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8. CINÉTICA 8. CINÉTICA MICROBIANA MICROBIANA

8.1. Cuantificación de 8.1. Cuantificación de microorganismosmicroorganismos

El crecimiento de una población microbiana se mide a través de:

Crecimiento microbianoCrecimiento microbiano: incremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos en el

número de células o en la masa celular

Peso seco: filtración, centrifugaciónTurbidez: DO de una suspensión de células

Cuenta directa: microscopioCuenta en placa: solo células viablesMétodos

directos

Métodos indirectos

Consumo de sustratos azúcares

Formación de productos CH4, etanol

Métodos cinéticos Respirometría (O2/CO2)

Componentes celulares ác. nucleicos, proteínas, lípidos, ATP

Actividades enzimáticas deshidrogenasa

Número de células

Masa celular

La selección de un método para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de:

Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos)

Propiedades del medio de cultivo

Sensibilidad requerida

Confianza del método

Velocidad necesaria

Cuantificación del crecimientoCuantificación del crecimiento

Masa celular número de células se puede estimar uno para

conocer el otro

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Petroff-Hausser

MuestraRejilla con 25

cuadros grandes

Cálculo de no. de células/no. de células/mLmL: Conteo de células en el microscopio

X células x 25 cuadros x 50 x 103 x FD*[=] número/cm3 (1 cm3 = 1 mL)

Cámaras de recuentoCámaras de recuento

Neubauer

X células x 25 cuadros x 104 x FD*[=] número/cm3

Cálculo de no. de células/no. de células/mLmL:

1 mm

**FD = Vol. total Vol. muestra

Métodos directos: número de células

Ventajas:

Conteo rápido de microorganismos

Limitaciones:

No se distinguen las células muertas de las vivas

Difícil contar células pequeñas

Se requiere tiempo y habilidad

Se requiere un microscopio de contraste de fases si las células no están teñidas

No es buen método para suspensiones muy diluidas (< 106

células/mL)

Cámaras de recuentoCámaras de recuentoMétodos directos: número de células

FundamentoFundamento: cada célula viable forma una colonia UFCUFC: se cuantifica el número de células a través del conteo de coloniascolonias

VentajaVentaja: solo se cuentan las células viables células viables las que pueden reproducirse (dividirse)

Dos técnicas (medios sólidos):

Siembra en superficieSiembra en superficie ≤ 0.1 mL de muestra sobre la superficie del medio

Vertido en placaVertido en placa 0.1 - 1.0 mL de muestra en la caja, se vierte el medio fundido (~45°C) y se homogeneiza

Cuenta Cuenta en placaen placa

Colonias superficiales

Colonias superficialesColonias sub-superficiales

Métodos directos: número de células

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Muestra a contar

de caldo

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Incontable

En los métodos de conteo en placa, el número de colonias:

No debe ser muy alto para poder contarlas

No debe ser muy bajo para que tenga significado estadístico

Normalmente no se conoce el número de microorganismos viables dilucionesdilucionesusualmente seriadasseriadas

Cuenta en placa: diluciones seriadasCuenta en placa: diluciones seriadasMétodos directos: número de células

No. colonias 30 30 -- 300300

TurbidimetríaTurbidimetríaMétodo más rápido y útil (espectrofotómetro)

Turbidez en una suspensión celular las células dispersan la luz se cuantifica la luz transmitida

No. de células DO (turbidez) número de células turbidez (DO)

DesventajaDesventaja: problemas asociados al medio de cultivo y a la presencia de partículas

Métodos directos: masa celular

GravimetríaGravimetríaSe cuantifica el peso seco de una muestra

Filtración (< 0.2 μm) de la suspensión de BM secado peso BM

Centrifugación secado peso del precipitado

DesventajaDesventaja: incluye microorganismos muertos, materia orgánica, polímeros extracelulares


6.1. Curva de crecimiento 6.1. Curva de crecimiento (lote y continuo)(lote y continuo)

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Fases de crecimientoFases de crecimientoExp Estacionaria Muerte

Tiempo

Cre

cim

ient

o

Cultivo en lote o “batch”

Lote (Lote (batchbatch)): el medio NO se renuevaNO se renueva crecimiento en un volumen fijo que se altera continuamente por el crecimiento microbiano

ContinuoContinuo: el medio se renuevase renueva constantemente número de células y estado metabólico constantesconstantes estado de equilibrioestado de equilibrio

CrecimientoCrecimiento: incremento ordenado de todos los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de

individuos o en la masa celular

Fases de crecimiento

Exp Estacionaria Muerte

Tiempo

Crec

imie

nto



Tiempo

Crec

imie

nto

Inoculo muy activo fase de crecimiento Exp

Medio de crecimiento de inoculo parecido al medio de prod.

Fases de crecimiento (lote)Fases de crecimiento (lote)AdaptaciónAdaptación o latencialatencia: fase LagLag

Los microorg. se adaptan a las nuevas condiciones se prepararanprepararan para reproducirse

Esta fase se puede reducir/evitar:

ExponencialExponencial: fase ExpExp

Condiciones óptimas para el crecimiento los microorg. crecencrecen y se multiplicanmultiplican aumento logarítmico

Tasa de crecimiento máximamáxima y tiempo de duplicación (td) mínimomínimo

dx/dt = mx

Fase de muertemuerteGeneralmente también es logarítmica, pero más lenta que el crecimiento Exp

Tasa de Tasa de muertemuerte > tasa de > tasa de crecimientocrecimiento

Fase estacionariaestacionariaEl cultivo está limitado por nutrientes y/o por acumulación de productos

Tasa Tasa de de crecimientocrecimiento == Tasa de Tasa de muertemuerte dx/dt = 0

dx/dt = -kx

Fases de crecimiento (lote)Fases de crecimiento (lote)Fases de crecimiento


Tiempo

Crec

imie

nto



Tiempo

Crec

imie

nto

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Medio fresco

Aire/gas estéril

Regulador de flujo

Espacio con aireReactor

Cultivo

Efluyentecon células

Cultivo continuoCultivo continuo

QuimiostatoQuimiostato: tipo más común de cultivo continuocontinuo controla la densidad de población y la tasa de crecimiento. Permite mantener la población en fase Exp por largos periodos

Elementos para su control:

Tasa Tasa de diluciónde dilución adición de medio fresco a flujo constante controla la tasa de tasa de crecimientocrecimiento

Nutriente limitanteNutriente limitante nutriente (C/N) en cantidad limitada controla densidad celulardensidad celular (células/mL)


6.3. 6.3. Tiempo de duplicación Tiempo de duplicación ((ttdd))

CrecimientoCrecimiento: incrementoincremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de número de célulascélulas o en la masa celular masa celular

Tasa de crecimientoTasa de crecimiento: cambiocambio en el número de células o masa celular por unidad por unidad de tiempotiempo

Tiempo de duplicación (Tiempo de duplicación (ttdd)): tiempo necesario para que a partir de una célulauna célula se formen dosdos (para que se dupliqueduplique)

Número de generaciones (Número de generaciones (nn)): número de divisiones celulares en un determinado tiempo = generacionesgeneraciones

DefinicionesDefiniciones

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Durante la fase exponencialfase exponencial incrementoincremento de la población en el que el númeronúmero de célulascélulas se duplicaduplica cada cierto tiempotiempo

Tiempo (h)

No. células

00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0…

10.0

1248

1632 64

128256512

1,024 …

1,048,576

Crecimiento exponencialCrecimiento exponencial

td = tiempo de duplicación

1 21 22 23 24 ... 2n

2

2x2x2

td

td2x2

td1

Si td es constante el crecimiento es exponencialexponencial

td td td td td td

Representando lo anterior en forma gráfica:

x = x0 2n

x = número o masa de individuostd = tiempo de duplicaciónn = no. de divisiones celulares en

un tiempo = generaciones

td td td td1 2 2x2 24 ... 2n

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

0 2 4 6 8

Tiempo (h)

x (N

o. d

e cé

lula

s)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

0 2 4 6 8

Tiempo (h)

ln (x

)

m = 0.693/td

Para obtener información de la tasa de crecimiento gráficas semi-logarítmicas línea recta:

Fácil uso puede estimarse td a partir de resultados experimentales

Tiempo de duplicaciónTiempo de duplicaciónEl número de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por:

Donde:n = número de generacionest = tiempo de la fase Exptd = tiempo de duplicación

La concentración de biomasa después de un tiempo de crecimiento Exp puede cuantificarse, en función de la biomasa inicial:

n = t/td

x = x0 2n Donde:x = número final de célulasx0 = número inicial de células

x = x0 2t/td

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Con base en la Ec. (3), si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos calcular el número de generaciones (nn) y el tiempo de duplicación (ttdd) para expresar la Ec. (3) en términos de nn:

x/x0 = 2t/td

ln (x/x0) = ln2 (t/td)

ln (x/x0) = 0.693 (t/td)

ln x =0.693 t

+ ln x0 ln x – ln x0 =

0.693td t td

t/td = n =ln x – ln x0

0.693

Ec. de una línea recta

Tiempo de duplicaciónTiempo de duplicación

Con n expresado en términos de parámetros cuantificables (x y x0), puede calcularse el tiempo de duplicación (td). P. ej.:

Calcula el td de un cultivo, considerando que:

x0 = 5 x 107 células

x = 5 x 108 células

t = 6 ht/td = n =

ln x – ln x0

0.693

t/td =20.0 – 17.7

0.693

t/td = 3.3 td = t/3.3 td = 6/3.3 = 1.8 h

Ejemplo 1: Ejemplo 1: ttdd

Ejemplo 2: Ejemplo 2: ttddDe una tabla de datos: no. de células no. de células vs. tiempotiempo

Podemos calcular td de una gráfica semi-logarítmica durante la fase Exp

Donde la pendiente (m) = 0.693/td = 1.3861.386

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10

Tiempo (h)

ln (x

)

m = 0.693/td

ln x =0.693 t

+ ln x0td

y = mx + b

t(h)

x (células) ln x

0 1 0.00.5 2 0.71.0 4 1.41.5 8 2.12.0 16 2.82.5 32 3.53.0 64 4.23.5 128 4.94.0 256 5.54.5 512 6.25.0 1024 6.95.5 2048 7.66.0 4096 8.36.5 8192 9.07.0 16384 9.7

m = 1.386 = 0.693/td td = 0.5 h

Entonces, para calcular td:

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Tasa específica de Tasa específica de crecimiento (crecimiento (mm))

mm = pendiente entre 2 puntos el no. de células promediocélulas promedio en esos 2 puntos

t (h) x (células)0 1

0.5 21.0 41.5 8

m =4 - 2 (células)

= 4 células

1.0 - 0.5 (h) h

(2 + 4)/2 = 3 células

=4 (células/h)

3 célulasm = 1.33 h-1 0

50

100

150

200

250

0 1 2 3 4 5

Tiempo (h)

x (N

o. d

e cé

lula

s)

Pendiente:

No. células promedio:

m

Fase Exp

mm tasatasa (velocidadvelocidad) a la cual una población microbiana se duplicaduplica en un tiempotiempo determinado (fase fase ExpExp)

En una gráfica aritmética de x vs. tiempo:

De acuerdo con lo anterior:

m =Dx 1

=1 dx

Dt x x dt

dx= m dt

x

ln x - ln x0 = m t

lnx

= m tx0

m =0.693

td

dx = x0 xdt = t0 t

si integramos:

Despejando dx/x:

x = x0 emt

t tiempo que dura la fase Exp

Y, con base en el crecimiento Exp:

y = m m x + b

ln x =0.6930.693 t

+ ln x0ttdd La pendiente (m) = m

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