, losvasos sanguíneos o los túbulos renales. Incluso unanaranja, que en forma aproximada es comparable conlas porciones secretoras (ácinos) de las glándulas, aligual que estas da imágenes diferentes según la orien-tación del corte.

Las siluetas circulares, exactamente igual en ladimensión microscópica óptica que en la electrónica,pueden derivar, por ejemplo, de cortes transversalesde cilindros, esferas, elipsoides o conos. Si todas lassiluetas de un preparado son del mismo tamaño, estohablaría antes que nada de la existencia de cilindrosparalelos del mismo diámetro, dado que es improba-ble que las otras formaciones posibles, por ejemploesferas o conos, se hayan seccionado en el mismositio de su contorno.

Desde hace mucho que la aparición de dos cortesnucleares en una célula no es una demostración debinuclearidad sino que casi siempre tiene su origenen un núcleo contorneado que el corte interesa dosveces.

1.6 Reglas básicas para el diagnóstico

Para identificar con seguridad un preparado histoló-gico desconocido y poder realizar su diagnóstico

diferencial hay que tener en cuenta algunas reglasbásicas:

■ El preparado siempre tiene que observarse prime-ro a simple vista, dado que ciertos órganos yapueden diagnosticarse con un alto grado de pro-babilidad por la orientación típica del corte, porejemplo un corte sagital de la hipófisis, un cortetransversal de la suprarrenal o un corte longitudi-nal del intestino delgado.

■ A continuación el preparado se mira con el obje-tivo más débil del microscopio. Se buscan princi-pios organizativos concretos: ¿hay una zonainterna y una zona externa (correspondientes amédula y corteza)? ¿Se encuentra una superficienatural (cubierta por epitelio) o una cápsula?¿Hay regiones con propiedades tintoriales com-pletamente diferentes? ¿Aparece alguna luz?¿Hay elevaciones regulares de la superficie, porejemplo, pliegues?

■ Se realiza el examen minucioso de todo elcorte con el objetivo más débil, es decir que tie-nen que haberse visto todos sus bordes librespues sólo entonces puede resolverse con seguri-dad una de las cuestiones más importantes parael diagnóstico diferencial, a saber: ¿hay algúnepitelio en algún sitio del preparado? En casoafirmativo, primero se diagnostica con preci-sión el epitelio, dado que de allí ya surge unadirección determinada en la meta del diagnósti-co diferencial.

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Fig. 1-13 Interpretación de las imágenes de los cortes.Los cortes transversal y longitudinal de un tubo curvo (a)o recto (b), de un huevo de gallina (c) o de una naranja(d) pueden permitir −tomados por sí solos− la deduccióntanto de la forma espacial como de la composición de cadauna de las imágenes en cuestión. (De [6])

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Esto se aclara con un ejemplo: si se encuentra un“epitelio simple cilíndrico” teóricamente habría quepensar en un corte de una parte del tubo digestivo ode la trompa uterina o del útero. Para corroborar elprimero de estos dos diagnósticos presuntivos sebusca la organización en capas típica del tubo diges-tivo y con la identificación de esta puede establecer-se con seguridad que el preparado es del tubo gastrointestinal. En cambio, si falta esta estructuraestratificada típica es cierto el segundo de los dosdiagnósticos presuntivos. Para confirmarlo, en el epi-telio se buscan los posibles cinocilios −característicosde la trompa uterina y de la mucosa del útero endeterminadas fases del ciclo−. Así se relaciona elresto de los elementos estructurales del corte, porejemplo, pliegues muy ramificados (trompa uterina)y la invaginación del epitelio para formar túbulosglandulares (mucosa uterina). Si no hay cinocilios niglándulas tubulares pero en la superficie aparecenpliegues delgados cubiertos de epitelio simple cilín-drico debe considerarse el diagnóstico diferencial devesícula biliar.

El diagnóstico de un preparado histológico a menu-do puede realizarse con el aumento menor y comomucho con un aumento mediano. Un ejemplo tam-bién lo aclara: en el diagnóstico diferencial de lasglándulas serosas debe incluirse en las consideracio-nes el páncreas. Sin embargo, como los islotes deLangerhans, otras veces tan confiables como criteriodiagnóstico diferencial, son poco frecuentes en laregión de la cabeza y en el proceso unciforme delpáncreas y en algunos cortes faltan por completo, hayque pensar en la existencia abundante en los sereshumanos de las denominadas células centroacinosascomo buena característica diferencial frente a todo el

resto de las glándulas serosas. No obstante, en lamayoría de los casos la identificación de estas célulascomo tales (para lo que se necesita una resoluciónrelativamente alta y también algo de experiencia) lesresulta más difícil a los principiantes que distinguirun criterio diagnóstico diferencial simple, a saber, laausencia total de conductos estriados en el páncreas.Sin embargo, con el uso de aumentos grandes, acausa de que el sector examinado es demasiadopequeño, esto con frecuencia pasa inadvertido ypuede realizarse un diagnóstico incorrecto del prepa-rado.

Reglas básicas para el diagnóstico de un preparadohistológico:■ Primero mírese el preparado a simple vista y

determínese si es de un órgano macizo o hueco y si los bordes del corte son artificiales (rectos) ocorresponden a superficie naturales.

■ Luego mírese en el microscopio con el aumentomenor y determínese si hay una organizacióndefinida, por ejemplo, en corteza/médula, enlobulillos o configuraciones luminales determina-das y qué epitelios se encuentran en las superfi-cies naturales.

■ Examínese minuciosamente todo el corte con losaumentos menor y mediano. Procédase a un diag-nóstico hístico específico cuidadoso y a la identi-ficación de los cortes tangenciales y de los arte-factos.

■ Sólo utilícese gran aumento para los detalles celu-lares, por ejemplo, para la diferenciación entrecinocilios y borde en cepillo.

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