7. modulua: Saiakuntza Bioteknologikoak · Biomolekula organiko nagusiak (gluzidoak, lipidoak,...

1 UDX. Texto personalizado

ANALISIKO ETA KALITATE KONTROLEKO LABORATEGIKO GOI MAILAKO TEKNIKARIA

7. modulua: Saiakuntza Bioteknologikoak

PROGRAMACIÓN DE LOS CICLOS FORMATIVOS DE FORMACIÓN PROFESIONAL

LANBIDE HEZIKETAKO ZIKLOEN

PROGRAMAZIOA

KIMIKA


ANALISIKO ETA KALITATE KONTROLEKO LABORATEGIKO GOI MAILAKO TEKNIKARIA

7. modulua: Saiakuntza Bioteknologikoak

PROGRAMACIÓN DE LOS CICLOS FORMATIVOS DE FORMACIÓN PROFESIONAL

LANBIDE HEZIKETAKO ZIKLOEN

PROGRAMAZIOA

KIMIKA


Argitalpena: 1.a, 2010eko abendua © Euskal Autonomia Erkidegoko Administrazioa Hezkuntza, Unibertsitate eta Ikerketa Saila Egilea: Eduardo Ochoa de Aspuru Gutiérrez Edizioa eta koordinazioa: Víctor Marijuán Marijuán KUALIFIKAZIOEN ETA LANBIDE HEZIKETAREN EUSKAL INSTITUTUA INSTITUTO VASCO DE CUALIFICACIONES Y FORMACIÓN PROFESIONAL www.kei-ivac.com Diseinua eta maketazioa: TRESDETRES Lege-gordailua: BI-2514/2010


Esku artean duzun argitalpen hau lanean ari diren lankideek landu dute. Edozein gairen programazioa oso lan pertsonala da, irakasle bakoitzaren esperientzian oinarritua eta, horrenbestez, subjektiboa. Premisa hori kontuan izanik, programazioa aztertzera eta egoki baderitzozu kontsultarako material gisa erabiltzera gonbidatzen zaitugu. Zure irakasle-lana bideratu dezakeen gida gisa ere baliagarria izan dakizuke. Izan ditzakeen mugak aintzat hartu badira ere, heziketa-ziklo berrien OCDak abiapuntu izanik sortu eta diseinatu da, eta EAEn curriculum-diseinuaren eta irakaskuntza-programazioaren arloan indarrean dagoen legeria hartu da kontuan (otsailaren 26ko 32/2008 Dekretua). Erabilgarria izan dakizun espero dugu, eta, aldi berean, egileek lan honetan egindako ahalegina eskertzen dugu.

AURKIBIDEA

UNITATE DIDAKTIKOEN SEKUENTZIAZIOA ETA DENBORALIZAZIOA or.

0. unitate didaktikoa:

0 Moduluaren aurkezpena 6 or.


1 Biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuen ezaugarri orokorrak aztertzea. 9 or.


2 Proteinak erauztea, elektroforesi bidez bereiztea eta identifikazio immunologikoa. 14 or.


3 Animalia-, landare- eta bakterio-jatorriko azido nukleikoak erauztea eta araztea. 23 or.


4 DNA birkonbinatuaren teknologia: murrizte-entzimak. Bektoreak. Transformazioa eta detekzioa. 37 or.


5 DNA polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidez klonatzea eta elektroforesi bidez bereiztea. 46 or.


6 Azido nukleikoak sekuentziatzea eta tresna bioinformatikoak maneiatzea. 54 or.


7 Landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxikoak eta mutagenoak ezaugarritzea. 66 or.


8 Mikroorganismoak metodo molekular, serologiko eta immunologikoen bidez identifikatzea. 77 or.

Orduak: 120 Unitate kopurua: 8

5

KIMIKA

Heziketa-zikloa: ANALISIKO ETA KALITATE KONTROLEKO LABORATEGIA 7. modulua: SAIAKUNTZA BIOTEKNOLOGIKOAK

Unitate didaktikoen sekuentziazioa eta denboralizazioa

EDUKI MULTZOAK

M1 M2 M3 M4 M5 UNITATE DIDAKTIKO SEKUENTZIATUAK IRAUPENA

UD0: Moduluaren aurkezpena. 1 h

X X X X X UD1: Biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuen ezaugarri orokorrak aztertzea. 12 h

X X X X UD2: Proteinak erauztea, elektroforesi bidez bereiztea eta identifikazio immunologikoa. 18 h

X X X UD3: Animalia-, landare- eta bakterio-jatorriko azido nukleikoak erauztea eta araztea. 15 h

X X UD4: DNA birkonbinatuaren teknologia: murrizte-entzimak. Bektoreak. Transformazioa eta detekzioa. 18 h

X X UD5: DNA polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidez klonatzea eta elektroforesi bidez bereiztea. 14 h

X X UD6: Azido nukleikoak sekuentziatzea eta tresna bioinformatikoak maneiatzea. 12 h

X X UD7: Landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxikoak eta mutagenoak ezaugarritzea. 12 h

X X X UD8: Mikroorganismoak metodo molekular, serologiko eta immunologikoen bidez identifikatzea. 18 h

GUZTIRA 120 ordu

1. multzoa: Proteinak eta azido nukleikoak erauztea. 2. multzoa: Proteinak identifikatzea, sekuentziatzea eta analizatzea.

3. multzoa: Mikroorganismoak identifikatzea.

4. multzoa: DNA birkonbinatuaren teknologia. Klonazioa. 5. multzoa: Agente toxikoak eta mutagenoak ezaugarritzea.

6

UD0: MODULUAREN AURKEZPENA

KIMIKA


0. unitate didaktikoa: MODULUAREN AURKEZPENA Iraupena: 1 ordu

Ikaskuntzaren helburuak:

1. Moduluaren garapenaren plangintza orokorra ezagutzea, baita taldeko kideak ere. 2. Irakasleak prestakuntza-prozesuaren kudeaketan aintzat hartu eta aplikatuko dituen irizpideak ulertzea. 3. Ikasleak moduluari dagokionez dituen eskubideak eta betebeharrak identifikatzea. 4. Moduluaren unitate didaktikoen arteko eta moduluaren eta beste moduluen arteko lotura nagusiak ulertzea. 5. Norberaren jakintzak identifikatzea, moduluan lortu behar diren jakintzei dagokienez.

Multzoak

EDUKIAK 1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Zikloko moduluen arteko eta zikloaren eta erreferente dituen kualifikazioen arteko loturak aztertzea. • Diziplinaren, metodologiaren, erlazioen eta antzeko beste gaien inguruan planteatzen diren alderdiak, arauak eta elementuak

identifikatzea, eta euskarri egokian erregistratzea.

KONTZEPTUZKOAK

• Zikloa osatzen duten kualifikazioak eta moduluarekiko lotura. • Moduluaren ekarpena zikloko helburuak lortzeko garaian. • Moduluaren helburuak. • Modulua eta unitate didaktikoak ebaluatzeko irizpideak.

JARRERAZKOAK

• Taldeko kide guztiengan, baita irakaslearengan ere, desiragarriak diren portaeren inguruan adostasuna lortzearen garrantzia

baloratzea. • Moduluaren garapenean jarraitu beharreko arauak eta irizpideak.

7


KIMIKA


JARDUERA METODOLOGIA BALIABIDEAK

NORK ZER egingo dudan edo duten Jarduera mota

Helburu inplikat.

D Ir. Ik.

NOLA egingo den ZERTARAKO egingo den ZEREKIN egingo den

J1 Ikasleen eta irakaslearen aurkezpena.

1 10 min

X X Irakasleak eta ikasleek nork bere burua aurkeztuko dute. Irakasleak iradokiko ditu aurkezpenean interesgarriak izan daitezkeen alderdiak, eta informazio bat edo bestea ematea hautazkoa izango da.

Helburua da hasierako ezagutza lortzea eta gizarte-oztopoak haustea, taldeko kideen arteko komunikazioa erraztearren. Aurreko ikasturtetik sortutako taldea denean, ez da jarduera hau beharrezkoa izango.

Ez da bitarteko berezirik behar.

J2 Programazioa osatzen duten elementuen aurkezpena.

2, 4 10 min X X Irakasleak programazioa osatzen duten elementuak, ordutegiak eta abar aurkeztuko ditu, eta, horretarako, eskema bat erabiliko du edo informatika-baliabideen bidezko aurkezpena egingo du.

Ikasleek moduluaren gaiaren programazioari, egiturari, loturei, denborari eta iraupenei buruzko ikuspegi orokorra jaso beharko dute, besteak beste.

Arbela. PowerPoint-en egindako aurkezpena edo antzekoa. Kronogramak. Informazioa duten fotokopiak.

J3 Prestakuntza-prozesuaren kudeaketa gidatuko duten irizpideen eta arauen aurkezpena.

2, 3 10 min X X Irakatsi eta ikasteko prozesua kudeatzeko erabiliko diren askotariko irizpideak ezagutaraziko ditu irakasleak. Gardenkiez edo beste elementu batzuez lagundutako ahozko azalpena erabiliko du. Hortaz, azterketak zuzentzeko eta ebaluatzeko irizpideak, barne-erregimeneko araudia, diziplina-erantzukizunak, eta abar azalduko ditu.

Zalantza guztiak argitzeko denbora-tartea zabalduko da.

Horrela, ikasleek ikasketa, gizarte eta harremanen arloko esparrua ezagutu eta ulertuko dute, eta arauzko esparru horretara moldatu ahal izango dute haien jarduna.

Ikasgelan edo lantegi-ikasgelan egin daiteke jarduera, eta ez da baliabide berezirik behar.

J4-E1 Egin beharreko lanbide-moduluaren gainean ikasleek aurretik dituzten jakintzen identifikazioa.

5 30 min

X X Jarduera hori elkarrizketaren bidez garatu ahal izango da, baita ikasleek erantzun beharreko irakaslearen galderen bidez, edo, bestela, ondorio horretarako prestatutako galdera irekien bidez edo erantzun anitzeko galderak dituen galdera sorta baten bidez.

Moduluan garatuko diren edukiei dagokienez, ikasleen abiapuntuko jakintza-maila ezagutu nahi da. Abiapuntuko jakintza hori ezagutzeak programazioa berregituratzeko eta taldearen eta gizabanakoen errealitatera egokitzeko aukera emango dio irakasleari.

Galdetegiak.

8


KIMIKA


OHARRAK

• Nahikoa izango da J1 jarduera moduluetakoren batean egitea. Zikloko taldeak adostu beharko du zein modulutan egingo den. • J4 jarduera mantendu ahal izango da, nahiz eta unitate didaktikoetako bakoitzean hasierako ebaluazioa barnean hartzen duen jarduera egin. Bi jarduera horiek bateragarriak eta osagarriak

izango dira beti. Aurretiazko jakintzetarako lehen hurbilketa izan daiteke, ondoren, unitate bakoitzean abiapuntuko jakintza horretan gehiago sakontzeko. • Modulu honen unitate didaktikoetan, jarduerak irakatsi eta ikastekoak (J) edo ebaluaziokoak (E) izan daitezke. Zenbaitetan, jarduera bera, irakatsi eta ikastekoa ez ezik, ebaluaziokoa ere izan

daiteke. Halakoetan, jarduera hori (Jn-Em) gisa adieraziko da eta hiru motak bilduko ditu. J-en zenbakikuntza (n) eta E-ena (m) elkarrekiko independenteak dira. • Modulu honetan, ohi ez bezala, ikaskuntzaren emaitzen kopurua ez dator bat eduki-multzoen kopuruarekin. Hori kontuan hartu beharko da unitate didaktiko bakoitzaren fitxan ezarritako erlazioak

behar bezala interpretatzeko. Erlazio horiek eduki bakoitzean agertzen diren "X" horien bitartez ezartzen dira, horrek adierazten baitu eduki-multzo batekin edo zenbaitekin erlazionatzen den. Ikaskuntzaren emaitzen (IE) eta multzoen arteko erlazioak hauek dira: IE1 1. multzoari dagokio, IE2 4. multzoari, IE3 2. eta 3. multzoei dagokie eta IE4 5. multzoari.

9

KIMIKA


UD1: BIOMOLEKULA NAGUSIEN ETA GENETIKA MOLEKULARRAREN OINARRIZKO PROZESUEN EZAUGARRI OROKORRAK AZTERTZEA

1. unitate didaktikoa: BIOMOLEKULA NAGUSIEN ETA GENETIKA MOLEKULARRAREN OINARRIZKO PROZESUEN EZAUGARRI OROKORRAK AZTERTZEA Iraupena: 12 ordu

IE1: Proteinak eta azido nukleikoak erauzten ditu eta hautatutako teknika laginaren matrizearekin erlazionatzen du. IE2: Azido nukleikoak klonatzen ditu biologia molekularreko prozedurak aplikatuta. IE3: Mikroorganismoak eta proteinak identifikatzen ditu saiakuntza immunologikoak eta genetikoak aplikatuta. IE4: Agente toxikoak eta mutagenoak identifikatzen ditu toxikotasuneko eta mutagenesiko saiakuntzak aplikatuta. Ikaskuntzaren helburuak:

1. Bioteknologiaren egungo kontzeptua definitzea, aurrekari historikoak kontuan hartuta. 2. Bioteknologiaren aplikazio nagusiak bereiztea: gorria, berdea, urdina eta zuria. 3. Biomolekula organiko nagusiak (gluzidoak, lipidoak, proteinak eta azido nukleikoak) haien egitura eta funtzioa oinarri hartuta deskribatzea. 4. Bektore bioteknologiko garrantzitsuenak bereiztea (birusak, bakterioak eta zelula eukariotikoak). 5. Bioteknologian erabili ohi diren mikroorganismoen hazkuntzarako oinarrizko teknikak deskribatzea. 6. Genetika molekularraren oinarrizko prozesuak bereiztea (erreplikazioa, transkripzioa eta itzulpena). 7. Bioteknologiako zelula-egitura garrantzitsuenak sailkatzea (prokariotikoa eta eukariotikoa). 8. Aldez aurretik landutako eta ereindako hazkuntza-inguruneetan mikroorganismoak nola hazten diren behatzea. 9. Material genetikoaren aldakortasunaren oinarriak deskribatzea (mutazioak).

10. Arrisku biologikoaren aurreko prebentzio-jarraibideak identifikatzea. 11. Bioteknologiako laborategiko segurtasunari eta hondakin biosanitarioen kudeaketari aplikatzekoa den erreferentziako araudia kontsultatzea. 12. Asepsia-baldintzak eta sortutako hondakinak manipulatu eta ezabatzekoak identifikatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Prozesu eta produktu bioteknologikoen eguneroko aplikazioak identifikatzea. • Biomolekula organiko nagusiak eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuak definitzeko eta deskribatzeko dokumentu-materialak

lantzea. • DNAren ezaugarriei eta haren informazioaren irakurketari buruzko ariketak egitea. • Landutako materialen emaitzak jendaurrean azaltzea. Akatsak zuzentzea. • Zelula-antolamenduaren forma nagusien desberdintasun estrukturalak eta funtzionalak aztertzea. • Prozesu genetikoen garapenean dituzten inplikazioak identifikatzea. • Agente biologikoen eraginpean jartzearekin lotutako arriskuak aztertzea. • Kultura mikrobiologikoak prestatzea eta kontserbatzea.

X X

X X

X

X X

X

X X

X X

X X X

X X X X X X X

X

X

X

X

10

KIMIKA



• Andui liofilizatuak berriz eratzea eta manipulatzea. • Bioteknologiako laborategian sortutako hondakin biosanitarioak modu egokian kudeatzea.

X

X

X

X

X

KONTZEPTUZKOAK

• Bioteknologiaren egungo kontzeptua eta aplikazio nagusiak. • Biomolekula organiko nagusien (gluzidoak, lipidoak, proteinak eta azido nukleikoak) egitura eta funtzioa. • Genetika molekularraren oinarrizko prozesuak (erreplikazioa, transkripzioa eta itzulpena). • Agente biologikoen eraginpean jartzearekin lotutako arriskuak ebaluatzeko irizpideak (664/1997 Errege Dekretuko Gida Teknikoa, Laneko

Segurtasun eta Higieneko Institutu Nazionalarena). • Hondakin biosanitarioak kudeatzeko irizpideak. • Proteina eta azido nukleikoen datu-base informatizatuak.

X X

X

X

X

X

X X

X

X

X X X

X X

X

X

JARRERAZKOAK

• Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Esleitutako zereginak egiteko prestasuna, inplikazioa, zorroztasuna, autonomia, pazientzia eta ekimena izatea, eta lanak aurreikusitako

epeetan amaitzea. • Ahozko azalpen argia, zehatza eta atsegina, maila zientifiko eta tekniko egokiarekin. • Hazkuntza-inguruneak prestatzeko eta mikroorganismoak ereiteko jardueretan ordena, garbitasuna eta metodoa izatea. • Agente biologikoen eraginpean jartzea dakarten jardueretan ingurumen-segurtasuneko arauak eta laneko osasunekoak betetzea. • Lan-prozedura normalizatuen (LPN) jarraipena egitea eta laborategiko jardunbide egokiak (LJE) betetzea.

X X

X X X X

X X

X X

X X

X X X

X X

X

X X

X X

X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.


E1 Hasierako ebaluazioa.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9

30 min

X X Irakasleak, esparru bioteknologikoari buruzko albiste berri bat laburki aipatu ondoren, behar adina galdera labur egingo dizkie, idatziz, ikasle guztiei.

Ikasleek biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuen ezaugarri orokorrei buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Bioteknologiarekin, genetika molekularrarekin eta horien aplikazioekin zerikusia duten albiste berriak. Galdetegia.

J1 Unitate didaktikoaren aurkezpena.

1, 2, 3, 6, 7

1 h X X Ikasleak bioteknologiari eta horren aplikazio eta erabilerei buruz dituen ideiak adieraziko ditu

Ikasleen aldez aurreko jakintzak ikaskuntzaren edukiekin

Genetika molekularraren oinarrizko prozesuen fluxu-

11

KIMIKA



ideia-jasa baten bidez. Irakasleak unitate didaktikoa (UD) aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.

erlazionatzeko. diagramak. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 1. arrisku-mailako enterobakterio bat ereiteko praktika gidatua.

5, 8, 11, 12

2 h X X Ikasleak, irakaslearen laguntzarekin, hazkuntza-ingurune selektibo eta diferentziala prestatuko du, bertan 1. arrisku-mailako enterobakterio gram-negatibo bat eta laktosa positiboa ereiteko. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak ereitearen emaitzak.

Mikrobiologia bioteknologikoaren esparruko hazkuntza-ingurune ohikoenak deskribatzeko eta bereizteko. Arestian aipatutako hazkuntza-inguruneetariko bat prestatzeko. Andui liofilizatuak oinarri hartuta, bioteknologian erabili ohi diren mikroorganismoak ereiteko eta hazteko oinarrizko teknikak aplikatzeko.

Hazkuntza-ingurune deshidratatua, selektiboa eta diferentziala (esate baterako, MacConkey agarra). Enterobakterio gram-negatiboa eta laktosa positiboa (andui liofilizatua). Balantza. Berokuntza-plaka. Autoklabea. Jario laminarreko kanpaia. Pirex ontzia. Metxeroa. Ereite-uztaiak. Platinozko hariak. Petri plakak.

J3-E3 Biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuen ezaugarri orokorrak azaltzeko/esplikatzeko eta aztertzeko materialak lantzea.

1, 2, 3, 4, 6, 7, 9,

10, 11, 12

5 h X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, eta berak emandako erreferentziako materiala (erreferentzia bibliografikoak, liburuak, Interneteko baliabideak…) eta kanpoan kontsultatutakoa (ikastetxean bertan eta/edo udal-liburutegietan edo unibertsitatekoetan…) abiapuntutzat hartuta, biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko printzipioen

Mikroorganismo talde nagusiak identifikatzeko, bereizteko eta deskribatzeko: bakterioak, algak, onddoak, protozooak eta birusak. Ekosistemetan betetzen dituzten funtzioak deskribatzeko. Laborategiko jardunbide egokien (LJE) printzipioak aplikatzeko.

Madigan, M.T., Martinko, J. M. y Parker, J. 1999. Brock. Biología de los microorganismos, 8ª Edición Revisada. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2005. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición.

12

KIMIKA



ezaugarri orokorrak aztertzeko material idatziak landuko dituzte. Bikote bakoitzak atal bat prestatuko du: lipidoak eta gluzidoak; proteinak, entzimak eta azido nukleikoak; zelula-antolamendua (zelula prokariotikoa eta eukariotikoa); DNA birkonbinatua; azido nukleikoen hibridazioa; polimerasaren kate-erreakzioa (PCR); elektroforesia; bioinformatika; entzimoimmunosaiakuntzako (ELISA) eta immunofluoreszentziako teknikak; mutazioak; arrisku biologikoak eta hondakin biosanitarioak. Irakasleak ikasgelan argituko ditu sortzen diren zalantzak. Ikasle-bikote bakoitzak bere ikerketaren emaitza azalduko du. Irakasleak landutako materiala berrikusiko du eta gero atal guztiak bilduko dituen dokumentu bakar bat prestatuko dute ikasle bakoitzarentzat. Ikasleak dokumentu horri buruzko proba idatzia egingo du.

Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa sustatzeko. Unitate honetan eskuratutako jakintzak hautemateko. Aldez aurreko jakintzen bilakaera ebaluatzeko.

Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un gen? 664/1997 Errege Dekretua, langileak lanean agente biologikoen eraginpean jartzearekin zerikusia duten arriskuen kontra babesteari buruzkoa. Agente biologikoen eraginpean egotearen arriskuak ebaluatzeko eta prebenitzeko gida teknikoa (Laneko Segurtasun eta Higieneko Institutu Nazionala - LSHIN). 2000/54/CE Zuzentaraua, langileak lanean agente biologikoen eraginpean jartzearekin zerikusia duten arriskuen kontra babesteari buruzkoa. 376. prebentzio-ohar teknikoa. Agente biologikoen eraginpean: segurtasuna eta laborategiko jardunbide egokiak (LSHIN). Laborategiko biosegurtasunaren eskuliburua. 3. edizioa. Osasunaren Mundu Erakundea (OME). 2005. Interneteko iturri kontrastatuak. Ikasleek erantzuteko test moduko ariketa-andana.

13

KIMIKA



J4-E4 Bisitaldia: produktuak teknika bioteknologikoak erabilita lortzen dituen kimika-enpresa batera (edo beste produkzio-sektore bateko enpresa batera).

2, 4, 6, 10 3 h X X Ikasleek bisitaldi bat egingo dute bioteknologiaren esparruan lan egiten duen kimika-enpresa batera. "In situ" bisitaldi gidatua izango da, irakasleak eta enpresak aldez aurretik adostutako gidoi bati jarraiki egingo dutena. Ikasleak bisitaldi teknikoaren txostena egingo du, honako hauek adierazita: helburua, garapena, puntu sendoak, ahulak eta hobetzeko arloak. Txosten hori irakasleak zuzenduko du.

Bioteknologia industrialaren aplikazio nagusiak eta prozesu eta produktu garrantzitsuenetako batzuk identifikatzea, kimika-sektoreko ETE baten adibidea oinarri hartuta. Sektore bioteknologikoak Euskal Autonomia Erkidegoan, estatuan, Europan eta munduan duen garrantziaren, dibertsitatearen eta eragin ekonomikoaren adibide gisa erabil daiteke identifikazio hori.

Bioteknologia industrialaren arloan lan egiten duen kimika-enpresa. Osasunaren, farmaziaren, nekazaritzako elikagaien edo energiaren sektoreetako enpresa bioteknologikoren batera ere egin daiteke bisitaldia.

J5 Esperientziak trukatzea (ixteko jarduera).

30 min

X X Irakasleak laburpen moduko gogoeta-jarduera egingo du ikasgelako taldearekin, amaitzeko (funtsezko puntuak eta zalantzak), ikaskuntzak identifikatzeko, orokortzeak egiteko, emaitzak aurkezteko eta irakasteko, eta ikasteko prozesua ebaluatzeko.

Komunikatzeko eta laburpen-lana egiteko. Ikasteko prozesua ebaluatzeko. Unitate didaktikoa ebaluatzeko.

Unitatearen alderdi garrantzitsuenak biltzeko kontzeptuzko mapa. Puntu sendoak, ahulak eta hobetzeko arloak.

OHARRAK

• Kontuan harturik unitate didaktiko honen helburu nagusia biomolekula nagusien eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuen ezaugarri orokorrak aztertzea dela, azalpenetan gehiegi oinarritutako metodologiak saihesteko, mikrobiologiako praktika errazen bat (J2 jarduera) sartu da, baita bioteknologia industrialaren esparruan lan egiten duen enpresa baterako bisitaldia ere (J4 jarduera). Zikloko bigarren kurtsoko ikasleak gai dira hazkuntza-ingurune bat behar bezala prestatzeko eta bertan mikroorganismoak ereiteko eta gero horien hazkundea behatzeko, betiere modulua irakasten duten irakasleen gidaritzapean. Horrela, esparru honetan gehien erabiltzen diren mikroorganismoetariko baten eskutik sartzen da ikaslea bioteknologian: bakterioen eskutik, hain zuzen.

• J3 jardueraren bidez lortu nahi da ikasleek, talde-lanean, beren ikerketa-lana abiapuntutzat hartuta, biomolekula nagusiei eta genetika molekularraren oinarrizko prozesuei buruzko jakintzak garatzea, azaltzea eta eztabaidatzea eta, bide horretatik, irakasleak azalpen gutxiago egitea, ikasleek identifikatzeko/ezaugarritzeko gaitasun indartuagoak lor ditzaten eta beren autonomia eta erantzukizuna susta dadin. Jarduera hau egoki eta probetxuz egiteko ezinbestekoa da parte hartzen duten ikasleek eskola-orduez kanpoko ordu kopuru jakin bat (aldakorra) erabiltzea dokumentatzeko eta material idatziak lantzeko.

• Bai unitate didaktiko honetan eta bai programazioan sartutako gainerakoetan, xehetasun eta zehaztasun handiagoarekin garatu ditugu OCDaren oinarrizko edukiak, betiere kontuan izanik irakasleek helburu eta eduki zehatzagoetan adierazitako OCDan barne hartutako elementu orokorrak ezagut ditzaketela.

• Unean-unean, baliabideen artean argitalpenak, liburuak eta dokumentuak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

14

KIMIKA


UD2: PROTEINAK ERAUZTEA, ELEKTROFORESI BIDEZ BEREIZTEA ETA IDENTIFIKAZIO IMMUNOLOGIKOA

2. unitate didaktikoa: PROTEINAK ERAUZTEA, ELEKTROFORESI BIDEZ BEREIZTEA ETA IDENTIFIKAZIO IMMUNOLOGIKOA Iraupena: 18 ordu

IE1: Proteinak eta azido nukleikoak erauzten ditu eta hautatutako teknika laginaren matrizearekin erlazionatzen du. IE2: Azido nukleikoak klonatzen ditu biologia molekularreko prozedurak aplikatuta. IE3: Mikroorganismoak eta proteinak identifikatzen ditu saiakuntza immunologikoak eta genetikoak aplikatuta. Ikaskuntzaren helburuak:

1. Lagina, materialak eta erreaktiboak erauziko den materialaren arabera prestatzea. 2. Proteinak erauzteko, kuantifikatzeko, bereizteko eta identifikatzeko tresneria kalibratzea eta mantentzea. 3. Zelula hausteko eta proteinak erauzteko prozedurak, dagozkien faseak eta beharrezkoak diren materialak eta erreaktiboak deskribatzea. 4. Zelula barneko proteinak erauztea, aurreko helburuan deskribatutako prozedurak aplikatuta. 5. Erauzitako proteinak gero analizatzeko erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. 6. Proteinak kuantifikatzeko metodo erabilienak deskribatzea, eta bata edo bestea hautatzeko irizpideak adieraztea. 7. Erauzitako proteinak kuantifikatzea, deskribatutako metodoren bat erabilita. 8. Proteinak bereizteko metodo kromatografiko eta elektroforetiko garrantzitsuenak deskribatzea. 9. Kuantifikatutako proteinen SDS-PAGE elektroforesi bat burutzea.

10. Identifikazio immunologikoko teknika nagusiak deskribatzea: immunoblotting edo western blot, ELISA immunosaiakuntza (enzyme-linked immunosorbent assay) eta erradioimmunosaiakuntza (RIA).

11. Proteina-identifikazioak egitea, aurreko helburuan deskribatutako metodoak aplikatuta eta hainbat datu-base maneiatuta. 12. Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. 13. Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

Multzoak

EDUKIAK 1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Proteinak zelula-haustura bidez erauzteko abiapuntuko lagina prestatzea. • Proteinak erauzteko, kuantifikatzeko, bereizteko eta identifikatzeko tresneria kalibratzea eta mantentzea. • Hainbat iturritako proteinak zelula-haustura bidez erauztea. • Erauzitako proteinak erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. • Proteinak kolorimetria eta espektrofotometria bidez kuantifikatzea. • Proteinak teknika kromatografikoen eta/edo elektroforetikoen bidez (SDS-PAGE elektroforesia) bereiztea. • Proteinak immunoblotting (western blot) bidez eta ELISA immunosaiakuntzaren bidez identifikatzea. • Proteinen datu-baseak maneiatzea.

X X X X

X

X X X

X

X

15

KIMIKA



• Asepsia-jarraibideak eta arrisku biologikoen prebentziokoak aplikatzea. • Sortutako hondakinak (hondakin biosanitarioak) manipulatzea eta ezabatzea.

X X

X X

X X

X X

KONTZEPTUZKOAK

• Zelula-hausturako metodo nagusien deskribapena: lisia, suntsipen mekanikoa eta izoztea/desizoztea. • Proteina-kuantifikazioaren printzipio kolorimetrikoak. • Proteinak bereizteko metodo kromatografiko nagusien ezaugarriak. • Proteinak bereizteko metodo elektroforetikoen printzipioak. • Antigeno-antigorputz erreakzioaren ezaugarriak. • Proteinak identifikatzeko tekniken printzipio immunologikoak. • ELISA immunosaiakuntzako teknikaren faseak eta modalitateak. • Proteinak identifikatzeko datu-base informatizatuak.

X

X X X X X X

X X X

X

JARRERAZKOAK

• Asepsia- eta segurtasun-arauak, laneko osasunekoak eta ingurumena babestekoak betetzea, bereziki agente biologikoei eta genetikoki eraldatutako organismoei dagokienez.

• Tresneriaren garbiketan, funtzionamenduan eta oinarrizko mantentze-lanetan segurtasunez, errespetuz eta arretaz jokatzea. • Jarduerak garatzeko prestasuna, inplikazioa, ekimena eta autonomia izatea. • Esleitu dizkioten lanak egiteko zorroztasuna, ordena, garbitasuna eta metodoa izatea. • Talde-lanerako gaitasuna izatea. Taldean laguntzea eta integratzea. • Lan-prozedura normalizatuen jarraipena egitea eta laborategiko jardunbide egokiak betetzea.

X X X X X X

X X X X X X

X X X X X X

X X X X X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.



1, 2, 3, 5, 6, 8, 10,

12

1 h X X Irakasleak ikasleei planteatuko die nola erauzi eta identifikatuko lituzketen zelula-kultura bateko proteina zitoplasmatikoak, eta horri buruzko orientabide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, proposatutako suposizioari erantzungo diote. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean,

Ikasleek proteinak erauzteari eta identifikatzeari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Proteinen teknikak. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2010. Euskal Herriko Unibertsitatea. Zientzia eta Teknologia Fakultatea.

16

KIMIKA



erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición.


3, 6, 8, 10 1 h X X Ikasleak hainbat proteina proposatuko ditu, aztertzeko interesgarriak izan daitezkeenak. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.

Ikasleen aldez aurreko jakintzak ikaskuntzaren edukiekin erlazionatzeko.

"Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan interes desberdineko proteinei eta horiek bakartzeko eta ezaugarritzeko prozesuei buruz argitaratutako artikuluak. Proteinak erauzteko eta identifikatzeko prozesuaren fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Mikropipetak erabiltzeko praktika gidatua.

1, 2 1 h X X Ikaslea ohitu egingo da eta ondorengo praktika guztietan erabiliko dituen pipetak maneiatzen ikasiko du. Eskuarki, hiru tamainakoak izaten dira, hiru bolumen-tarte pipeteatzeko modukoak: P20 = 2-20 µL, P200 = 20-200 µL eta P1.000 = 200-1.000 µL. Pipetak erabili eta botatzeko plastikozko puntekin batera erabiltzen dira (eskuarki autoklabatuak); txikienek (P20 eta P200) punta horiak eta zuriak erabiltzen dituzte eta P1.000 pipetak punta urdin handiagoak. Ikasleek erabilera-arau hauek kontuan hartu behar dituzte: − Muga maximoak eta minimoak inoiz ez

gainditzea. − Pipeta bortxatu gabe doitzea bolumena. − Bolumen bat hartzean, bigarren

Mikropipetak behar bezala erabiltzeko, bioteknologian erabiltzen diren teknika molekularren garapen praktikoaren funtsezko oinarria baita. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko.

Hainbat bolumenetako mikropipetak. Hainbat bolumenetako mikropipetentzako erabili eta botatzeko puntak. Ur-ontzia (100 ml).

17

KIMIKA



erresistentzia-punturaino ez sakatzea. − Punta ez sartzea ontziaren hondoraino. Irakasleak ikasleek egiten dutena behatu eta erregistratuko du eta bidegabeko erabilerak zuzenduko ditu.

J3-E3 Giza zelulen kultura batetik zelula barneko proteinak erauzteko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 12, 13

2 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, zelula barneko proteinak erauziko dituzte odol-zelulen kultura batetik. Horretarako, 4x106 zelula inguru dituen zelula-kultura baten sedimentua lisi-indargetzailean berresekiko dute, Eppendorf hodi batera pasatu, izotzetan 30 minutuz inkubatu eta 15 minutuz zentrifugatuko dute 12000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan. Azkenik, proteina zitoplasmatikoak dauzkan gainjalkina bildu eta hotzean gordeko dute proteinak kuantifikatu arte. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak proteina erauztearen emaitzak.

Zelula-kultura batetik zelula barneko proteinak erauzteko. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, zorrotza, autonomoa eta taldekoa sustatzeko. Erauzitako proteinak egoki etiketatzeko eta kontserbatzeko.

Zelula-kultura. Lisi-indargetzailea:

• 20 mM Tris-ClH pH 8. • 137 mM NaCl. • % 10 glizerol. • % 1 triton X-100. • 1mM banadato. • 2 mM EDTA pH 8. • 1X proteasa-

inhibitzaileak. Ultrazentrifugagailua. Izotza. Mikropipeta. Eppendorf hodiak.

J4-E4 Erauzitako proteinak Coomassie (Bradford) metodoaren bidez kuantifikatzeko praktika gidatua.

1, 2, 5, 6, 7, 12, 13

2 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, erauzitako proteinak Bradford metodoaren bidez kuantifikatuko dituzte. Horretarako, proteina zitoplasmatikoentzako zuzen patroi bat prestatuko dute hainbat kontzentrazio ezagunetako BSA proteinekin, eta gero Bradford erreaktiboaren 40 µL gehituko dizkiote 480 µL-ko azken bolumen bati, bai zehaztutako kontzentrazioko BSA

Aurreko praktikan erauzitako proteinak kuantifikatzeko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa sustatzeko.

BSA proteina (1 µg/µL). Plaka kikaradunak. Kolorimetroa, espektrofotometroa, plaka-irakurgailua. Lisi-indargetzailea. Mikropipetak.

18

KIMIKA



laginei eta bai kontzentrazio ezezaguneko erauzitako proteinen laginei. Azkenik, absorbantzia neurtuko dute 595 eta 450 nm-tan. Koloratzailea proteinen eta aminoazido espezifikoen egitura tertziarioari lotzen zaio, eta kolore marroitik urdinera aldatzen da proteinei lotzen zaienean. Haren intentsitatea proteina kantitatearekiko zuzenki proportzionala da. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J5-E5 Proteinak pisu molekularrean oinarrituta analizatzeko SDS-PAGE elektroforesia egiteko praktika gidatua.

1, 2, 8, 9, 12, 13

5 h X X Ikasle-bikoteek, irakaslearen gidaritzapean, SDS (sodio dodezil sulfatoa, detergente bat)-PAGE (elektroforesi-gela poliakrilamidazko matrizean eta baldintza desnaturalizatzaileetan) elektroforesi bat egingo dute. Horrela, proteinak anodorantz migratzen du bere pisu molekularraren arabera, ez kargaren arabera. Elektroforesia egin baino lehen, ikasleek dagozkion gelak prestatu behar dituzte (bereizlea eta kontzentratzailea). Horretarako, aurretiko hainbat disoluzio ere egin behar dituzte. Lagineko proteinen pisu molekularra ezagutzeko, ikasleek pisu molekular ezaguneko proteina-markatzaile bat korriaraziko dute gelaren kale batean. 20 µg proteina total gelean kargatu ondoren (aldez aurretik masa zehatz hori izateko

Erauzitako proteinen masa molekularra zehazteko SDS-PAGE elektroforesi bat egiteko. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, autonomoa eta taldekoa sustatzeko.

Matrazeak edo prezipitatu-ontziak, 50 mL, 100 mL eta 500 mL-koak. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak. Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Akrilamidazko gel txikientzako moldea, dagokion orraziarekin. Akrilamidazko gel txikien elektroforesi bertikaleko kubeta. Elikatze-iturria. Gela prozesatzeko (tindatzeko) kubetak. Kubetentzako irabiagailua. Disoluzioak:

• Akrilamida-bisakrilamida (30:0,8) (prestatua ere eros daiteke).

• % 10 SDS. • % 10 amonio persulfatoa

(APS). • 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8.

19

KIMIKA



beharrezkoa den bolumena kalkulatuta), ikasleek 4X karga-indargetzailea gehituko dute. Indargetzaileak SDS, 2-merkaptoetanola, glizerola eta bromofenol-urdina (elektroforesiaren frontea markatzen duen koloratzailea) dauzka. Laginak gelean kargatu aurretik, 5 minutuz irakin eta izotzetan hozten dira. Azkenik, dagozkien markatzaileak ezarriko dituzte eta laginak 180 voltean korriaraziko dituzte ordubetez (1 h). Gainera, analizatutako proteinari buruzko informazioa bilatuko dute dagozkion datu-baseetan. Proteina immunoblotting (western blot) bidez identifikatzen ez badute (J6-E6 praktika), ikasleek gela zilarrez tindatuko dute. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak elektroforesiaren emaitzak.

• 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8. • Elektroforesi-

indargetzailea. • Tindaketa-disoluzioa. • Lagin-indargetzailea 5X

(10 mL). Zilarrez tindatzeko disoluzioak:

• Zilarrez tindatzeko finkatze- eta gelditze-disoluzioa.

• Zilar-disoluzioa. • Errebelatze-disoluzioa. • Destindatze-disoluzioa. • Lehortze-disoluzioa.

Proteinak identifikatzeko datu-base informatizatuak.

J6-E6 Elektroforesia egin zaien proteinei immunoblotting edo western blot egiteko praktika gidatua.

1, 2, 10, 11, 12, 13

3 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, immunoblotting bat egingo dute elektroforesi bidez bereizitako molekulak abiapuntutzat hartuta. Horretarako, lau urrats hauek egingo dituzte: − Proteinak poliakrilamidazko geletik

bigarren matrize batera, hots, nitrozelulosazko edo PVDFzko (“Polyvinyldifluoride”) mintz batera transferitzea. Horretarako, transferentzia elektroforetikoko zelulan honela jartzen dira paperak: oinarria osatzen duen polo positiboaren (anodoa) gainean iragazpaperetariko bat, horren gainean mintza, gainean gela, gelaren gainean

Molekulak geletatik mintzetara transferitzeak SDS-PAGE elektroforesian bereizitako proteinak identifikatzeko aukera ematen du. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, autonomoa eta taldekoa sustatzeko.

Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak. SDS-PAGE gela, aurreko praktikan (J5-E5) bezalaxe prestatua. Karga- edo lagin-indargetzailea. Elektroforesi-indargetzailea. Elektroforesi-sistema. Termoblokea edo antzekoa. Coomassie tindaketa-disoluzioa. Gela tindatzeko kubetak. Irabiagailua. Izotza. PVDFzko mintza. Metanola.

20

KIMIKA



beste iragazpaper bat, eta, azkenik, horren gainean polo negatiboa (katodoa). Transferentzia-zelula itxi eta 300 mA-an jarriko dute 45 minutuz.

− Mintza blokeatzea, intereseko molekula detektatzeko erabiliko diren antigorputzak haren gainazalari inespezifikoki lotzea saihesteko.

− Detektatu nahi den proteinarentzako antigorputz espezifikoekin (entzimekin markatuak) inkubatzea.

− Mintza errebelatzea, adierazitako entzimarentzako substratu egokia gehituta, horrela detekta daitekeen produktu bat ekoizten baita.

Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak immunoblotting-aren emaitzak.

Transferentzia-indargetzailea. Whatman paper xurgatzailea. Transferentzia-sistema:

• Transferentzia-euskarria. • Elektroblotting-euskarria. • Elektroblotting-ganbera.

Antigorputzak. Errebelatu kromogenikoko disoluzioa.

J7-E7 Zuzeneko ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) immunosaiakuntza egiteko praktika gidatua.

1, 2, 10, 11, 12, 13

2 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, proteinak zuzeneko ELISA test edo immunosaiakuntzaren teknikaren bidez identifikatuko dituzte, antigenoari lotuta nahiz antigorputzari lotuta dauden entzimak erabilita. Saiakuntza 96 kikarako plaketan egingo dute. Ikasleek urrats hauek egingo dituzte: − Antigorputza edo antigenoa entzima

batekin konjugatzea. − Antigenoa (edo antigorputza) kikaretan

gehitzea (kikarak identifikatu beharreko laginarekin estaltzea).

− Okupatu gabeko lekuak proteina ez-espezifiko batekin (BSA) blokeatzea.

− Antigorputz primario espezifikoarekin

Proteinen presentzia detektatzeko entzimekin markatutako antigorputzekiko erreakzioaren arabera. Izan ere, entzima horiek, substratu espezifikoen presentzian, erraz detekta daitezkeen erreakzio kolorimetrikoak sortzen dituzte. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa sustatzeko.

96 kikarako plakak. BSA proteina. Identifikatu beharreko proteinak dituzten disoluzioak. Kontrol positiboak eta negatiboak. Espektrofotometroa edo plaka-irakurgailua. Zuzeneko ELISA testa egiteko kit komertziala.

21

KIMIKA



inkubatzea neurtu beharreko antigenoaren (proteina) aurrean.

− Antigorputz sekundario - entzima konplexuarekin inkubatzea (antiimmunoglobulina primarioa).

− Entzima konjugatuarekin erreakzionatzen duen substratua gehitzea.

− Produktu koloreztatua osatzea. Fluoreszentzia edo argia igortzea.

Oso garrantzitsua da kontrol negatiboak (bilatu nahi den proteina ez dutela ziur gauden laginak) eta positiboak (detektatu nahi dugun proteina duten disoluzioak) egitea. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak zuzeneko ELISA testaren emaitzak.


1 h X X Irakasleak laburpen moduko gogoeta-jarduera egingo du ikasgelako taldearekin, amaitzeko (funtsezko puntuak eta zalantzak), ikaskuntzak identifikatzeko, orokortzeak egiteko, emaitzak aurkezteko eta irakasteko, eta ikasteko prozesua ebaluatzeko.

Laburpen-prozesua egiteko. Ikasteko prozesua ebaluatzeko. Unitate didaktikoa ebaluatzeko.


OHARRAK

• Unitate didaktiko nabarmenki praktiko honetan, bere izaera sintetikoa dela-eta, OCDaren oinarrizko edukietan espresuki jasota ez dauden edukiak ager daitezke. Eduki horiek ikasgelako programazioaren mailan zehaztu beharraren ondorio da hori. Gainera, multzo bati baino gehiagori buruzkoak izan daitezke, haien artean dagoen harreman nabarmena kontuan hartuta.

• Gure iritziz, izan litezkeen logistika-arazoen ondorioz J6-E6 eta J7-E7 jarduerak egiterik ez badago ere, ikasleek aurreko beste jarduera guztiak egiteak bermatzen du behar adinako konpetentzia eskuratuko dutela unitateko ikaskuntzaren emaitzak lortzeko, funtsean proteinentzako SDS-PAGE elektroforesian zentratzen direnak. Gainera, jarduera bakoitzerako kalkulatutako iraupenak estu samar daudenez gero, denbora gehiago izango da hobeto egin ahal izateko. Dena den, bai unitate didaktiko honetan, bai hurrengoetan, jarduera batzuk ikastetxearekin zerikusirik ez duten laborategi

22

KIMIKA



publiko edo pribatuetan egin litezke, erakundeen artean izenpetutako lankidetza-hitzarmen baten esparruan, jatorrizko ikastetxetik jarraipen egokia eginda. • Noiz edo noiz, baliabideen artean argitalpenak, liburuak eta dokumentuak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

23

KIMIKA


UD3: ANIMALIA, LANDARE ETA BAKTERIO JATORRIKO AZIDO NUKLEIKOAK ERAUZTEA ETA ARAZTEA

3. unitate didaktikoa: ANIMALIA, LANDARE ETA BAKTERIO JATORRIKO AZIDO NUKLEIKOAK ERAUZTEA ETA ARAZTEA Iraupena: 15 ordu


1. Lagina, materialak eta erreaktiboak erauziko den materialaren arabera prestatzea. 2. Azido nukleikoak erauzteko eta arazteko tresneria kalibratzea eta mantentzea. 3. DNA genomikoa erauzteko prozedurak, dagozkien faseak eta beharrezkoak diren materialak eta erreaktiboak deskribatzea. 4. DNA genomikoa erauztea, aurreko helburuan deskribatutako prozedurak aplikatuta. 5. Erauzitako proteinak gero analizatzeko erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. 6. DNA plasmidikoa erauzteko metodo erabilienak deskribatzea, eta bata edo bestea hautatzeko irizpideak adieraztea. 7. DNA plasmidikoa erauztea, deskribatutako metodoren bat erabilita. 8. RNA erauzteko metodoak eta horien mugak deskribatzea. 9. RNA dagokion protokoloaren arabera erauztea.

10. Erauzitako azido nukleikoak kuantifikatzea. 11. Agarosa-geleko elektroforesi bat egitea lortutako DNA bistaratzeko. 12. Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. 13. Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Hainbat jatorritako DNA erauzteko abiapuntuko lagina prestatzea. • DNA eta RNA erauzteko eta arazteko tresneria kalibratzea eta mantentzea. • Hainbat jatorritako DNA genomikoa eta plasmidikoa lisi zelularraren bidez erauztea eta araztea. • Erauzitako azido nukleikoak erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. • DNA eta RNA kolorimetria eta espektrofotometria bidez kuantifikatzea. • Agarosa-geleko elektroforesi bat egitea bakartutako DNA bistaratzeko. • RNA erauztea eta agarosa-geleko elektroforesi baten bidez analizatzea. • Agarosa-geleko elektroforesi bat egitea bakartutako RNA analizatzeko. • Asepsia-jarraibideak eta arrisku biologikoen prebentziokoak aplikatzea. • Sortutako hondakinak (hondakin biosanitarioak) manipulatzea eta ezabatzea.

X X X X X

X X

X X X

X X

X X X X X

24

KIMIKA



KONTZEPTUZKOAK

• Azido nukleikoen moten arteko desberdintasun estrukturalak eta funtzionalak. • Antolamendu eukariotikoaren eta prokariotikoaren zelula-egitura. • Plasmidoen izaera eta funtzioa. • DNA genomikoa eta plasmidikoa erauzteko eta arazteko metodo nagusien ezaugarriak eta faseak. • Azido nukleikoen kuantifikazioaren printzipio kolorimetrikoak eta espektrofotometrikoak. • RNA erauzteko eta arazteko metodo nagusien ezaugarriak eta faseak. • Agarosa-geleko elektroforesiko teknikaren printzipioak eta ezaugarriak.

X X X X X X

X X X X X X

X

JARRERAZKOAK

• Asepsia- eta segurtasun-arauak, laneko osasunekoak eta ingurumena babestekoak betetzea, bereziki agente biologikoei eta genetikoki eraldatutako organismoei dagokienez.

• Tresneriari eta materialei dagozkien jardueretan segurtasunez, errespetuz eta arretaz jokatzea, lan-prozedura normalizatuei jarraiki eta laborategiko jardunbide egokiak betez.

• Jarduerak garatzeko ekimena eta autonomia izatea. • Esleitu dizkioten lanak egiteko inplikazioa, zorroztasuna, ordena, garbitasuna eta metodoa izatea. • Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea.

X X X X X

X X X X X

X X X X X



Helburu inplikat. D

Ir. Ik. NOLA egingo den ZERTARAKO egingo den ZEREKIN egingo den


1, 2, 3, 5, 6, 8, 12

30 min

X X Irakasleak ikasleei planteatuko die nola erauzi eta araztuko luketen hainbat iturritako DNA, eta horri buruzko orientabide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, proposatutako suposizioari erantzungo diote. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek azido nukleikoak erauzteari eta arazteari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Proteinen teknikak. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2010. Euskal Herriko Unibertsitatea. Zientzia eta Teknologia Fakultatea. Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010. Tknika, Vita-Aidelos. Kordobako Unibertsitateko Biokimikako eta Biologia Molekularreko Sailaren

25

KIMIKA



Bioteknologiako Jardunbideen Protokoloak. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición.


3, 6, 8 30 min

X X Ikasleak hainbat iturritako DNA proposatuko du, aztertzeko erabilgarria izan daitekeena. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


"Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan interes desberdineko azido nukleikoei eta horiek bakartzeko eta ezaugarritzeko prozesuei buruz argitaratutako artikuluak. DNA eta RNA erauzteko eta arazteko prozesuaren fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Bakterio-jatorriko azido nukleikoak bakartzeko eta bistaratzeko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12,

13

4 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, bakterio baten azido nukleikoak, bai DNA bai RNA, erauzi eta araztuko ditu, eta ondoren agarosa-geleko elektroforesi batean bereizi egingo ditu. Horretarako, bakterioa 1-5 ml ingurunetan haziko du, antibiotiko selektibo egokiarekin, kultura egonkorrera iritsi arte (esate baterako, 12-16 orduz gauean), 37 ºC-tan eta bizkor irabiatzeko baldintzetan (esate baterako, 200 b/min), ongi aireztatu eta haziko dela ziurtatzeko. Kultura mikrozentrifugagailuko hodietan bana daiteke eta 4 ºC-tan gorde hainbat egunetan (astebete edo bi aste). Hainbat hilabetetan ere gorde daiteke -20 ºC-tan edo tenperatura baxuagoan (nahiz eta horrek zelula batzuen haustura eragingo

Bakterio baten azido nukleikoak lisi zelularraren bidez bakartzeko, agarosa-gelean elektroforetikoki bereizteko eta dagozkien tindaketaren eta errebelatuaren bidez bistaratzeko. Lortutako material genetikoaren pisu molekularrak gutxi gorabehera kalkulatzeko. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko.

Bakterio-kultura, hurrenez hurrengo antibiotikoekin. Hainbat bolumenetako mikropipetak. Hainbat bolumenetako mikropipetentzako erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak. Mikrozentrifugagailua. Ur destilatu esterila. Prezipitatu-ontzia edo Erlenmeyer, 250 mL-koa. Metxeroa, mikrouhin-labea edo berokuntza-plaka. Probeta bat edo likidoak neurtzeko ontzia. Balantza. Gelentzako erretilua eta orraziak. Elektroforesirako kubeta.

26

KIMIKA



duen). Gero, kultura egonkorraren 0,5 ml 1,5 ml-ko mikrofuga-hodi batean zentrifugatuko du 12.000 bira minutuko abiaduran 30 segundoz, zelulak prezipitatzeko, gainjalkina dekantazio bidez ezabatuko du, 50 �l ur destilatu esteril gehituko du hodiaren tapan eta bizkor irabiatuko du vortex moduko irabiagailu batekin zelulak ongi berresekitzeko. Lagin horiek hainbat hilabetetan gorde daitezke –20 ºC-tan edo tenperatura baxuagoan, erabili arte. Agarosa-geleko elektroforesia egiteko, ikasleek lehenago agarosa-gela % 1eko kontzentrazioan prestatuko dute honela: matraze batean agarosa kantitate egokia (1 g) TAE 1X indargetzailearekin (100 ml) nahasiko dute. Agarosa-gelaren kontzentrazioa bereizi beharreko DNA zatien tamainaren araberakoa da: kontzentrazio minimoa % 0,7 da (zenbait kpb-tako zati handiak) eta maximoa % 4 (50-150 pb-ko zatiak). Gero, nahastea (agarosa + TAE) mikrouhin-labe edo erregailu elektriko batekin berotuko dute, agarosa urtu eta erabat disolbatu arte, etidio bromuro disoluzio baten (10 mg/ml) 5 �l gehituko diote eta nahastea (gela) hozten utziko dute 50 ºC eta 60 ºC bitarteko tenperaturara iritsi arte. Jarraian, aldez aurretik prestatutako "ohantze elektroforetiko" batean isuriko dute, "orrazi" egokia jarrita kikarak osatzeko. Azkenik, hozten utziko dute mugitu gabe giro-tenperaturan, nahastea erabat gelifikatu arte.

Kubetarako elikatze-iturria. Argi ultramoreko transiluminagailua. Argi ultramoretik babesteko betaurrekoak. Eskularruak. Agarosa. Tris azetato indargetzailea (TAE), stock kontzentratua (litroko) 50X:

• Tris base, 242 g. • Azido azetiko glaziala,

57,1 mL. • EDTA (pH 8,0) 0,5 M

100 mL. Laneko TAE indargetzailea 1X. 10X kargako Ficoll disoluzioa, bromofenol-urdinarekin. Etidio bromuroa 20X, 10 mg/mL. Pisu molekular ezaguneko markatzaileak.

27

KIMIKA



Lagina gelean kokatu baino lehen, ikasleak 12.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko du 5 minutuz, eta azido nukleikoen zati bat daukan gainjalkina bilduko du. Azkenik, gainjalkinaren 9 �l eta 10X kargako "Ficoll" disoluzioaren 1 �l elektroforesipean jarriko du, etidio bromuroarekin tindatutako agarosa-gelean. Gomendatzen dugu lehenik karga-disoluzioaren 1 �l hodi berri bakoitzaren hondoan botatzea punta bera erabilita. Elektroforesia amaitzen denean, talde bakoitzak gela lanpara ultramore baten gainean kokatuko du, DNAren banda fluoreszenteak behatzeko (DNAri itsatsi zaion bromuroak eragindakoak). Praktika honetan hiru bereiz daitezke: goikoa, DNA genomikoa; tartekoa, mehea, DNA plasmidikoa; eta behekoa, lodia, RNA. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak bakterioen azido nukleikoak erauztearen emaitzak.

J3-E3 DNA plasmidikoa, lisi alkalinoaren bidez, eta RNA (bakterioenak biak) arazteko praktika gidatua.

1, 2, 5, 6, 7, 8, 9,

11, 12, 13

4 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, DNA plasmidikoa, lisi alkalinoaren bidez, eta RNA (bakterioenak biak) araztuko dituzte. DNA PLASMIDIKOA ARAZTEA. Bakterioak biltzea: Horretarako, antibiotiko baten aurreko erresistentziako gene bat duen plasmido bat daraman bakterio baten kultura egonkor baten 1,5 mL (2 × 750 �l) hartuko dute ikasleek. Kultura hori gau osoan hazi da 37 ºC-tan

DNA plasmidikoa hiru urrats hauek eginda arazteko: (i) Bakterioak plasmidoa daramatenen ingurune selektibo batean haztea. (ii) Bakterioen lisia egitea plasmidoa askatzeko. (iii) DNA plasmidikoa araztea. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, zorrotza, autonomoa eta taldekoa sustatzeko.

Antibiotiko baten aurreko erresistentziako gene bat duen bakterio baten zelula-kultura. Zelula-kultura eukariotikoa. Hainbat bolumenetako mikropipetak. Hainbat bolumenetako mikropipetentzako erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak. Mikrozentrifugagailua. GTE disoluzio isotonikoa:

28

KIMIKA



antibiotikoa duen ingurunean. Gero, Eppendorf hodi batean (aldez aurretik markatua) isuri eta giro-tenperaturan zentrifugatuko dute, 3 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran. Gero, gainjalkina (2 × 750 �l) kontu handiz kenduko dute, eta, zentrifugagailu-pultsu bat emanez, arreta handiz kenduko dute artean geratzen dena eta bota egingo dute, bakterioen prezipitatuarekin geratuz. Lisi alkalinoa: Ikasleek bakterioen sedimentua disoluzio isotoniko baten (GTE: Glukosa, Tris eta EDTA) 100 �l-tan berresekiko dute (bizkor irabiatuta) 4 ºC-tan, eta giro-tenperaturan utziko dute 5 minutuz. Ondoren, giro-tenperaturan dagoen lisi-disoluzio (NaOH, SDS) prestatu berriaren 200 �l gehituko diote hodi berari, eta hodia eskuarekin irauliz (10 bat aldiz) emeki irabiatuko dute, eta 4 ºC-tan inkubatuko dute 5 minutuz. Neutralizazioa: Ikasleak neutralizazio-disoluzioaren (potasio azetatoa 3M, pH 4,8) 150 �l gehituko dio hodi berari. Hodia eskuarekin irauliz (10 bat aldiz) irabiatuko du. 5 minutuz inkubatuko du 4 ºC-tan. Plasmidoak bakartzea: Agregatu makromolekularrak zentrifugazio bidez prezipitatzen dira (15 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan), eta esne-itxurako sedimentu zuri bat osatzen dute. Hodia kontu handiz eramango dute lan-mahaira.

Erauzitako azido nukleikoak egoki etiketatzeko eta kontserbatzeko.

• Glukosa 50 mM. • Tris-HCl 25 mM pH 8,0. • EDTA 10 mM pH 8,0.

Lisi-disoluzioa (freskoa prestatu DNA plasmidikoaren erauzketa bakoitza egin baino lehen): 0,2 N NaOH. % 1 SDS. Neutralizazio-disoluzioa:

• Potasio azetatoa 3M, pH 4,8.

Etanol absolutua. % 70eko etanola. TE pH 8,0 A erribonukleasarekin:

• Tris-HCl 10 mM pH 8,0. • EDTA 1mM pH 8,0. • A erribonukleasa 0,5

�g/�L. TRI Reagent. Kloroformoa. Isopropanola. Dietil pirokarbonatoarekin tratatutako ura. TAE:

• Tris-Azetato 40 mM. • EDTA 1 mM.

DNA karga-indargetzailea: • % 30 glizerol. • % 0,35 G laranja. • TAE 10x.

RNA karga-indargetzailea: • % 10 sakarosa. • % 90 formamida

desionizatu. • % 0,05 bromofenol-

urdin.

29

KIMIKA



Ikasleek kontu handiz erretiratuko dute (2 × 200 �l) DNA plasmidikoa duen gainjalkina eta hodi garbi batean (aldez aurretik markatua) jarriko dute. DNA plasmidikoa duen disoluzioa jarri duten hodiari 1 ml etanol absolutu (4 °C) gehituko diote eta hodia eskuarekin irauliz (10 bat aldiz) nahasiko dute. 15 minutuz inkubatuko dute 4 ºC-tan. Plasmidoak zentrifugazio bidez prezipitatzen dira (15 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan). Ikasleek kontu handiz erretiratuko dute gainjalkina eta bota egingo dute. Gero, hodi berari 900 �l % 70eko etanol (4 ºC) gehituko diote eta hodia eskuarekin irauliz (10 bat aldiz) emeki nahasiko dute, plasmidoak zentrifugazio bidez (10 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan) berriz prezipitatu eta gainjalkina berriz erretiratu eta bota egingo dute. Zentrifugagailu-pultsu bat emanez, ikasleek kontu handiz erretiratuko dute artean geratzen den gainjalkina eta bota egingo dute, plasmidoen prezipitatuarekin geratuz. Azkenik, plasmidoen prezipitatua disolbatuko dute (mikropipetaz lagunduta likidoa zenbait aldiz xurgatuz eta askatuz) TE indargetzailearen (pH 8,0) 50 �l-tan, A erribonukleasarekin, giro-tenperaturan inkubatuko dute 5 minutuz, eta lagina 4 ºC-tan gordeko dute. RNA ARAZTEA Ikasleek lagina 500 �l TRI Reagent erreaktibotan homogeneizatuko dute, mikropipetaz lagunduta likidoa zenbait aldiz

Erreferentziako lagina. Aurreko praktikan agarosa-geleko elektroforesirako adierazitako materiala.

30

KIMIKA



xurgatuz eta askatuz, beste 500 �l TRI Reagent gehitu eta dena berriz nahasiko dute mikropipetaren laguntzarekin, eta 5 minutuz inkubatuko dute giro-tenperaturan. Gero, 200 �l kloroformo (hotza) gehituko dute, hodia ongi itxi, edukia eskuz bizkor irabiatu (~30 s) eta 5 minutuz inkubatuko dute giro-tenperaturan. Gero, bi faseak zentrifugazio bidez bereiziko dituzte (15 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan), kontu handiz erretiratuko dute (faseartea ukitu gabe) goiko fase urtsua (koloregabea) eta Eppendorf hodi garbi batean (aldez aurretik markatua) jarriko dute. Ondoren, 500 �l isopropanol gehituko diote RNA prezipitatzeko, edukia eskuz bizkor irabiatu (~30 s), giro-tenperaturan 10 minutuz inkubatu eta zentrifugatu egingo dute (15 minutuz 12.000 bira minutuko abiaduran eta 4 ºC-tan). Gero, gainjalkina kontu handiz erretiratuko dute, prezipitatua ukitu gabe, eta bota egingo dute. Azkenik, RNA duen prezipitatua 75 �l uretan disolbatuko dute, mikropipetaz lagunduta likidoa zenbait aldiz xurgatuz eta askatuz, 10 minutuz berotuko dute 55-60 ºC-tan, bizkor hoztu eta 4 ºC-tan gordeko dute. AGAROSA GELEKO ELEKTROFORESIA DNA laginak prestatzea Eppendorf hodi batean, talde bakoitzak DNA plasmidikoaren laginaren 10 �l eta karga-indargetzailearen (glizerola eta G laranja) 1 �l jarriko du.

31

KIMIKA



RNA laginak prestatzea Eppendorf hodi batean RNA laginaren 4 �l eta karga-indargetzailearen (sakarosa, formamida eta bromofenol-urdina) 6 �l jarriko dituzte. Modu anomaloan emigratzen duten agregatuak sorrarazten dituzten RNAren kate barruko birnaturalizazioak eragozten ditu formamidak. Lagina 3 minutuz berotuko dute 55-60 ºC-tan, bizkor hoztu eta zentrifugagailu-pultsu bat emango diote.

Elektroforesia Ikasleek DNA eta RNA laginak aurretik prestatutako % 1eko agarosa-geletan kargatuko dituzte (erreferentziako lagina), elektroforesi-kubeta estali eta elektrodoak elikatze-iturriarekin konektatuko dituzte (gorria polo positiboan). Elikatze-iturria 70 voltean programatuko dute eta elektroforesia ~ 45 minutuz funtzionatzen utziko dute. Azido nukleikoak bistaratzea Elektroforesia amaitzen denean, gela transiluminagailu batean jarri eta argi ultramorearekin irradiatuko dute. Ikasleek emaitzazko irudiaren eskema bat egingo dute, eta garbien agertzen diren banden gutxi gorabeherako lodiera eta gelean duten posizioa adieraziko dute. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak azido nukleikoak erauztearen emaitzak.

J4-E4 Giza DNA genomikoa erauzteko eta kuantifikatzeko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 10, 12,

2 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, DNA erauziko dute aho-irakuzketa bat

DNA genomikoa erauzteko. Azido nukleikoen kontzentrazioa

Hainbat bolumenetako mikropipetak.

32

KIMIKA



13 abiapuntutzat hartuta. Gero, erauzitako azido nukleikoaren kantitatea kuantifikatuko dute, teknika espektrofotometrikoen bidez, prozesu honi jarraituz: GIZA DNA GENOMIKOA ERAUZTEA Laginak hartzea Ikasleek aho-irakuzketa bat egingo dute eta emaitza 5 minutuz zentrifugatuko dute 2.000 bira minutuko abiaduran. Lisi zelularra Talde bakoitzak lisi zelularreko disoluzioaren 1 mL gehituko dio laginari eta 15 minutuz inkubatuko du. Gero, 10 µL K proteinasa gehituko dute, multivortexean minutu batez (1 min) irabiatu eta 15 minutuz inkubatuko dute. Proteinak salting-out bidez prezipitatzea Ikasleek proteinak prezipitatzeko disoluzioaren 340 µL gehituko dute, multivortexean minutu batez (1 min) irabiatu eta lisatua 1,5 mL-ko Eppendorf hodi batera aldatuko dute, 10 minutuz izotzetan inkubatu eta beste 10 minutuz zentrifugatuko dute 13.000 bira minutuko abiaduran. DNAren prezipitazioa Ikasleek 1,5 mL-ko hodiak prestatuko dituzte, 500 µL isopropanol eta 2,5 µL glukogenorekin. Gero, gainjalkina hodi berri horietara aldatuko dute eta pelleta (proteina-prezipitatua) baztertu egingo dute, hodiak 50 aldiz irauliz nahasiko dute edukia eta 13.000 bira minutuko abiaduran

neurtzeko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa sustatzeko.

Hainbat bolumenetako mikropipetentzako erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak. Mikrozentrifugagailua. Espektrofotometroa eta kuartzozko kubetak. Labea. Bainu irabiatua. Aho-irakuzketarako substantzia. 10 mL-ko hodiak. Lisi zelularreko disoluzioa (detergentearekin (SDS edo antzekoa), indargetzaileekin eta kelato-eragileekin). K proteinasa. Proteinak prezipitatzeko disoluzioa (amonio sulfatoarekin edo urearekin, disolbatzaile organikoekin…). Isopropanola. Glukogenoa. % 70eko etanola.

33

KIMIKA



zentrifugatuko dituzte 5 minutuz. Gero, gainjalkina baztertu eta 500 µL % 70eko etanol gehituko dute. Hodiak zenbait aldiz iraulita nahasiko dituzte, 3 minutuz zentrifugatu 13.000 bira minutuko abiaduran, gainjalkina baztertzeko, eta pelleta labean lehortuko dute 20 minutuz 40 ºC-tan. DNAren hidratazioa Azkenik, talde bakoitzak DNA hidratatzeko disoluzioaren 50 µL gehituko du eta ordubetez (1 h) inkubatuko du 65 ºC-tan bainu irabiatuan. KUANTIFIKAZIOA Azido nukleikoen disoluzio baten kontzentrazioa espektrofotometro batean 260 nm-ko absorbantzia neurtzen zehazten da. Absorbantziaren 1 balioa gutxi gorabeherako kontzentrazio hauei dagokie: 50 µg/mL DNAren kasuan; 40 µg/mL RNAren kasuan; eta 20 µg/mL kate bakarreko oligonukleotidoen kasuan. Prestakinaren purutasuna 260 nm-ko absorbantziaren eta 280 nm-ko absorbantziaren arteko zatiduraren balioaren arabera kalkulatzen da. DNA puruaren prestakin batek 1,8 zatidura izango luke eta RNA puruaren prestakin batena 2 izango litzateke. Proteinek kutsatuz gero, zatidura gutxitu egiten da. Erabilgarri dagoen kantitatea gutxi gorabehera kalkulatzeko honako formula hau erabiltzen da: A260 = 50 µg/mL · diluzio-faktorea = X µg/mL DNA (RNAren kasuan, 50 µg/mL balioaren

34

KIMIKA



ordez 40 µg/mL balioa jarri behar da formulan). Kuantifikazioa burutzeko, talde bakoitzak 1/250 disoluzio bat prestatuko du aurreko ataleko praktikan bakartutako DNA genomikoaren laginarekin (hori da kuantifikatu nahi dena), 500 µL-ko azken bolumen batean, H2O esterila erabilita diluitzaile gisa. Gero, ikasleek zurizkoa egingo dute H2O esterilarekin, eta, ondoren, DNA genomikoaren diluzioa daukan kuartzozko kubeta espektrofotometroan sartuko dute eta lortutako absorbantziaren balioa idatziko dute. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J5-E5 Landareen DNA genomikoa erauzteko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 12, 13

3 h X X Ikasle-bikoteek, irakaslearen gidaritzapean, landare-espezie baten DNA genomikoa erauziko dute honako protokolo honen arabera: 5-10 g hosto-ehun gazte pisatu eta nitrogeno likidoarekin birrindu, hauts fin eta lehorra izatera iritsi arte. 15 mL erauzte-indargetzaile gehitu, aldez aurretik 65 ºC-tan berotua, eta bizkor nahasi lagin guztia eta indargetzailea elkar ukitzen egon arte. Ur-bainuan inkubatu 30 minutuz 65 ºC-tan. 15 mL F:C:I gehitu eta irauliz nahasi emultsioa osatu arte. 4.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatu 25 minutuz 4 ºC-tan. Fase urtsua beste hodi batera aldatu, arretaz, faseartea arrastatu gabe. C:I bolumen bat gehitu, irauliz nahasi eta 4.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatu 5 minutuz giro-

Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, autonomoa eta taldekoa sustatzeko.

Labea. Ur-bainua. Nitrogeno likidoa (ez da ezinbestekoa). Erauzte-indargetzailea:

• Tris-HCl 150 mM pH 8,0. • EDTA 15 mM. • NaCl 1 M. • Zetil trimetil amonio

bromuroa (CTAB), erabili baino lehen, hain justu, gehitzen da.

• % 1,2 B-merkaptoetanola.

• % 1 polibinilpirrolidona. Fenola / kloroformoa / alkohol isoamilikoa (F:C:I) 25:24:1. Kloroformoa / alkohol isoamilikoa

35

KIMIKA



tenperaturan. Fase urtsua beste hodi batera aldatu eta 0,1 bolumen 3 M sodio azetato (pH 5,2) eta 0,6 bolumen isopropanol hotz gehitu. Murgilduz nahasi emeki eta –20 ºC-tan inkubatu ordubetez (1 h) edo gau osoan. 4.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatu 15 minutuz 4 ºC-tan. Gainjalkina kontu handiz baztertu eta pelleta 1 mL % 70eko etanolekin garbitu. 4.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatu 5 minutuz, gainjalkina baztertu eta DNA pelleta airean lehortzen utzi. 200-500 µl TE pH 8,0 indargetzailetan berreseki eta beste hodi batera aldatu. Erauzitako DNA RNAsarekin tratatu, 20 µg/mL azken kontzentrazioan, eta 37 ºC-tan inkubatu 30 minutuz. –20 ºC-tan biltegiratu. Irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

(C:I) 24:1. Sodio azetatoa 3 M pH 5,2. Isopropanol hotza. % 70eko etanola. TE pH 8,0 indargetzailea. RNAsa 20 µg/mL.





OHARRAK

• Unitate didaktiko hau 2. unitate didaktikoa baino lehen jorra liteke ikastetxearen erabilgarritasun praktikoen arabera, zeren bi unitate horietan erauzteko eta arazteko teknikak garatzen baitira, eta bien arteko alde nagusia abiapuntuko lagina baita, hots, proteina bat edo azido nukleiko bat.

36

KIMIKA



• Halaber, unitateko jarduera praktikoak egiteko proposatutako denbora-iraupena estu-estua denez, jarduera guztiak ez egiteko erabakia har daiteke, eta ikasleen eta ikastetxearen errealitate konkretua kontuan harturik, esanguratsuentzat jotzen direnak besterik ez garatu. Izan ere, agarosa-geleko elektroforesiaren teknika, esate baterako, zenbait jardueratan errepikatzen da.

• Azkenik, aurreko unitate didaktiko batzuetan adierazi dugun moduan, jarduera batzuk ikastetxearekin zerikusirik ez duten laborategi publiko edo pribatuetan egin litezke, erakundeen artean izenpetutako lankidetza-hitzarmen baten esparruan, jatorrizko ikastetxetik jarraipen egokia eginda.

• Noiz edo noiz, baliabideen artean argitalpenak, liburuak eta dokumentuak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

37 UD4: DNA BIRKONBINATUAREN TEKNOLOGIA. MURRIZTE ENTZIMAK. BEKTOREAK. TRANSFORMAZIOA ETA DETEKZIOA

KIMIKA


4. unitate didaktikoa: DNA BIRKONBINATUAREN TEKNOLOGIA. MURRIZTE ENTZIMAK. BEKTOREAK. TRANSFORMAZIOA ETA DETEKZIOA Iraupena: 18 ordu

IE2: Azido nukleikoak klonatzen ditu biologia molekularreko prozedurak aplikatuta. IE3: Mikroorganismoak eta proteinak identifikatzen ditu saiakuntza immunologikoak eta genetikoak aplikatuta. Ikaskuntzaren helburuak:

1. Murrizte-entzima garrantzitsuenak eta bioteknologian gehien erabiltzen diren bektore motak ezagutzea. 2. DNA birkonbinatua (rDNA) lortzeko lagina, materialak (bektoreak…) eta erreaktiboak (murrizte-entzimak…) prestatzea. 3. DNA birkonbinatua eratzeko tresneria kalibratzea eta mantentzea. 4. rDNA lortzeko prozedurak eta dagozkien faseak deskribatzea. 5. Gene bat edo gene-zati bat klonazio-bektore plasmidiko batean sartzea (horrela rDNA bat lortuko da), aurreko helburuan deskribatutako prozedurak aplikatuta. 6. Lortutako bitarteko produktuak gero analizatzeko erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. 7. Hainbat ostalari motatan transformazioa gauzatzeko tresnak ezagutzea. 8. Ostalari prokariotiko zein eukariotiko bat transformatzeko prozedura deskribatzea. 9. Bakterio-zelulak plasmido birkonbinatuak sartuta transformatzea.

10. Plasmidoen miniprestakinen bidez transformatutako bakterioetan sartutako DNA birkonbinatua arazteko eta analizatzeko metodoak deskribatzea. 11. Sekuentzia klonatuak analizatzeko eta detektatzeko metodoak ezagutzea. 12. Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. 13. Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• DNA birkonbinatua lortzeko abiapuntuko lagina, entzimak eta bektoreak prestatzea. • rDNA lortzeko tresneria kalibratzea eta mantentzea. • Murrizte-entzimei eta klonazio-bektoreei buruzko suposizio praktikoak ebaztea. • DNA zati bat klonazio-bektore plasmidiko batean sartzea. • Gene-klonazioan lortutako bitarteko produktuak erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. • Bakterioak transformatzeko hazkuntza-teknikak gauzatzea. • Bakterio-zelulak plasmido birkonbinatuak sartuta transformatzea. • DNA birkonbinatua araztea eta analizatzea (murrizte-mapen bidezko detekzioa, southern blot, northern blot, hibridazioa…). • Sortutako hondakinak (hondakin biosanitarioak) manipulatzea eta ezabatzea. • Asepsia-jarraibideak eta arrisku biologikoen prebentziokoak aplikatzea.

X X X

X X

X X X X X X X X X X


KIMIKA


KONTZEPTUZKOAK

• DNA birkonbinatuaren eta gene-klonazioaren kontzeptuak eta dagozkien etapen deskribapena. • Murrizte-endonukleasen ezaugarriak, motak eta funtzioa. • Klonazio-bektore edo -garraiatzaileen egitura eta propietateak. • Bakterio-transformazioaren eta transfekzioaren ezaugarriak. • Bakterioak transformatzeko hazkuntza-teknikak. • Ostalari prokariotiko zein eukariotiko bat transformatzeko urratsak identifikatzea. • Sekuentzia klonatuak analizatzeko metodo nagusiak deskribatzea.

X X X X

X X X X X X X

JARRERAZKOAK

• Ordena, garbitasuna eta metodoa laborategiko oinarrizko eragiketak egitean eta zereginak gauzatzean. • Materiala eta tresneria segurtasunez erabiltzea, errespetatzea eta zaintzea. • Jarduerak garatzeko ekimena eta autonomia izatea. • Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Segurtasun-arauak, laneko osasunekoak eta ingurumenari dagozkionak errespetatzea.

X X X X X

X X X X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.



1, 4, 7, 8, 10, 11

1 h X X Irakasleak DNA birkonbinatuaren eta gene-klonazioaren teknologiari buruzko galdera zehatzak planteatuko dizkie ikasleei, eta horri buruzko orientabide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, planteatutako galderei erantzungo diete. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek DNA birkonbinatuaren eta gene-klonazioaren teknologiari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Proteinen teknikak. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010. Tknika, Vita-Aidelos. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición. Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un


KIMIKA


gen?


1, 4, 7, 8, 10, 11

1 h X X Ikasleak DNA birkonbinatuaren eta gene-klonazioaren teknologiaren aplikazioak proposatuko ditu. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


"Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan DNA birkonbinatuari eta gene-klonazioari buruz argitaratutako artikuluak. rDNA lortzeko eta erabiltzeko prozesuaren fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Agarosa-gelen DNA bandak arazteko praktika gidatua.

2, 6, 12, 13

3 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, aurreko elektroforesi batean bereizitako DNA araztuko du, gero bektore plasmidiko batean sartzeko. Praktika hau egiteko komenigarria izango litzateke polimerasaren kate-erreakzioaren bidez (PCR) DNA anplifikatu ondoren egindako elektroforesi baten agarosa-gel bat izatea araztutako DNA bandaren jatorria. Elektroforesia egin ondoren, praktiketako talde bakoitzak banda interesgarriak argi ultramorearen pean ebaki eta bereiz jarriko ditu Eppendorf hodietan. Ondoren, mintzarekin lotzeko disoluzioaren (kita) 10 µL gehituko du berreskuratutako bandaren 10 mg-ko, ongi nahasi, irabiatu eta 50 ºC eta 65 ºC artean inkubatuko du, agarosa-zatia guztiz urtu arte. Lortutako disoluzioa estalkirik gabeko 2 mL-ko hodi batean jartzen den aldez aurretik markatutako zutabe batera pasatuko du, eta zutabea bere euskarrian zentrifugatuko du

Agarosa-gelen DNA bandak arazteko, gero klonazio-bektore batean sartuko den DNA erauzteko. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko.

Bisturia edo kuterra. Eppendorf hodiak, 1,5 eta 2 mL-koak. Hodientzako tentegailuak. Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. DNA garbitzeko kita, agarosa-geletan eta honakoetan oinarritua:

• Mintzarekin lotzeko disoluzioa.

• Mintza garbitzeko disoluzioa.

Labea, berokuntza-plaka edo bainua 50-65 ºC-tan. Mikrozentrifugagailua. Izozkailua –20 ºC-tan. % 95eko etanola, 1 mL. Ur bidestilatu esterila, 1 mL.


KIMIKA


10.000 bira minutuko abiaduran minutu batez (1 min). Gero, ikasleek 2 mL-ko hodian atxikitako likidoa dekantatuko dute eta zutabearen garbiketei ekingo diete; lehenik, mintza garbitzeko disoluzioaren 650 µL gehituko dute, minutu batez (1 min) 10.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatu, 2 mL-ko hodian atxikitako likidoa ezabatu eta euskarria berriz muntatuko dute. Gero, urrats berak errepikatuko dituzte mintza garbitzeko disoluzioaren 450 µL gehitu ondoren, eta, azkenik, zutabea berriz zentrifugatuko dute euskarrian minutu batez (1 min) 10.000 bira minutuko abiaduran, guztiz lehortzeko. 2 mL-ko hodia ezabatu ondoren, 1,5 mL-ko Eppendorf hodi batekin ordeztuko dute, eta zutabean 100 µL ur gehituko diote, 2 minutuz 65 ºC-tan inkubatu eta 10.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko dute minutu batez (1 min). Zutabea ezabatu eta Eppendorf hodia laginaren izenarekin eta datarekin markatu ondoren, ikasleak hodi horretan berresekita edukiko du araztu nahi zuen DNA zatia. DNA hori plasmido batean klonatu ahal izateko, ikasleek kontzentratu egin behar dute, oso bolumen txikiekin lan egin behar dute-eta. Horregatik, ikasleak 3 bolumen (300 µL) etanol absolutu gehituko dizkio laginari eta DNA prezipitatzen utziko du 20 minutuz –20 ºC-tan. Denbora hori igarotakoan, 13.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko du 15 minutuz. Prezipitatutako DNA airean lehortzen utziko du


KIMIKA


10 minutuz eta gero 10 µL uretan berresekiko du. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J3-E3 DNA zati bat bektore plasmidiko batean klonatzeko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 12,

13

4 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, aurreko praktikan araztutako DNA zati bat plasmido batean klonatuko dute. Praktika honetan, hain zuzen ere, A-T mutur itsaskorren bidezko klonazioa erabiliko da, PCRan erabilitako Taq polimerasaren 3´ muturreko transferasa-aktibitatean oinarritzen dena, adenina gehigarri bat txertatzen baitu 3´ muturrean. Erabiliko den bektorea Promegaren pGEM-T plasmidoa da: linearizatuta dago eta Timina hondakin bat du mutur bakoitzean. Gainera, transformatutako zelulak hautatzeko gene markatzaile bat dauka (Amp´), anpizilina antibiotikoarekiko erresistentzia duena, baita txertoa zein bektorek daramaten zehazteko beste markatzaile bat ere (LacZ), alfa-osaketako sistema. Praktika egiteko, ikasleak kantitate hauek jarriko ditu hodi bakoitzean:

• T4 DNA ligasarako 2X lotura bizkorreko indargetzailea: 2,5 µL.

• pGEM-T (50 ng) bektorea: 0,5 µL. • DNA zati garbia eta kontzentratua:

1,5 µL. • T4 DNA ligasa: 0,5 µL.

Osagai guztiak kontu handiz nahasiko ditu pipeta erabilita, 10 segundoz zentrifugatuko

DNA zati bat bektore plasmidiko batean klonatzeko. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, zorrotza, autonomoa eta taldekoa sustatzeko. Erauzitako azido nukleikoak egoki etiketatzeko eta kontserbatzeko.

Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak. Hodientzako tentegailuak. pGEM-T Vector System I, Promega Corp. (bektorea, T4 ligasa entzimaren indargetzailea, T4 ligasa entzima eta lotura-erreakzioa egiaztatzeko kontrola barne). Mikrozentrifugagailua. DNA zati garbia eta kontzentratua (aurreko J2-E2 praktikan lortua).


KIMIKA


ditu hodiaren oinarrira eramateko, eta gau osoan inkubatuko ditu giro-tenperaturan. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak klonazioaren emaitzak.

J4-E4 E. coli-ren zelula konpetenteak transformatzeko praktika gidatua.

7, 8, 9, 12, 13

4 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, egingo dituzten transformazioak bezainbeste Eppendorf hodi esteril eta huts jarriko dituzte izotzetan. Ikasleek, hasteko, hodi bakoitza bakterioan sartu nahi duten DNArekin markatuko dute eta 100 µL zelula konpetente jarriko dute bakoitzean. Ondoren, lotura-erreakzioaren 2,5 µL gehitu eta 20 minutuz inkubatuko dute izotzetan. Gero, hodiak izotzetik atera, 30-60 segundoko shock termikoa emango diete 42 ºC-tan eta berriz izotzetan jarriko dituzte 2 minutuz, eta LB ingurunearen 0,5 mL gehituko diete. Ondoren, 60 minutuz inkubatuko dituzte 37 ºC-tan, zelulan sartu berri dituzten geneek, eta, zehazki, hautespen-ingurunearen antibiotikoarekiko erresistentzia emateaz arduratzen denak, espresatzeko denbora izan dezan. 37 ºC-ko inkubazioak dirauen bitartean, transformatutako zelulak ereiteko erabiliko dituzten ingurune solidoko plakak prestatuko dituzte. Plakek badute transformatuak izan diren zelula konpetenteen hazkuntza bakarrik

Bakterio-zelulen transformazioari esker ia edozein plasmido sar daiteke ia edozein bakterio motatan. Praktika hau laborategian erabili ohi den E. coli-ren leinu bat transformatzeko egiten da, bakterio-transformazioaren adibide erraz moduan, hori baita geneak klonatzeko prozesuaren funtsezko faseetariko bat. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa sustatzeko.

Izotza, zelulak hotz mantentzeko. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak, esterilak. Hodientzako tentegailuak. Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Ur-bainua 42 ºC zehatzetan. Labea 37 ºC-tan. Luria-Bertani (LB) ingurunea, honako hauekin:

• Triptona 10g/L. • Legamia-aterakina 5 g/L. • NaCl 5 g/L.

Hazkuntza-ingurune solidoa LB izango da, % 1,5 agarrekin, bektore plasmidikoan dagoen erresistentziari dagokion antibiotikoarekin. 10 mL LB ingurune likido (esterila). LB ingurune solidoa anpizilinarekin (100 µg/mL.) Petri plaketan. 50 µL Isopropil tio-galaktosa (IPTG) 1 M. 200 µL X-Gal (BCIG edo Bromo-kloro-indolyl-galaktopiranosido) 20 mg/mL. Mikrozentrifugagailua. Alkohol-metxeroa. Zelula-kulturak barreiatzeko


KIMIKA


hautatzea ahalbidetuko duen antibiotikoa. Oraingoz, plakari beharrezkoa den substratua gehituko diote. Horri esker zehaztu ahal izango dute bektorearekin transformatutako zeluletariko zein diren, gainera, klonatu nahi zen DNA zatiaren eramaile direnak. Praktiketako taldeak 40 µL X-gal (20 mg/mL.) eta 4 µL IPTG (1 M) gehituko dio plaka bakoitzari. Txertoa ez dagoenean, bakterioak, IPTG induktorea eta X-gal substratua dituen ingurunean, �-galaktosidasa sortzen du, X-gal substratua substantzia urdin bihurtzen duena, koloniek hartzen duten kolorazioa. LacZ genea eteten duen txerto bat baldin badago, bakterioak ez du �-galaktosidasa sortzen, eta koloniak zuri agertzen dira. 60 minutuko inkubazioaren ondoren, ikasleek zelulak 7.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko dituzte minutu batez (1 min), likidoa dekantatu eta ingurunearen 100 µL utziko dute. Gero zelulak kontu handiz berresekiko dituzte eta hodi bakoitzeko 100 µL ereingo dute LB+anpizilina+X-gal+IPTG plaka batean. Ereiteko beirazko uztai bat erabiliko dute, etanoletan busti eta alkohol-metxeroaren sugarretik pasatuz esterilizatu ondoren. 10 bat segundoz hozten utzi eta kontu handiz hedatuko dituzte 100 µL-ak plaka osoan zehar. Azkenik, plakak labean utziko dituzte 37 ºC-tan hurrengo egunera arte. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten

beirazko uztaia. % 70eko etanola. Parafilm-zerrendak.


KIMIKA


tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J5-E5 Plasmidoen miniprestakinari buruzko praktika gidatua.

10, 11, 12, 13

4 h X X Ikasle-bikoteek, irakaslearen gidaritzapean, plasmidoen arazketa eta, ondoren, horien elektroforesia egingo dute. Ikasleak bakterio-kultura ingurune likidoan haziko du, dagokion antibiotikoarekin, aurreko gauean 37 ºC-tan. Gero, hazkuntza-ingurunea zentrifugatuko du bakterio-zelulak biltzeko (minutu bat 12.000 bira minutuko abiaduran), gainjalkina ezabatu, prezipitatua 250 µL berresekidura-disoluziotan berresekiko du, 250 µL lisi-disoluzio gehitu, irauliz nahasi, 10 µL proteasa alkalinoko disoluzio gehitu, irauli eta giro-tenperaturan inkubatuko du 5 minutuz. Berehala, 350 µL neutralizazio-disoluzio gehituko du, nahasi eta minutu batez zentrifugatuko du 12.000 bira minutuko abiaduran. Hondakin zuria hoditik baztertuko du, gainjalkin gardena aldez aurretik markatutako zutabe batera eraman, eta minutu batez zentrifugatuko du 10.000 bira minutuko abiaduran. Hodi biltzaileko likidoa baztertu eta berriz muntatuko du zutabea hodi biltzailearen gainean, 700 µL garbiketa-indargetzaile gehitu (etanol absolutua daukana) eta minutu batez zentrifugatuko du 10.000 bira minutuko abiaduran. Gero, hodi biltzailetik likidoa kendu, eta berriz garbituko du 450 µL garbiketa-indargetzailerekin, eta bildutako likidoa baztertuko du. 30 segundoz zentrifugatuko du matrizea lehortzeko, hodi biltzailea baztertu eta behar bezala markatutako Eppendorf hodi berri garbi baten gainean muntatuko du zutabea.

Sekuentziazioa egin baino lehen hautatzeko espero den tamaina eta sekuentzia duten txertoak daramaten plasmido birkonbinatuak, horretarako plasmidoen arazketa (miniprestakina) eta gero haien elektroforesia eginez. Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, autonomoa eta taldekoa sustatzeko.

Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak, esterilak. Hodientzako tentegailuak. Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Bakterio-kultura likidorako hodiak, 10-15 mL-ko edukierakoak. 20 mL LB ingurune likido. 10 µL anpizilina 100 mg/mL. Ur-bainua 37 ºC-tan. Mikrozentrifugagailua. Plasmidoen miniprestakina egiteko kit komertziala: Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system, Promegarena. Ur bidestilatu esterila, 1 mL. Azido nukleikoen detekziorako suposizio praktikoak: murrizte-mapak, southern blot, northern blot, hibridazioa…


KIMIKA


Azkenik, 100 µL ur gehituko dio zutabeari, giro-tenperaturan inkubatuko du minutu batez, 10.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko du DNA araztua biltzeko, eta �20 ºC-tan gordeko du. Gero, ikasleek agarosa-geleko elektroforesia egingo dute bakartutako plasmidoak identifikatzeko. Ikasleek, halaber, azido nukleikoen detekzioa ere aztertuko dute, suposizio praktikoak abiapuntutzat hartuta: murrizte-mapak, southern blot, northern blot, hibridazioa… Irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.





OHARRAK

• Komenigarria izango litzateke DNA polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bitartez anplifikatu ondoren eta anplifikatutako DNAren agarosa-geleko elektroforesia egin ondoren egitea J2-E2 praktika. PCRaren teknika hurrengo unitate didaktikoan jorratzen denez (5. unitate didaktikoa), egokia izan liteke lehenik unitate hori irakastea eta, gero, 4. unitate didaktikoa aztertzea. Dena den, PCRaren prozeduraren azalpena aurreratu egin daiteke eta unitate didaktiko honetan eman, eta gero 5. unitate didaktikoan gogora ekarri.

• Halaber, interesgarria izango litzateke, bai unitate didaktiko honetan bai hurrengoan, ikastetxeko azalpen teoriko-praktikoen osagarri moduan, bisitaldi teknikoren bat egitea enpresa eta/edo laborategi bioteknologikoetara, bi unitate didaktikoetan deskribatutako tekniketariko batzuk praktikan ikusteko. Gainera, haietariko askotan kit komertzial garesti samarrak erabili behar direnez, enpresa horiekin lankidetzan jarduteko moduren bat bila liteke, laginak eta erreaktiboak aprobetxatzeko eta kostuak murrizteko.

• Batzuetan, baliabideen artean argitalpenak, liburuak eta dokumentuak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

46 UD5: DNA POLIMERASAREN KATE ERREAKZIOAREN (PCR) BIDEZ KLONATZEA ETA ELEKTROFORESI BIDEZ BEREIZTEA

KIMIKA


5. unitate didaktikoa: DNA POLIMERASAREN KATE ERREAKZIOAREN (PCR) BIDEZ KLONATZEA ETA ELEKTROFORESI BIDEZ BEREIZTEA Iraupena: 14 ordu


1. PCRaren teknika ezagutzea: etapak, osagaiak eta haren eraginkortasunean eragina duten faktoreak. 2. Bioteknologiaren azken aurrerapenetan izan duen garrantzia ezagutzea. 3. Aplikazio eta aldaera garrantzitsuenak deskribatzea. 4. Errutinazko PCRak eta PCR kuantitatiboa edo denbora errealekoa bereiztea. 5. DNA PCRaren bidez anplifikatzeko lagina, materialak (bektoreak…) eta erreaktiboak (murrizte-entzimak…) prestatzea. 6. Anplifikazio horretarako tresneria kalibratzea eta mantentzea. 7. DNA sekuentzia jakin bat anplifikatzeko zebadore edo "primer" egokiak hautatzeko irizpideak deskribatzea. 8. Anplifikatutako DNA klonatzeko zebadore espezifikoak diseinatzea. 9. DNA segmentu baten anplifikazioa egitea PCRaren teknikaren bidez.

10. Teknikak lege-esparruan, elikagaienean, osasun-esparruan… dituen hainbat aplikazioren emaitzak interpretatzea. 11. PCRaren produktuak klonatzeko estrategia nagusiak deskribatzea. 12. Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. 13. Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• PCR-rako abiapuntuko lagina (Hainbat jatorritako DNA) prestatzea. • Beharrezkoa den tresneria (termozikladorea) kalibratzea eta mantentzea. • Zebadore espezifikoen diseinuari buruzko suposizio praktikoak ebaztea. • Zebadore horiek anplifikatu beharreko DNAren izaeraren eta geroztiko erabileraren arabera diseinatzea. • DNA zati baten anplifikazioa egitea PCRaren teknikaren bidez. • Anplifikatutako sekuentzia geroztiko erabileraren arabera erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. • Teknikaren aplikazioen emaitzak interpretatzea (auzitegi-genetika, aitatasun-frogak, elikagaien kalitatea…). • Aplikazio horiekin zerikusia duten suposizio praktikoak ebaztea. • Sortutako hondakinak (hondakin biosanitarioak) manipulatzea eta ezabatzea. • Asepsia-jarraibideak eta arrisku biologikoen prebentziokoak aplikatzea.

X X X X

X X X X X X X X X X


KIMIKA


KONTZEPTUZKOAK

• PCRaren teknikaren printzipioak. • Teknikaren etapak eta osagaiak. • Haren eraginkortasunean eragina duten faktoreak. • Zebadore egokiak anplifikatu beharreko sekuentziaren eta haren geroztiko erabileraren arabera diseinatzeko irizpideak. • Teknikaren aplikazio garrantzitsuenak. • Haren modalitateak, abantailak eta eragozpenak • PCRaren produktuak klonatzeko estrategiak.

X

X X X

X X X X X X X

JARRERAZKOAK

• Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Jarduerak garatzeko ekimena eta autonomia izatea. • Segurtasun-arauak, laneko osasunekoak eta ingurumenari dagozkionak errespetatzea. • Ordena, garbitasuna eta metodoa laborategiko oinarrizko eragiketak egitean eta zereginak gauzatzean. • Materiala eta tresneria segurtasunez erabiltzea, errespetatzea eta zaintzea.

X X X X X

X X X X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.



1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11,

1 h X X Irakasleak PCRari eta haren aplikazioei buruzko galdera zehatzak planteatuko dizkie ikasleei, eta horri buruzko adibide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, planteatutako galderei erantzungo diete. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek PCRari, haren aplikazioei eta bioteknologia modernoaren garapenerako duen garrantziari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Proteinen teknikak. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010. Tknika, Vita-Aidelos. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición. Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un


KIMIKA


gen?


1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

10, 11,

1 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, PCRaren teknikari eta haren aplikazioei buruzko kasu praktikoak proposatuko ditu. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


"Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan PCRaren teknikari eta haren aplikazioei buruz argitaratutako artikuluak. DNA PCR bidez anplifikatzeko prozesuaren fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 PCR bidez anplifikatu beharreko DNA sekuentzia espezifikoetarako promotoreak diseinatzeko praktika gidatua.

1, 5, 7, 8 2 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, promotore espezifikoen diseinuari buruzko hainbat galdera eta suposizio praktiko ebatziko ditu. Horretarako, arau hauek kontuan hartuko ditu: Luzera optimoa: 18-25 nukleotido. G+C edukia = % 40-60. Zebadoreen barruan errepikapenak edo sekuentzia palindromoak saihestea, zebadoreak bere buruaren inguruan tolestu ez daitezen (urkilak osatzea). Bi zebadoreen Tm (parekatze-tenperatura, ingelesez “melting temperature”) antzekoa izan behar da. Bi zebadoreen sekuentziak ez dira elkarren osagarriak izan behar. Ikasleak PerlPrimer edo Primer3 bezalako informatika-programak erabiliko ditu, sekuentzia espezifikoetarako zebadoreak diseinatzeko eta haien egokitasuna probatzeko aukera emango diote-eta.

PCR bidez anplifikatu beharreko DNA sekuentzia espezifikoetarako promotoreak diseinatzeko. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko. Informazioaren eta komunikazioaren teknologiak (IKT) jakinda eta zehaztasunez erabiltzea.

PerlPrimer programa eta Interneteko antzeko baliabideak.


KIMIKA


Gainera, zebadorearen sekuentzia espezifikoa den edo beste espezie batzuen DNA ere anplifikatzen duen ("blasteatu") egiazta daiteke. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J3-E3 DNA PCR bidez anplifikatzeko eta anplifikatutako DNAren elektroforesia egiteko praktika gidatua.

1, 4, 5, 6. 9. 12. 13

4 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, DNA PCRaren teknikaren bidez anplifikatuko dute eta gero elektroforesia egingo dute. PCR BIDEZKO ANPLIFIKAZIO ERREAKZIOA Praktika hau egiteko kit komertzial asko daudenez, Perkin-Elmer-en AmpliTaq Gold eta AmpliTaq kitentzako erreakzio-nahasteak eta PCR zikloak deskribatuko ditugu adibide moduan. Erreakzio-nahastea (AmpliTaq Gold eta AmpliTaq) − Milli-Q ur destilatua 66,5 �L. − 10X PCR Buffer II 100 mM 10 �L. − MgCl2 25 mM 10 �L. − 10X dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) − 10 mM 10 �L bakoitzeko. − 100X zebadore 1 100 �M. 1 �L. − 100X zebadore 2 100 �M. 1 �L. − AmpliTaq Gold edo AmpliTaq DNA

Polymerase − 5 U/�l 0,5 �L. − DNA molde (Salmonella typhimurium-en

kromosoma) 25 ng/�L1 �L. Gomendioak: − Erreaktiboak taulako ordenan gehitu,

urarekin hasita.

Ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko eta lan metodikoa, zorrotza, autonomoa eta taldekoa sustatzeko. Erauzitako azido nukleikoak egoki etiketatzeko eta kontserbatzeko.

Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak. PCR-rako hodiak, 0,2 edo 0,5 mL-koak. Termozikladorea. Izotza. Anplifikatu beharreko DNA espezifikoa. Perkin-Elmer-en AmpliTaq Gold eta AmpliTaq kitak (beste asko ere erabil daitezke, betiere dagokion erreakzio-nahastea egiteko argibide espezifikoei jarraitzen bazaie). Aurreko unitate didaktikoetako praktiketan agarosa-geleko elektroforesirako adierazitako materiala.


KIMIKA


− 1,0-4,0 mM-ko [MgCl2] librea gomendatzen da.

− Mantendu [dNTPs] orekatua. − Mantendu [zebadoreak] orekatuta. − Zebadore bakoitzaren 0,2-1,0 �M-ko

kontzentrazioa gomendatzen da. − Kontzentrazio hau gomendatzen da:

helburu DNA > 104 molekula; baina < 1 �g DNA.

Komenigarria da erreaktibo arruntekin ama-nahaste bat prestatzea, ondoren adierazten den moduan (4 laginetarako (X4,2) kasu zehatz honetan): − Ura 279,3 �L. − 10X PCR Buffer II 42 �L. − MgCl2 42 �L. − 10X dNTP 42 �L. − 100X zebadore 1 4,2 �L. − 100X zebadore 2 4,2 �L. − AmpliTaq 2,1 �L. − Molde DNA. Guztira (molde DNArekin): 420 �L. Ikasleek ongi nahasi behar dute erabili baino lehen. Gehitu 100 � 1 = 99 �L 0,5 ml-ko erreakzio-hodi bakoitzeko. Gehitu erreakzio-hodi bakoitzari helburu DNAko disoluzioaren 1 �L. Gehitu olio-tanta bat (25 �L) edo, hobe, tanta bat argizari urtu. Anplifikazio-zikloak (AmpliTaq Gold edo AmpliTaq) Ikasleak ondoren adierazten den moduan programatuko du termozikladorea: Aktibazioa: 1 ziklo, 94 ºC, 10 minutu. Desnaturalizazioa eta hibridazioa eta


KIMIKA


polimerizazioa: 30 ziklo. Desnaturalizazioa: 94 ºC, 1 minutu. Hibridazioa eta polimerizazioa: 72 ºC, 2 minutu. Amaiera: 1 ziklo, 72 ºC, 5 minutu. Itxarotea: giro-tenperatura. Gero, olio-tanta bat gehituko diote kikara bakoitzari (lehorrak baldin badaude). Blokea 94 ºC-tan aurreberotuko dute. PCRa amaitutakoan, hodiak erretiratu eta �20 ºC-tan gordeko dituzte erabili arte. AGAROSA GELEKO ELEKTROFORESIAREN BIDEZKO PCR-AREN PRODUKTUEN ANALISIA (3. unitate didaktikoaren J2-E2 praktikan deskribatua). Ikasleek agarosa-geleko erreakzio-produktuen % 5 (5 �L) analizatuko dute. Horretarako, anplifikatutako produktuen 5 �L gehituko diote 5 �L II motako 2X Ficoll-i. Olioa erabili badute, xurgatuz (ur-ponpa) ezabatuko dute lagina artean izoztuta dagoenean, eta lagina hodi berri batera pasatuko dute. Argizaria erabili badute, aski izango dute argizari-geruza punta batekin zulatzea, puntako argizari-tapoia bota eta egindako zulotik lagina hartzea. Emaitzaren argazkia aterako dute. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak PCRaren eta elektroforesiaren emaitzak.

J4-E4 Legeen eta elikagaien esparruko PCRaren emaitzak interpretatzeko praktika autonomoa.

2, 3, 4, 10 3 h X Ikasleek, binaka, PCRak legeen eta elikagaien esparruetako aplikazio zehatzetan dituen emaitzak eztabaidatu eta interpretatuko dituzte.

PCRa eguneroko bizitzaren hainbat arlotan (epai judizialak, elikagaien kontrola, diagnostiko klinikoa…)

Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Proteinen teknikak. Nafarroako Unibertsitatea.


KIMIKA


Aldez aurretik, adibide moduan, irakasleak ikerketa kriminaleko kasu zehatz bat deskribatuko du. Kasu horretan, profil genetiko nuklearra lortu da, biktimaren eta susmagarrien DNA mikrosatelite nuklearra PCR bidez erauzita eta anplifikatuta, gero sekuentziatzeko eta konparatzeko. Ikasleek, beste hainbat suposizio praktikoren artean, arrain-formako espezieen autentifikazioa (DNA erauztea, b zitokromoaren genearen PCRa, murrizte-entzimekiko digestioa, PCRaren produktuen migrazio elektroforetikoa eta banda-ereduaren behaketa) eta transgenikoen detekzioa (arto- eta soja-hazien DNA erauztea, lektina, zeina, 35S eta NOS geneen PCRa, PCRaren produktuen migrazio elektroforetikoa eta lortutako banden analisia) interpretatu behar dute. Azkenik, talde bakoitzak bere ondorioak azalduko ditu, eta denon artean eztabaidatu eta zuzenduko dituzte, irakaslearen laguntzarekin, bera izango baita ikasleen autoebaluazioaren aholkulari.

aplikatzearen emaitzak modu gogoetatsu eta arrazoituan interpretatzeko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa, autonomoa eta arduratsua sustatzeko.

Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010. Tknika, Vita-Aidelos. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un gen?

J5-E5 PCRaren produktuak klonatzeko estrategiak hautatzeko praktika gidatua.

1, 3, 11 2 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, aurreko praktiketan lortutako PCRaren produktuak (esate baterako, unitate didaktiko honetako J3-E3 praktikan edo egin daitezkeen horren antzekoetan edo aurreko unitate didaktikoko praktiketan) etorkizunean klonatzeko estrategiak hautatuko ditu. Horretarako, plasmido bakoitzaren egitura eta

PCRaren produktuak klonatzeko estrategiak hautatzeko. Aukerak hautatzean gogoeta, zorroztasuna eta zehaztasuna sustatzeko.

Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición.


KIMIKA


osaera eta erabili beharreko murrizte-entzimak ebakitzeko sekuentzia espezifikoak kontuan hartuko ditu. Irakasleak ebaluatuko duen praktikaren txosten tekniko bat egingo dute ikasleek.





OHARRAK

• 3., 4. eta 5. unitate didaktikoek, 6. unitate didaktikoaren sekuentziazioari buruzko atalarekin batera, azido nukleikoen eta, bereziki, DNAren analisi bioteknologikoaren prozedurazko unitate oinarrizkoa osatzen dute, honako alderdi hauetan oinarritua: erauztea, PCR bidezko anplifikazioa, agarosa-geleko elektroforesia, bektore plasmidikoetan klonatzea, zelula konpetenteen transformazioa, klonatutako sekuentzien analisia eta sekuentziazioa. Eskema sintetiko horretan, oinarrizkotzat jotzen ditugu erauzteko teknikak, PCRa, elektroforesia eta transformazioa.

• J2-E2 eta J4-E4 bezalako jarduerak oso garrantzitsuak dira eskuratutako gaitasunei buruz gogoeta egiteko eta teknika bioteknologikoek osasunaren, farmaziaren, nekazaritzako elikagaien, ingurumenaren edo industriaren esparruetan eta esparru judizialean dituzten aplikazioen eta gaitasun haien arteko lotura gogoan erabiltzeko. Garrantzizkoa da prozedurazko aurrerapenen eta horien aplikazio praktikoen arteko harreman estua nabarmentzea, haiek garatzen diren heinean.


54 UD6: AZIDO NUKLEIKOAK SEKUENTZIATZEA ETA TRESNA BIOINFORMATIKOAK MANEIATZEA

KIMIKA


6. unitate didaktikoa: AZIDO NUKLEIKOAK SEKUENTZIATZEA ETA TRESNA BIOINFORMATIKOAK MANEIATZEA Iraupena: 12 ordu


1. Sanger-en dideoxi sekuentziazio-metodoa ezagutzea: beharrezkoak diren biomolekulak, etapak eta erreakzioak. 2. Haren oinarria ulertzea: deoxinukleotidoen eta dideoxinukleotidoen nahaste bat erabiltzea (kate-amaierak). 3. Sekuentziazio automatikoa eta eskuzkoa bereiztea, eta horien abantailak eta eragozpenak identifikatzea. 4. Sekuentziatu beharreko DNA prestatzea, sekuentziazio automatikoko prozesua deskribatzea eta erabil daitezkeen estrategiak adieraztea. 5. DNA zati bat sekuentziatzearen emaitzak analizatzea eta adieraztea. 6. Sekuentziazioaren aplikazioak eta bioteknologiaren garapenean duten garrantzia ezagutzea. 7. Informazio bioinformatikoa lortzeko egin beharreko urratsak ulertzea. 8. DNA eta proteina sekuentzien informazioa lortzeko erabilgarri dauden oinarrizko tresnak ezagutzea (datu-baseak). 9. Bioinformatika saiakuntza bioteknologikoen garapenerako eta analisirako tresna ahaltsua dela ezagutzea.

10. Analisi bioinformatikoko programetan erabiltzen den hizkuntzarekin ohitzea. 11. DNA sekuentziatzeko saiakuntza praktikoak abiapuntutzat hartuta lortutako emaitzak aztertzea. 12. Biologia molekularreko saiakuntza bioteknologikoetan maiz erabiltzen diren tresna bioinformatiko batzuk identifikatzea. 13. Delituei irtenbidea aurkitzeko eta aitatasun biologikoa diagnostikatzeko DNAren sekuentziazioaren aplikazioak eta erabilgarritasuna ezagutzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Sekuentziatu beharreko DNA (PCR banda edo plasmido birkonbinatua) sekuentziatzeko prestatzea. • Sekuentziadore baten osagaiak eta haren funtzionamendua ezagutzea. • Sekuentziatu beharreko laginak erregistratzea, etiketatzea eta kontserbatzea. • DNA zati bat sekuentziatzearen emaitzak adieraztea eta analizatzea. • Sekuentziazio-tekniken aplikazioak eta haien aplikagarritasuna ezagutzea. • Hainbat datu-base eta analisi bioinformatikoen programak abiapuntutzat hartuta informazio bioinformatikoa lortzea. • DNA edo proteina zatien murrizteguneen mapak eraikitzea. • Profil genetikoak eta aitatasun biologikoaren frogak eginda lortutako emaitzak aztertzea. • Jatorri ezezaguneko sekuentziak abiapuntutzat hartuta eta azterketa filogenetikoak eginda organismoak identifikatzea. • Azido nukleikoak manipulatzerakoan biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzea.

X X

X X X X X X X X X X


KIMIKA


KONTZEPTUZKOAK

• DNA Sanger-en dideoxi metodoaren bidez sekuentziatzeko beharrezkoak diren osagaiak, etapak eta erreakzioak. • Sekuentziazio automatikoaren eta eskuzkoaren arteko desberdintasunak, horien abantailak eta eragozpenak identifikatuta. • DNA sekuentziatzeko tekniken aplikazioak. • Informazio bioinformatikoa lortzeko printzipioak, irizpideak eta etapak, eta analisi bioinformatikoen programen maneiua. • Lortutako sekuentziak tratatzeko tresna nagusien ezaugarriak. • Aitatasun biologikoaren frogak eta profil genetikoak egiteko irizpideak. • Organismoak genetikoki identifikatzeko eta azterketa filogenetikoak egiteko printzipioak.

X X

X

X X X X X X X

JARRERAZKOAK

• Ordena, garbitasuna eta metodoa lanak egitean. • Jarduerak garatzeko ekimena eta autonomia izatea. • Materiala eta tresneria segurtasunez erabiltzea, errespetatzea eta zaintzea. • Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Segurtasun-arauak, laneko osasunekoak eta ingurumenari dagozkionak errespetatzea.

X X X X X

X X X X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.



1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13

1 h X X Irakasleak azido nukleikoen sekuentziazioari eta teknika bioinformatikoei buruzko galdera zehatzak planteatuko dizkie ikasleei, eta horri buruzko adibide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, planteatutako galderei erantzungo diete. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek azido nukleikoen sekuentziazioari, haren aplikazioei eta bioinformatikari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Analisi bioteknologikoaren ikastaroa. 2010eko otsaila. Zientzia eta Teknologia Fakultatea. Euskal Herriko Unibertsitatea. Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010eko azaroa. Tknika, Vita-Aidelos. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Kordobako Unibertsitateko Biokimikako eta Biologia Molekularreko Sailaren Bioinformatikako Jardunbideen Protokoloa. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª


KIMIKA


Edición.


1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13

1 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, azido nukleikoen sekuentziazioari eta bioinformatikari eta haien aplikazioei buruzko kasu praktikoak proposatuko ditu. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un gen? "Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan sekuentziazioari eta bioinformatikari buruz argitaratutako artikuluak. DNA sekuentziatzeko prozesuen fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Sekuentziatzeko DNA bat prestatzeko praktika gidatua.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 11

3 h X X Ikasleek, irakaslearen gidaritzapean, sekuentziatzeko DNA bat (PCR banda edo plasmidoa) prestatuko dute. Horretarako, erabiliko duten kit komertzialaren osagaiak (kasu honetan, ABI-Prism-en DNA sekuentziatzeko kit bat) hodi batean konbinatuko dituzte, ondoren adierazten den moduan: − Premix dRhodamine Terminator 1 �L. − Sekuentziazio-indargetzailea 5X 1 �L. − Molde DNA (100-200 ng) 2,5 �L. − "Primer" edo zebadorea 10 mM 0,5 �L. Gero, parametro hauekin programatuko dute termozikladorea: − 1 ziklo, 94 ºC, 3 minutu. − 40 ziklo: 94 ºC eta 10 segundo, 50 ºC eta

5 segundo, eta 60 ºC eta 4 minutu.

Sekuentziatzeko DNA zati bat (plasmidoa edo PCR banda) prestatzeko. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko. Azido nukleikoak manipulatzerakoan biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzeko.

Mikropipetak eta erabili eta botatzeko puntak. Eppendorf hodiak, 1,5 mL-koak. PCR-rako hodiak, 0,2 mL-koak. Bi hodi motetarako tentegailuak. ABI-Prism-en DNA sekuentziatzeko kita: "DNA sequencing Kit. dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction". Sekuentziatu beharreko DNA (PCR banda garbia edo plasmido birkonbinatu garbia). Izotza, erreakzioak hotz mantentzeko. Etanol absolutua. Mikrozentrifugagailua. Termozikladorea. Sekuentzia nukleotidikoak bakarka analizatzeko tresna bioinformatikoa: Chromas


KIMIKA


− 1 ziklo: 4 ºC eta iraupen mugagabea. Sekuentziazio-erreakzioan eta lagina prestatzerakoan gehitu ez diren markatutako dideoxi nukleotidoak (Premix-ean barne hartuak) ezabatu ondoren, hodi bakoitzari 50 �L etanol absolutu gehituko diote, �20 ºC-tan inkubatuko dute 30 minutuz, eta 13.000 bira minutuko abiaduran zentrifugatuko dute. Zentrifugatu ondoren, gainjalkina ezabatu eta lehortzen utziko dute. Gero, erreakzio-hodi bakoitzari 20 �L formamida desionizatu gehituko diote eta laginak desnaturalizatu egingo dituzte, 5 minutuz 95 ºC-tan berotuta. Horrela, sekuentziadore automatiko batean analizatzeko prest egongo dira. Sekuentziazio-saiakuntzak tresneria automatizatuan egiten direnean, fitxategiak programa ugarirekin ireki daitezke, ordenagailuaren sistema eragilearen arabera. Windows-erako gehien erabiltzen denetako bat Chromas da. Programa horrek aukera ematen du, besteak beste, sekuentzia bi noranzkoetan ikusteko, grafikoa handitzeko edo konprimitzeko, base bakoitzari koloreak aplikatzeko eta sekuentzia osagarria behatzeko. Normalean laborategian sekuentziazio-prozesua gauzatzeko horrelako aparaturik izaten ez denez, birtualki azaldu beharko litzateke, edo prozesua egin ohi duen esparru teknologikoko enpresaren batekin lankidetzan

(www.technelysium.com.au/chromas.html). Enpresa bioteknologiko laguntzailea.


KIMIKA


jardunez. Esate baterako, bisitaldi bat edo erakustaldi praktiko bat antola daiteke haren egoitzetan. Azkenik, praktiketako talde bakoitzak sekuentziazioaren emaitzak aztertu eta eskuzko prozedura eta prozedura automatikoa konparatuko ditu, eta bakoitzaren abantailak eta eragozpenak adierazi. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.

J3-E3 Geneak eta proteinak bilatzeko, horiek kromosometan lokalizatzeko, organismoak identifikatzeko eta azterketa filogenetikoak egiteko praktika gidatua.

7, 8, 9, 10, 11, 12

4 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, bioinformatikako hainbat ariketa egingo dituzte: AZIDO NUKLEIKOAK Gene-sekuentzia bilatzea eta biltegiratzea. Horretarako, Bioteknologiaren Informaziorako Zentro Nazionalaren (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) datu-basea erabiliko dute: www.ncbi.nlm.nih.gov. Bertan dago munduko sekuentzia biologikoen bankurik handiena, GenBank deritzona. Ikasleek honakoen geneen sekuentziak bilatu eta gordeko dituzte: − Hormona somatotropoarenak. − Influenza A H1N1 birusaren

nukleokapsidearen proteinarenak. − Bacillus anthracis bakterioaren rRNAren

16S eskualdearenak. Sekuentzia bilatzeko, "parcial sequence"

Datu-base bioinformatikoetan gene- eta proteina-sekuentziak bilatzeko. Informatika-tresnak aplikatuta kromosometan geneak lokalizatzeko. Sekuentzia, egitura eta funtzio proteikoak identifikatzeko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa, autonomoa eta arduratsua sustatzeko. Ebatzitako suposizio bioinformatikoen emaitzak modu gogoetatsu eta arrazoituan interpretatzeko.

Informatika-gela, multimedia-gela edo mediateka, web-orri hauek erabiltzeko: − www.ncbi.nlm.nih.gov − www.ncbi.nlm.nih.gov/projets/geno

me/guide − www.ncbi.nlm.nih.gov/

genomes/lproks.cgi − www.ncbi.nim.gov/genomepri − www.embl.org − www.ddbj.nig.ac.jp − srs.ebi.ac.uk − www.justbio.com − www.expasy.org/spdbv − www.pdb.org − www.uniprot.org Beharrezkoak diren programa bioinformatikoak: ClustalX programa. TreeView programa. SeaView programa.


KIMIKA


idatziko dute bilaketan, genoma osoak bilatzea saihesteko. Aurkitzen dutenean, ikasleek "testu-dokumentua" izan behar duen fitxategi batean gordeko dute (.txt luzapena) eta honela idatziko dute: >erreferentzia_eta_organismoaren_izena Azpian DNA sekuentzia kopiatuko dute (FASTA formatuan, hau da, sekuentzia osoa jarraian) eta FASTA formatu horretan gordeko dute (display settings, Fasta Apply aukera). Ikasleek beste zenbait web orritan ere bila ditzakete sekuentziak: Europako Biologia Molekularreko Laborategia (EMBL): www.embl.org Japoniako DNAren datu-bankua (DDBJ): www.ddbj.nig.ac.jp Sekuentziak berreskuratzeko sistema (sequence retrieval system): srs.ebi.ac.uk Kromosometan geneak lokalizatzea. Suposizio praktiko honetan, ikasleek NCBIren helbide hau erabiliko dute: www.ncbi.nlm.nih.gov/projets/genome/guide. Ikasleak, lehenik, b zitokromoaren genea lokalizatuko du DNA mitokondrialean eta EGFL6 giza genomaren X kromosoman. Horretarako, lehenengo Human Build 37.1 (Map viewer) hautatuko du, kromosomak eta taxonomia osoa behatuta. Ondoren, horietan klik egin eta dauzkaten geneak bistaratuko ditu. Gero, MT estekaren bitartez, DNA mitokondrialaren azterketan sartuko da, eta, "Markers" markatzailearen bitartez, 'cytochrome' idatzita, zehatz-mehatz lokalizatuko du b zitokromoa DNA mitokondrialean. Gainera, CYTB aukeran klik


KIMIKA


eginda, DNA horren zein lekutan dagoen ikusi ahal izango du. Ondoren, "Cromosoma X" aukeran sartuko da eta EGFL6 genea eta haren lokalizazioa ikusiko du. Azkenik, EGFL6 aukeraren gainean klik egin eta NCBIn gene horri buruz dagoen informazio guztia lortuko du. Bigarrenik, ikasleak erlearen kromosomak lokalizatuko ditu (Honey bee edo Apis mellifera), eta klik egingo du geneak behatzeko. Azkenik, www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi helbidean Escherichia coli 536 bakterioa bilatu eta 58531 zenbakia hautatuko du, gainean klik eginda. Gero, bakterio-genomaren maparen gainean egingo du klik. Ondoren, RNAri dagozkion geneak hautatuko ditu (Features: Structural RNAs: 103). Ikus dezakeenez, taula horretan beste bakterio-gene batzuk ere kontsulta ditzake. Gero, "ribosomal RNA" genea lokalizatuko du eta sekuentzia FASTA formatuan irekiko du. Horretarako, eskuin-eskuinean dagoen "Links" zutabeko erronbo laranja-kolorean egingo du klik. Organismoak jatorri ezezaguneko sekuentziak abiapuntutzat hartuta identifikatzea. Ariketa honetan, NCBIren web orriko baliabideekin jarraituz, sekuentzien arteko antzekotasunak bilatzen dituen eta geneak eta horien ezaugarriak identifikatzeko gauza den BLAST programa erabiliko du ikasleak. Horretarako, BLAST eta Basic BLAST: nucleotide blast hautatuko du, lokalizatu


KIMIKA


beharreko sekuentzia testu-eremuan sartuta: Enter Query Sequence; enter accesion number, gi, or FASTA sequence. Gero, Choose Search Set: Database: Others hautatuko du. BLAST hautatuta, programak adieraziko du zein espeziek duen izateko probabilitaterik handiena eta zein ehunekotan datorren bat NCBIren datu-baseetako sekuentziekin. Azterketa filogenetikoa. Suposizio praktiko honetan, hainbat espezieren artean dagoen erlazio filogenetikoa aztertuko dute ikasleek. Horretarako, "sekuentzia ezezagunak" fitxategia aldatu behar dute, eta "identifikatutako sekuentziak.txt" izenarekin gorde. Sekuentzia horien gainean, aurreko ariketan identifikatutako sekuentzien izenak aldatuko dituzte (adibidez: >sekuentzia_1 kendu eta >Bos_taurus jarri), oraingoan "identifikatutako sekuentziak.txt" fitxategia erabilita. Lehenik, talde bakoitzak sekuentziak lerrokatu egingo ditu. Horretarako, ClustalX programa irekiko du (FILE: Load sequences), baita "identifikatutako sekuentziak.txt" fitxategia ere. Aukera horrekin fitxategia irekita geratuko da eta markatutako baseak ikus daitezke, bakoitza kolore batekoa. ALIGNMENT: Do complete alignment. Sekuentziak lerrokatzeko balio du. TREES: Draw tree. Sortzen den fitxategia ikusteko ikasleak bi aukera ditu: − Sortutako "identifikatutako sekuentziak.ph"

fitxategia zuzenean irekitzen saiatzea (fitxategi horiek Clustal programarako


KIMIKA


erabili dugun .txt fitxategia biltegiratuta dagoen leku berean sortu eta gordetzen dira).

− TREEVIEW programa irekitzea eta fitxategiak irekitzea (File: Open). Irekitzean, ".dnd" eta ".ph" motako fitxategiak bistaratzea eta, zehazki, sortutako fitxategia bilatzea, hots: "identifikatutako sekuentziak.dnd" edo "identifikatutako sekuentziak.ph" (fitxategi horiek Clustal programarako erabili dugun .txt fitxategia biltegiratuta dagoen leku berean sortu eta gordetzen dira).

Zuhaitz filogenetikoa behatzeko, bai filograma bai irudikapen erradiala, ikasleak TREE: phylogram eta TREE: radial aukeretara joko du. Azkenik, irudikapen horren arabera, talde bakoitzak ondorioztatuko du zein espezie dauden filogenetikoki hurbilen. JustBio webgunean (www.justbio.com), ikasleak ORF Viewer tresna erabil dezake DNAn irakurketa irekiko sekuentziak identifikatzeko. Webgune berean erabiltzeko moduan ditu, halaber, Aligner deritzona, DNA sekuentzia bi edo gehiago lerrokatzen dituena, edo Complementor tresna, DNA molekula baten sekuentzia osagarria zehazten duena. PROTEINAK Ikasleak hainbat proteina batera analizatuko ditu proteinak homologiaz modelatzeko Swiss-PdbViewer tresna bioinformatikoaren bitartez (www.expasy.org/spdbv). Programa Swiss Institute of Bioinformatics-SIB, Glaxo SmithKline


KIMIKA


R&D eta Basileako Biozentroko Bioinformatika Estrukturaleko Taldearen Swiss-Model zerbitzariari loturik dago. JustBio webgunean (www.justbio.com), Translator tresnak DNA molekula batetik proteinarako itzulpena egiten du, eta PatSearch tresnak proteina ezagunekiko patroi komunak dituzten eskualde proteikoak identifikatzen ditu. Azkenik, ikasleek erabilgarri dute PDB (www.pdb.org) proteinen datu-bankua, erresonantzia magnetiko nuklearraren espektroskopia bidez edo X izpien kristalografia bidez esperimentalki zehaztutako proteinen hiru dimentsioko egiturak biltzen dituen datu-basea. Proteinen baliabide unibertsala biltzen duen UniProt webgunea ere kontsulta dezakete (www.uniprot.org), proteina-sekuentziei eta horien funtzioei buruzko informazio ugari aurkituko dute-eta. Ebatzitako suposizio bioinformatikoen emaitzak irakasleak koordinatuko duen bateratze-lanean partekatu eta konponduko dituzte. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak emaitzak.

J4-E4 Profil genetiko nuklearrak eta aitatasun biologikoaren diagnostikoa interpretatzeko praktika gidatua.

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13

2 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, aztertutako profil genetiko nuklearren eta analizatutako aitatasun-diagnostikoen emaitzak eztabaidatu eta interpretatuko dituzte. Profil horiek gaixotasun bakar batekin ere erlazionatuta ez dauden eta oso aldakorrak diren giza genomaren eskualdeak aztertzen dituzte, hala nola DNA mikrosatelitearenak, non

Burututako profil genetikoen eta egindako aitatasun biologikoaren frogen emaitzak modu gogoetatsu eta arrazoituan interpretatzeko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa, autonomoa eta arduratsua sustatzeko.

Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010. Tknika, Vita-Aidelos. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. Investigación y


KIMIKA


tandem moduan errepikatutako baseak (STR) agertzen baitira, hau da, 2 eta 6 pb bitarteko errepikapen-unitateak (adibidez: GATA, TATA… 300.000 loci mikrosatelite tetranukleotidiko daude). Auzitegi-genetikan, birkonbinatzen ez diren eta ondorengoei denak batera transmititzen zaizkien STRak erabili ohi dira. Profilak lortzeko, DNA erauzi egiten da, PCR bidez anplifikatu, sekuentziatu eta tamainaren arabera bereizten da. Ondoren, errepikatutako STR sekuentzien irudikapen grafikoak lortzen dira, elektroferograma izenekoak, eta horiek interpretatuta, susmagarriak identifika daitezke ikerketa kriminaletan edo aitatasun biologikoak zehaztu. Ikasleek, taldeka, hainbat elektroferograma aztertuko dituzte, LR balioa kalkulatzeko (probabilitate indizea edo likelihood, ingelesez) eta, horrela, hilketa-lekuan aurkitutako aztarna DNA susmagarriarena izateko probabilitatea zenbaterainokoa den zehazteko, kasu horretan erreferentziako 13 markatzaile erabilita (FBIk biztanleria kaukasoide estatubatuarrarentzat erabiltzen dituenak). Horrez gain, aitatasun biologikoaren diagnostikoari dagokionez, aitatasun-indizea (AI) eta aitatasun-probabilitatea (pA) kalkulatuko dute. pA-ren balioa ona dela irizten zaio, ehuneko hainbestetan, > 0,9999 denean. Azkenik, talde bakoitzak bere ondorioak azalduko ditu, eta denon artean eztabaidatu eta

Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un gen? Euskal Herriko Unibertsitatearen DNA Bankua. Biomics Research Group.


KIMIKA


zuzenduko dituzte, irakaslearen laguntzarekin, bera izango baita ikasleen autoebaluazioaren aholkulari.





OHARRAK

• J2-E2 jarduerari dagokionez, sekuentziadore automatikoa zikloaren OCDan jasotzen den ekipamendua ez denez, oso komenigarria izan daiteke ikastetxeak enpresa bioteknologiko baten lankidetza bilatzea, ikasleek aukera izan dezaten, aldez aurretik hitzartutako bisitaldi tekniko batean, sekuentziadorea ikusi eta nola funtzionatzen duen jakiteko, horrela hobeto interpretatu ahal izango baitituzte ikasgelan aparatuari dagozkion erregistro grafikoak.

• J3-E3 eta J4-E4 jarduerak egiteko ezinbestekoa da Internet konexio on batez hornitutako informatika-gela izatea. Komeni da, gainera, bi jarduerak gauzatzeko lan-egoera eta kasu errealetatik ahalik eta hurbilen dauden adibideak eta suposizioak erabiltzea, ikasleek uler dezaten teknika hauek gero eta garrantzitsuagoak direla hainbat esparrutako laborategietan egin ohi diren analisietan.

• Noiz edo noiz, baliabideen artean dokumentuak, liburuak, argitalpenak eta Internet helbideak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

66 UD7: LANDARE JATORRIA, MIKROBIO JATORRIA ETA JATORRI ANTROPIKOA DUTEN AGENTE TOXIKOAK ETA MUTAGENOAK EZAUGARRITZEA

KIMIKA


7. unitate didaktikoa: LANDARE JATORRIA, MIKROBIO JATORRIA ETA JATORRI ANTROPIKOA DUTEN AGENTE TOXIKOAK ETA MUTAGENOAK EZAUGARRITZEA Iraupena: 12 ordu

IE3: Mikroorganismoak eta proteinak identifikatzen ditu saiakuntza immunologikoak eta genetikoak aplikatuta. IE4: Agente toxikoak eta mutagenoak identifikatzen ditu toxikotasuneko eta mutagenesiko saiakuntzak aplikatuta. Ikaskuntzaren helburuak:

1. Toxina natural nagusiak, landare- eta mikrobio-jatorrikoak, haien osaera eta ondorioak ezagutzea. 2. Antibiograma bat egitea eta kontzentrazio minimo inhibitzailea zehaztea. 3. Toxina antropogeno nagusiak, horien osaera, elika-katean sartzeko bideak eta hori saihesteko neurriak ezagutzea. 4. Agente genotoxikoa, mutagenoa eta teratogenikoa bereiztea. 5. Mutazioen printzipioak eta toxikotasunaren eta mutagenotasunaren ebaluazioarenak ulertzea. 6. Mutazio mota nagusiak ezagutzea eta bereiztea. 7. Agente mutageno kimiko, fisiko eta biologiko nagusiak deskribatzea. 8. DNA konpontzeko mekanismoak ezagutzea. 9. Genotoxikotasuneko/mutagenotasuneko saiakuntza erabilienak deskribatzea.

10. Salmonella typhimurium bakterioko atzeranzko mutazioaren saiakuntzaren edo Ames-en testaren oinarri biologikoa ezagutzea eta haren urratsak identifikatzea. 11. Ames-en testa egitea eta lortutako emaitzak aztertzea. 12. Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. 13. Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Antibiograma bat egitea. • Kontzentrazio minimo inhibitzailea zehaztea. • Landare-toxikoak, mikrobiarrak eta antropogenoak elika-katean sartzeko prozesuak aztertzea. • Genotoxikotasuneko/mutagenotasuneko saiakuntzen aplikagarritasuna aztertzea. • Salmonella typhimurium bakterioko atzeranzko mutazioaren saiakuntzaren edo Ames-en testaren fluxu-diagrama bat egitea. • Ames-en testa egiteko beharrezkoak diren saiakuntzako substantzia, hazkuntza-ingurunea eta erreaktiboak prestatzea. • Adierazitako testa egitea. • Lortutako emaitzak aztertzea eta interpretatzea. • Asepsia-baldintzak identifikatzea eta kutsadura gurutzatuak saihestea. • Arrisku biologikoen aurreko prebentzio-jarraibideak aplikatzea, eta sortutako hondakinak behar bezala kudeatzea.

X X X X X X

X X

X X X X X X X X X X


KIMIKA


KONTZEPTUZKOAK

• Landare- eta mikrobio-jatorriko toxina natural nagusien osaera eta ondorioak. • Toxina antropogeno nagusiak: osaera, elikagaietan sartzeko bideak eta hori saihesteko neurriak. • Agente genotoxikoaren, mutagenoaren eta teratogenikoaren arteko desberdintasunak. • Mutazio mota nagusien ezaugarriak eta haien arteko desberdintasunak. • Agente mutageno kimiko, fisiko eta biologikoen propietateak eta jardunbideak. • DNA konpontzeko mekanismoak. • Genotoxikotasuneko/mutagenotasuneko saiakuntza erabilienak.

X

X

X X X X X X X

JARRERAZKOAK

• Biosegurtasuneko arauak, laneko osasunekoak eta ingurumena babestekoak aplikatzea, bereziki mikroorganismo patogenoak (Salmonella typhimurium…) manipulatzean.

• Ordena, garbitasuna eta metodoa laborategiko oinarrizko eragiketak egitean, lan-prozedura normalizatuei jarraiki eta laborategiko jardunbide egokiak betez.

• Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Ekimena eta autonomia izatea.

X X X X

X X X X



Helburu inplikat.

D Ir. Ik.



1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

1 h X X Irakasleak landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxiko eta mutagenoei buruzko galdera zehatzak planteatuko dizkie ikasleei, eta horri buruzko adibide batzuk emango dizkie. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, planteatutako galderei erantzungo diete. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxiko eta mutagenoei eta haien ezaugarritzeari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010eko azaroa. Mutagenesia. Tknika, Vita-Aidelos. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Agente toxikoen eta mutagenoen identifikazioa. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª


KIMIKA


Edición.


1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10

1 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, ezagutzen dituen agente toxiko eta mutagenoen eta haiek elikagaien eta gizakien gainean dituzten ondorioen adibideak proposatuko ditu. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010eko azaroa. Mutagenesia. Tknika, Vita-Aidelos. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Agente toxikoen eta mutagenoen identifikazioa. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. "Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxiko eta mutagenoei buruz argitaratutako artikuluak. Mutagenotasuneko saiakuntzen fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Antibiograma bat egiteko eta kontzentrazio minimo inhibitzailea kalkulatzeko praktika gidatua.

2, 5, 12, 13

3 h X X Ikasleek, irakaslearen gidaritzapean, antibiograma bat egingo dute eta kontzentrazio minimo inhibitzailea (KMI) kalkulatuko dute. Ikasleek, binaka, antibiograma bat egingo dute, hots, mikroorganismo batek zenbait antibiotikoren aurrean zer sentikortasun duen neurtzea ahalbidetzen duen laborategiko prozedura. Horretarako, ikasleek metodo estandarizatu bat erabiliko dute, agarreko difusio-test deritzona,

Antibiograma bat egiteko. Kontzentrazio minimo inhibitzailea kalkulatzeko. Bakterio-anduiak manipulatzerakoan biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzeko. Zorroztasun-, metodo-, ordena- eta garbitasun-ohiturak garatzeko.

Müeller-Hinton (pH 7,2-7,4) hazkuntza-ingurunea (edo agar elikagarri bat). Micrococcus luteus bakterioaren kultura. Inkubazio-labea. Hainbat antimikrobiar (fosfomizina, sulfisoxazole, kloranfenikol, tobramizina, piperacillin…). Matxarda esterila. Antimikrobiarren diluzio seriatuak.


KIMIKA


National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) erreferentziako laborategiak deskribatua, Kirby-Bauer metodo jatorrizkoan oinarritzen dena. Talde bakoitzak Müeller-Hinton agarra (pH 7,2-7,4) edo agar elikagarri bat erabiliko du hazkuntza-ingurune gisa, 4-6 mm-ko lodierakoa. Micrococcus luteus bakterioaren inokulu bat erabiliko du, 108 unitate kolonia-eratzaile (uke)/mL-koa gutxi gorabehera, aerobiosian inkubatuko du 37 ºC-tan eta 18-24 ordu barru irakurriko du. Ikasleak antimikrobiar hauek erabiliko ditu:

• Fosfomizina 50 mcg (FO50): peptidoglikanoaren sintesiaren lehenengo urratsetariko bat inhibitzen du.

• Sulfisoxazole 300 mcg (G300): azido folikoaren sintesia inhibitzen du, mikroorganismoak ugaltzeko ezinbestekoa.

• Kloranfenikol 30 mcg (C30): Proteinen sintesia inhibitzen du.

• Tobramycin 10 mcg (TM10): Proteinen sintesia inhibitzen du.

• Piperacillin100 µp (PRL 100): zelula-paretaren sintesia inhibitzen du.

Antibiotikoak dituzten diskoak inokulatutako agarraren azalaren gainean jarriko ditu matxarda esterilarekin, leunki sakatuta, eta aerobiosian inkubatuko du 37 ºC-tan eta 18-24 ordu barru irakurriko du. Azkenik, plaka bakoitza aztertu eta inhibizio-


KIMIKA


zonen diametroak neurtuko ditu. Inhibizio-haloa antimikrobiarraren ekintzarekiko proportzionala da. Antimikrobiarren inhibizio-haloak interpretatzeko, ikasleak NCCLS laborategiaren taulak erabiliko ditu. Taula horietan antimikrobiar baten halo bakoitzaren diametroa (mm-tan), kontzentrazio jakin batean, hiru emaitza posibleetariko bakoitzarekin erlazionatzen da:

• Sentikorra: ohiko dosietan agente antimikrobiarra eraginkorra da.

• Tartekoa: dosia handitu egin behar da.

• Erresistentea: agente antimikrobiarra ez da eraginkorra.

Azkenik, kontzentrazio minimo inhibitzailea kalkulatuko du: bakterio-anduiaren garapena inhibitzeko gai den kontzentraziorik txikiena (g/mL-tan adierazia). Ikasleek agente antimikrobiarrak organismo puru bakartuaren kantitate estandarizatu batekin batera diluituko dituzte, 18-24 orduz inkubatu, eta behaketapean utziko dituzte bakterioen hazkundea garatu arte. Hazkundea inhibitzeko beharrezkoa den antimikrobiarraren kantitate minimoak emango du kontzentrazio minimo inhibitzailea. Amaitzeko, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren emaitzak.


KIMIKA


J3-E3 Elikagaien segurtasunari eta mutagenesiari buruzko suposizio praktikoak ebazteko praktika gidatua.

1, 3, 4, 5, 6, 7, 8

3 h X X Ikasleek, irakaslearen gidaritzapean, elikagaien segurtasunarekin eta mutagenesiarekin zerikusia duten suposizio praktikoak ebatziko dituzte. Ikasleak gogoeta egin, aztertu eta konponbideak eta hautabideak proposatuko ditu kutsadura naturala eta antropogenoa aztergai duten hainbat kasutarako: Bakterio-toxinen ondoriozko kutsadura. Mikotoxinen presentzia. Animalia-jatorriko elikagaiak lortu aurreko zuzeneko kutsadura (esate baterako, xenobiotikoak erabiltzea). Fabrikazio-prozesuetako kutsadura (nitrosaminak, hidruro aromatiko poliziklikoak, amina heteroziklikoak…). Ingurumen-kutsatzaile kimikoak (dioxinak, pestizidak, metal astunak…). Halaber, mutazio geniko eta kromosomikoei buruzko hainbat ariketa ebatziko ditu, baita agente fisiko, kimiko eta biologikoei, DNA konpontzeko mekanismoei, zahartzeari eta minbiziari buruzkoak ere. Azkenik, ikasle bakoitzak profil antioxidatzailea ebaluatzeko test bat egingo du. Gogoeta egin eta taldean eztabaidatu ondoren, irakasleak gidatuko duen bateratze-lana egingo dute ideiarik garrantzitsuenak ateratzeko eta

Elikagaien segurtasunari eta mutagenesiari buruzko suposizio praktikoak ebazteko. Autonomia eta erantzukizuna. Ordena, zorroztasuna eta metodoa. Parte-hartzea, koordinazioa eta talde-lana.

Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010eko azaroa. Tknika, Vita-Aidelos. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. "Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan landare-jatorria, mikrobio-jatorria eta jatorri antropikoa duten agente toxiko eta mutagenoei, mutazio geniko eta kromosomikoei, agente mutageno fisiko, kimiko eta biologikoei, zahartzeari, mutazioei eta minbiziari buruz argitaratutako artikuluak.


KIMIKA


orain arte aurreko unitate didaktikoetan ikusitakoarekin erlazionatzeko.

J4-E4 Salmonella typhimurium bakterioko atzeranzko mutazioaren saiakuntza edo Ames-en testa egiteko praktika gidatua.

4, 5, 9, 10, 11, 12, 13

3 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, Salmonella typhimurium bakterioko atzeranzko mutazioaren saiakuntza edo Ames-en testa egingo du. Oinarri teorikoa His genean mutazio bat (His -) duten S. typhimurium bakterioaren anduiak hartzen dira abiapuntutzat (ez dira hazten histidina duten inguruneetan). Bakterioak elementu jakin batekin tratatu ondoren, His + duten atzeragarrien maiztasuna espero zena baino handiagoa bada, saiatutako konposatua genotoxikoa da. Saiakuntzaren eskema Ames-en testa egiteko gutxienez Salmonella typhimurium bakterioaren lau leinu erabiltzen dira. Sisteman kontrol positiboko plaka bat, kontrol negatiboko bat, bakterioak kontrolatzeko beste bat eta fenotipoa egiaztatzeko beste bat sartzen dira. Produktuaren efektua aktibitate metabolikoarekin eta aktibitate metabolikorik gabe ebaluatzen da. Saiakuntza bakoitzean produktuaren hainbat dosi probatzen dira (gutxienez bost), subtoxikoak guztiak. Saiakuntza egin ondoren, plakak 37 ºC-tan inkubatzen dira 48 orduz, ikus daitezkeen koloniak agertu arte.

Salmonella typhimurium bakterioko atzeranzko mutazioaren saiakuntza egiteko. Parte hartzeko lana, antolatua eta metodikoa, autonomoa eta arduratsua sustatzeko. Lortutako emaitzak modu gogoetatsu eta arrazoituan interpretatzeko.

5 mL-ko 44 hodi. Metxeroa. Ingurune minimoko 43 plaka. Ingurune osoko plaka bat. Ur-bainua 48 ºC-tan. Dosifikagailua. Pipetak eta mikropipetak. Vortex. Labea. Argi ultramoreko irradiagailua. Aztertu beharreko produktua. H2O esterila. Sodio fosfato disoluzio indargetzailea (PBS). S9 nahaste estenporaneoa. TA98, TA100, TA102, TA1535 eta TA 1537 leinuen kultura esponentzialak. Agar biguna. Histidina/Biotina disoluzioa. Kristal-morea. Anpizilina. Tetraziklina.


KIMIKA


Testa egitea Ikasleek plakak oinarriaren alboan markatu eta ordenatuta jarriko dituzte labean. Jario laminarreko kabinan edo metxerotik hurbil, material guztia esterilizatuta dutela, tentegailuan ordenan ezarrita dituzten hodiei osagai hauek gehituko dizkiete adierazitako ordenan: • Aktibazio metabolikorik gabe: − 0,5 mL sodio fosfato disoluzio

indargetzaile (PBS). − 100 µL bakterio-kultura. − Produktuaren kontzentrazio bakoitzaren

50 µL (0,25, 1,25, 2,5, 5 eta 10 µg konposatuaren plaka bakoitzeko).

• Aktibazio metabolikoarekin: − 0,5 mL S9 nahaste (zitokromo P450

sistema entzimatikoan aberats diren ehunetatik lortutako prestakin entzimatikoak, genetikoki aktibo ez diren substantziak metabolikoki aktibatu eta genotoxiko bihur ditzaketenak) % 10ean.

− 100 µL bakterio-kultura. − Produktuaren kontzentrazio bakoitzaren

50 µL (0,25, 1,25, 2,5, 5 eta 10 µg konposatuaren plaka bakoitzeko).

Kontrol negatiboetarako produktuaren ordez H2O bolumen bera erabiliko dute, eta positiboetarako halakotzat funtzionatzen duen produktua gehituko dute. Ikasleek hodi guztiak ongi irabiatuko dituzte vortexean eta 15 minutuz inkubatuko dituzte 37 ºC-tan. Gero, 2 mL agar bigun gehituko diote hodi bakoitzari, vortexean irabiatu eta, garreztatu


KIMIKA


ondoren, labetik atera berri dituzten plaketan isuriko dituzte denborarik galdu gabe. Metxerotik hurbil lan egingo dute une oro. Agarra solidotzen denean plakak labean sartuko dituzte 37 ºC-tan, buruz behera jarrita, eta 48 orduz inkubatuko dituzte. Puntu kritikoak Plakak 37 ºC-tan berotu haien gainean agar biguna 48 ºC-tan isuri baino lehen. Tenperatura-diferentzia handiago batek agarra hedatu baino lehen solidotzea eragingo luke. Erabili behar direnean ateratzen dira labetik. Agar biguna ongi hedatu plaken gainean. Gainazal guztiz horizontal baten gainean ezarri. Behar den denbora itxaron (20-30 minutu), agarra solidotzea lortzeko, plakak labean alderantziz sartu baino lehen. Jario laminarreko kabinan lan egin hodiak prestatzeko eta metxeroaren ondoan plakak ereiteko. Erreaktiboak dituzten hodiak eta ontziak ahalik eta denbora laburrenean eduki irekita. Lan-denbora ordena logikoan egituratu. Emaitzak interpretatzea 24 ordura:

• Ikasleek leinuaren fenotipoa baieztatuko dute, inhibizio-haloak zuzenak direla egiaztatuta.

48 ordura: • Talde bakoitzak plakak

mikroskopioan behatuko ditu, plaka bakoitzean kolonia atzeragarriak zenbatu eta emaitzak idatziko ditu.


KIMIKA


• Bi plaken batez bestekoa eta kontzentrazio guztien kontrol negatiboarekiko diferentzia kalkulatuko ditu.

Azkenik, emaitza guztiak grafiko batean irudikatuko dituzte: abzisa-ardatzean produktu-kontzentrazioak (µg/plaka) eta ordenatu-ardatzean atzeragarri kopurua (His+) adieraziko dituzte. Dosi/erantzun erlazio bat baldin badago, irudikapenak lerro zuzen batera hurbildu beharko luke. Estatistika-berrespena erregresio-test baten bidez egiten da. Praktikaren emaitzak irakasleak koordinatuko duen bateratze-lanean partekatu eta adostuko dituzte. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak emaitzak.





OHARRAK

• Unitate didaktiko honek aukera ematen du eguneroko bizitzako alderdi asko bioteknologiarekin erlazionatzeko, bereziki gizakien nutrizioari eta minbizia bezalako gaixotasunei dagokien guztian. Gainera, aukerak eskaintzen dizkigu osasunaren eta ingurumenaren esparrura hurbiltzeko, bai airearen eta uraren kalitatearen ikuspuntutik, nola bizitza osasungarriaren ohiturei


KIMIKA


dagokienez. • Interesgarria izango litzateke unitatearen irakaskuntza osatzeko bisitaldi teknikoren bat egitea osasun publikoko laborategi batera edo nekazaritzako elikagaien edo ingurumenaren arloko zentro

teknologikoren batera. Horrela, ikasleek bertatik bertara ikusi ahal izango lukete elikadura- eta osasun-arrisku askori nola egiten zaien aurre prebentzioaren ikuspuntutik. Gainera, ikerketa bioteknologikoa jakintzaren arlo horietan zein garrantzitsua den eta zenbateraino aplika daitekeen hautemango lukete.


77 UD8: MIKROORGANISMOAK METODO MOLEKULAR, SEROLOGIKO ETA IMMUNOLOGIKOEN BIDEZ IDENTIFIKATZEA

KIMIKA


8. unitate didaktikoa: MIKROORGANISMOAK METODO MOLEKULAR, SEROLOGIKO ETA IMMUNOLOGIKOEN BIDEZ IDENTIFIKATZEA Iraupena: 18 ordu


1. Mikroorganismoak identifikatzeko hainbat proba biokimikoren oinarria ulertzeko. 2. Mikroorganismoak proba horien bidez identifikatzea. 3. Mikroorganismoak identifikatzeko hainbat proba metabolikoren oinarria ulertzea. 4. Proba horien bitartez hainbat mikroorganismo ezagutzea. 5. Entzimen bioekoizpenaren printzipio biokimikoak ulertzea. 6. Hainbat mikroorganismo ekoizten dituzten entzimetatik abiatuta identifikatzea. 7. PCRaren eta elektroforesiaren tekniken osagaiak eta faseak ezagutzea, baita mikroorganismoak identifikatzeko erabilgarritasuna ere. 8. Bakterioak PCRaren eta elektroforesiaren tekniken bidez ezagutzea. 9. ELISA test izenaz ezagutzen den immunosaiakuntza-teknikaren fase nagusiak ezagutzea.

10. Mikroorganismoak immunosaiakuntzaren bidez identifikatzea ELISA testa aplikatuta. 11. Aztertutako mikroorganismoak identifikatzean ordena-, garbitasun- eta metodo-irizpideak aplikatzea. 12. Praktikak egitean talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea, eta ekimena eta autonomia izatea. 13. Azido nukleikoak, proteinak eta mikroorganismoak manipulatzerakoan biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzea.

Multzoak EDUKIAK

1 2 3 4 5

PROZEDURAZKOAK

• Hazkuntza-teknikak eta teknika fisiologikoak gauzatzea. • Mikroorganismoak proba biokimikoen bitartez identifikatzea. • Hainbat mikroorganismo haien metabolismoaren analisiaren bitartez ezagutzea. • Mikroorganismoak entzimen bioekoizpenaren bitartez identifikatzea. • Azido nukleikoak erauzteko teknikak aplikatzea. • Bakterioak PCRaren teknikak erabilita ezagutzea. • Elektroforesiaren bidezko PCRaren produktuak analizatzea. • Mikroorganismoak ELISA testa aplikatuta identifikatzea. • Hondakinak kudeatzea eta ezabatzea.

X

X

X X X X

X

X

X


KIMIKA


• Azido nukleikoak manipulatzerakoan biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzea. X

KONTZEPTUZKOAK

• Identifikazio mikrobiologikorako hazkuntza-teknikak eta teknika fisiologikoak. • Mikroorganismoen zehaztapen biokimikorako beharrezkoak diren osagaiak eta erreakzioak identifikatzea. • Bakterioen hartzidura-metabolismo nagusien ezaugarriak. • Bakterio-jatorriko entzimak eta haien erreakzio bereizgarriak. • Mikroorganismoen molekula mota zehazteko teknikak. • ELISA testaren oinarri teorikoak eta faseak. • ELISA saiakuntzen modalitateak eta aldaerak.

X X X X X X X

JARRERAZKOAK

• Biosegurtasuneko arauak, laneko osasunekoak eta ingurumena babestekoak aplikatzea, bereziki mikroorganismo patogenoak manipulatzean.

• Ordena, garbitasuna eta metodoa laborategiko oinarrizko eragiketak egitean, lan-prozedura normalizatuei jarraiki eta laborategiko jardunbide egokiak betez.

• Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izatea. • Ematen dizkioten egitekoetan inplikatzea eta ekimena eta autonomia izatea. • Materiala eta tresneria errespetatzea eta zaintzea.

X X X X X

X X X X X

X X X X X



Helburu inplikat. D

Ir. Ik. NOLA egingo den ZERTARAKO egingo den ZEREKIN egingo den


1, 3, 5, 7, 9

1 h X X Irakasleak mikroorganismoen identifikazioari buruzko galdera zehatzak planteatuko dizkie ikasleei, eta horri buruzko adibide batzuk emango dizkie garrantziaz jabetzeko. Ikasleek, lehenik bakarka eta gero binaka, planteatutako galderei erantzungo diete. Azkenik, ikasleek bateratze-lan laburra egingo dute eta, irakaslearen gidaritzapean, erantzunak elkarrekin trukatu eta adostu egingo dituzte.

Ikasleek mikroorganismoen identifikazioari eta horrek hainbat sektoretan duen garrantziari buruz dituzten aldez aurreko jakintzak (kontzeptuak eta prozedurak) ebaluatzeko.

Bioteknologia aplikatuaren ikastaroa. 2010eko azaroa. Tknika, Vita-Aidelos. Saiakuntza bioteknologikoen ikastaroa. 2008. Mikrobiologia. Nafarroako Unibertsitatea. Biokimikako eta Biologia Molekularreko Saila. Nelson, D. L. y Cox, M. M. Lehninger. 2006. Principios de Bioquímica. Ed. Omega 4ª Edición. Zenbaiten artean. 2009. Biología 2º Bachillerato. Ed. Edelvives. Zenbaiten artean. 2010. Ensayos Biotecnológicos. Ed. Cano Pina. 1ª Edición.


KIMIKA



1, 3, 5, 7, 9

1 h X X Ikasleak, irakaslearen gidaritzapean, hainbat prozedura proposatuko ditu mikrobioak identifikatzeko, eta izan ditzaketen aplikazioak aipatuko ditu. Irakasleak unitate didaktikoa aurkeztuko du, dagokion moduluaren barruan kokatuko du, eta gainerako moduluekin lotuko du. Erdietsi beharreko ikaskuntzaren helburuak, horiek lortzeko gauzatu beharreko irakasteko eta ikasteko jarduerak eta zein mailatan lortu diren zehazteko aplikatzen diren ebaluazio-irizpideak azalduko ditu.


Zenbaiten artean. Investigación y Ciencia. Temas 38: Nueva Genética; Temas 48: Virus y bacterias; Temas 59: ¿Qué es un gen? "Investigación y Ciencia" aldizkariaren mailako aldizkarietan mikroorganismoei buruz argitaratutako artikuluak. Haiek identifikatzeko eta ezaugarritzeko prozesuen fluxu-diagrama. Unitate didaktikoaren eskema orokorra. Moduluaren programazio laburtua.

J2-E2 Mikroorganismoak proba biokimikoen bitartez identifikatzeko praktika autonomoa.

1, 2, 11, 12, 13

3 h X Ikasleek, irakaslearen gidaritzapean, hainbat mikroorganismoren identifikazio biokimikoa egingo dute. Horretarako, proba biokimiko hauek egingo dituzte:

• Zitratoa karbono-iturri bakar gisa erabiltzea.

• Hartzidura butilenglikolikoa egitea (Voges-Proskauer proba).

• Triptofanasa entzimaren presentzia (indolaren proba).

• Tiosulfato erreduktasa entzima edukitzea (H2S ekoiztea).

• Zelula-pareta mota (mikroorganismo Gram- edo Gram+).

Gero, ikasleak proben emaitzak erreferentziako taula batekin konparatuko ditu eta mikroorganismo ezezagunak identifikatuko ditu. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak praktikaren

Mikroorganismoak proba biokimikoen bitartez identifikatzeko. Biosegurtasuneko arauak eta ingurumena babestekoak aplikatzeko, bereziki mikroorganismo patogenoak manipulatzean. Ordenatuta, garbi eta metodoarekin jarduteko laborategiko oinarrizko jarduerak egitean. Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea, eta ekimena eta autonomia izateko. Txostenak eta lanak garaiz eta taxuz entregatzeko.

Dagozkion saiakuntza biokimikoak egiteko beharrezkoak diren laborategiko erreaktiboak (aitzindariak eta substratuak). Hazkuntza-ingurune egokiak. Alkohol-metxeroa. Petri plakak. Inkubazio-labeak. API zerrendak ere erabil daitezke, 10 test biokimiko baino gehiago dituztenak, baita datu-base bat ere.


KIMIKA


emaitzak.

J3-E3 Mikroorganismoak hartzidura-metabolismoaren bitartez identifikatzeko praktika autonomoa.

3, 4, 11, 12, 13

3 h X Ikasleak elikagaien mikrobiologiaren esparruan erabiltzen diren bakterioetan dauden hartzidura-metabolismo motak aztertuko ditu. Horretarako, jogurtaren bakterioak aztertuko ditu, hala nola Lactobacillus bulgaricus eta Streptococcus thermophilus; sinbiosian jarduten dute, eta, esnearen laktosatik abiatuta, azido laktikoa ekoizten dute. Bakterio homohartzitzaileak dira. pH-a 4-5 arte jaisten da. Esnea koagulatu egiten da eta jogurta eratzen da. Koagulazio azidoa da. Azido laktikoaren beste bakterio batzuek ere, Leuconostoc mesenteriodes bakterioak esaterako, hartzi dezakete esnea, eta azido laktikoa, etanola eta CO2 ekoitzi. Bakterio heterohartzitzaileak dira. Esnea koagulatu egiten da, baina ez da esneki gisa merkaturatzen. Gainera, azkeneko bakterio horrek destranoa ekoitz dezake sakarosaren presentzian. Destranoa okintzan erabiltzen da. Azkenik, ikasleek koagulazio entzimatiko bat egingo dute, Rhizomucor miehie erabilita. Onddo horrek esnearen kaseina prezipitatzeko gai diren proteasak ekoizten ditu. Hala, gatzatua eratzen dute pH-a aldatu gabe. Talde bakoitzak prozesu horiek gauzatuko ditu (koagulazio azidoa (jogurta lortzea), destranoa elaboratzea eta koagulazio entzimatikoa (gatzatua eratzea)), dagokion bakterioa edo onddoa substratu egokian inokulatuta.

Mikroorganismoak hartzidura-metabolismoaren bitartez identifikatzeko. Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izateko. Ekimena eta autonomia izateko. Ordenatuta, garbi eta metodoarekin jarduteko laborategiko oinarrizko jarduerak egitean. Txostenak eta lanak garaiz eta taxuz entregatzeko.

Esnea. Erabili beharreko mikroorganismoen inokuluak. Gaiari buruzko artikuluak eta dokumentu-erreferentziak.


KIMIKA


Praktikaren emaitzak irakasleak koordinatuko duen bateratze-lanean partekatu eta ebatziko dituzte. Azkenik, irakasleak ebaluatuko duen txosten tekniko batean islatuko ditu ikasleak emaitzak.

J4-E4 Mikroorganismoak ezaugarritzeko entzimen bioekoizpenari buruzko praktika gidatua.

5, 6, 11, 12, 13

3 h X X Ikasleek, binaka, irakaslearen gidaritzapean, entzimen bioekoizpenari buruzko praktika bat egingo dute. Bioekoizpen hori ingurunean mikroorganismo espezifiko baten presentzia ezaugarritzeko eta/edo zehazteko erabil daiteke. Talde bakoitzak probak egingo ditu entzima hauen presentzia edo absentzia zehazteko: Amilasak Almidoia, bere substratua, disoluzio iododuna gehitu ondoren more ilunez edo beltzez tindatzen den polisakarido bat da. 48 orduz inkubatu ondoren, almidoia degradatu baldin bada, erreaktiboa gehitu ondoren, ingurunea marroi iluna ikusten da. Hala ez bada, erreaktiboa gehitu ondoren, beltza ikusten da. Proteasak Substratu gisa erabilitako proteinak solido jarraitzen du 4 ºC-tan. 48 orduz inkubatu ondoren, ingurunea likido ikusten da. Osterantzean, solido ikusten da. Zelulasak Zelulosa, glukosa-unitatez osatutako polisakarido lineala, hidrolizatzen duten entzimak dira. 24

Hainbat aplikaziotarako eta/edo espezie zehatzen identifikaziorako entzimak lortzeko. Ordenatuta, garbi eta metodoarekin jarduteko laborategiko oinarrizko jarduerak egitean. Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea erakusteko, eta ekimena eta autonomia izateko. Txostenak eta lanak garaiz eta taxuz entregatzeko.

Entzima horiek ekoizten dituzten bakterioen hainbat inokulu. Inkubazio-labea. Hazkuntza-ingurune egokiak. Petri plakak. Metxeroa.


KIMIKA


orduz inkubatu ondoren, eta zelulosarekiko afinitatea duen koloratzaile bat gehitu eta gero, zelulosa baldin badago ingurunea gorriz tindatzen da. Zelulosa degradatzen bada, ingurunea laranja bihurtzen da erreaktiboa gehitu ondoren, eta degradazio-halo bat osatzen da. �-galaktosidasa Laktosa hidrolizatzen duen entzima bat da. Antzeko substratu bat erabil daiteke, ONPG deritzona. Horrek, entzimak deskonposatzen duenean, o-nitrofenola (horia) askatzen du. 24 orduz inkubatu ondoren, entzima ez badago, ez da o-nitrofenolik askatzen eta ingurunea koloregabea da. Aitzitik, entzima baldin badago, o-nitrofenola askatzen da eta ingurunea hori bihurtzen da. Ikasleek emaitzak ikaskideekin partekatuko dituzte eta haien laguntzarekin zuzendu egingo dituzte, irakaslearen gidaritza eta gainbegiratupean. Irakasleak, gainera, dagokion txostena ebaluatuko du.

J5-E5 Mikroorganismoen PCR eta elektroforesi bidezko tipaketa molekularrari buruzko praktika autonomoa.

7, 8, 11, 12, 13

3 h X Ikasleak, PCRaren teknikaren bitartez, bakterio jakin batzuk identifikatuko ditu (Brucella generoaren eskualde bereizgarrietarako zebadoreen bitartez). Abiapuntuko materiala askotarikoa izan daiteke: odola, seruma, bakterio-kulturak, ehunen laginak… Kasu honetan, ikasleak bakterio-kultura bat hartuko du abiapuntutzat. Bakterio patogenoak izan arren, irakitean inaktibatu egiten dira, eta arriskurik gabe lan egin daiteke.

Mikroorganismoak PCR eta elektroforesi bidez molekularki identifikatzeko. Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea erakusteko. Ordenatuta, garbi eta metodoarekin jarduteko eta ekimena eta autonomia izateko laborategiko oinarrizko jarduerak egitean.

Bruce-ladder kita. Agarra. Petri plakak. Bakterio-koloniadun kultura. Ultrazentrifugagailua. PCR-rako indargetzailea. dNTPs. Mg2+ DNA polimerasa. TBE indargetzailea. Pisu molekularraren markatzailea


KIMIKA


Brucellaren DNA prestatzea. Ikasleak, ereite-uztai bat erabilita, agar plakatik kolonia bat edo batzuk hartu eta 200 µL H2O-tan berresekiko ditu. Gero, bakterioaren DNA erauziko du 10 minutuz irakinez. Ondoren, 2000 g-tan zentrifugatuko du 20 segundoz, eta gainjalkinaren 1 µL erabiliko du PCRaren erreakziorako hasierako lagin gisa. PCR Bruce-ladder egiteko nahastea prestatzea.

• PCR 10X indargetzailea, 1X 2,5 µL-ko azken kontzentrazioan.

• dNTPs (2 mM), 400 µM-ko azken kontzentrazioan bakoitza, 5 µL.

• Mg2+ (50mM), 3,0 mM-ko azken kontzentrazioan, 1,5 µL.

• Bruce-ladder eight-primer cocktail (12,5 µM), 6,25 pmol-eko azken kontzentrazioan, bakoitza, 7,6 µL.

H2O, PCR gradukoa, 7,1 µL. DNA polimerasa 1,5 U, 0,3 µL. PCR bidez anplifikatzea Ikasleek hasierako desnaturalizazioa egingo dute 7 minutuz 95 ºC-tan. Gero, 25 ziklo egingo dituzte eskema honen arabera:

• 35 segundoz desnaturalizazioa 95 ºC-tan.

• 45 segundoz zebadoreak 64 ºC-tan lotzea.

• 3 minutuz zebadoreak 72 ºC-tan hedatzea.

Gainera, azken hedatze bat egingo dute 6 minutuz 72 ºC-tan.

Txostenak eta lanak garaiz eta taxuz entregatzeko.

(1 kb-ko eskailera). Etidio bromuroa.


KIMIKA


Produktua detektatzea eta emaitzak interpretatzea. Ikasleek PCRaren produktuaren 7 µl hartuko dute elektroforesi bidez (120 V, 1 h) analizatzeko % 1,5eko agarosa-gelean, TBE indargetzailean (89 mM Tris HCl, 89 mM azido boriko, 2 mM EDTA, pH 8,0). Pisu molekularraren markatzaile bat erabiliko dute (1 kb-ko eskailera). Azkenik, zerrendak argi ultramorearekin bistaratuko dituzte, etidio bromuroarekin tindatu ondoren. Ikasleek emaitzak ikaskideekin partekatuko dituzte eta haien laguntzarekin zuzendu egingo dituzte, irakaslearen gidaritza eta gainbegiratupean. Irakasleak, gainera, dagokion txostena ebaluatuko du.

J6-E6 Zeharkako ELISA teknikarekin saiakuntza immunologiko bat egiteko praktika autonomoa.

9, 10, 11, 12, 13

3 h X Ikasleak saiakuntza immunologiko bat egingo du zeharkako ELISA teknikarekin, honako fase hauen arabera: Antigenoa itsastea. Ikasleak antigenoa itsatsiko du, plakaren material plastikoari adsorba dakion. Horretarako, antigenoaren 100 µL jarriko du mikroplakaren kikaretan eta 24 orduz inkubatuko du 4 ºC-tan. Antigorputz edo serum aztergaiarekin inkubatzea. Aurreko fasean adsorbatutako antigenoa ezagutuko duten antigorputz espezifikoen presentzia detektatzeko serumak gehituko ditu. Horretarako: Mikroplaka hustu eta 3 aldiz garbituko du 300 µl PBS-Tween indargetzailerekin. Hustu, blokeo-

Zeharkako ELISA teknikarekin saiakuntza immunologiko bat egiteko. Ordenatuta, garbi eta metodoarekin jarduteko laborategiko oinarrizko jarduerak egitean. Talde-lanean jarrera positiboa, parte-hartzailea eta laguntzailea izateko. Ekimena eta autonomia izateko. Txostenak eta lanak garaiz eta taxuz entregatzeko.

ELISA plaka bat (hondo laua). Plaken irakurgailu optikoa / fotometroa / espektrofotometroa. Hodi bat antigenoaren 3 mL-rekin (esate baterako, B. melitensis 16M-ren LPSa, 2,5 µg/mL PBSan). 200 µL-ko mikropipeta. Punta urdinak eta horiak. Eppendorf hodi bat, antigorputz edo serum aztergaiaren 60 µL-rekin. Eppendorf hodi bat, kontrol negatiboko serumaren 60 µL-rekin. Blokeo-indargetzailea (PBS + % 5 esne gaingabetu (p/v)). 100 mL PBS-Tween (PBS + % 0,05 Tween-20). 1.000 eta 200 µl-ko mikropipetak. Konjugatuaren 3 mL (esate baterako, G/peroxidasa proteina) 1:500 PBS-


KIMIKA


indargetzailearen 200 µL gehitu, eta 30 minutuz inkubatuko du 37 ºC-tan. Gero, PBS-esne indargetzailea bota eta erreaktibo horren 100 µL jarriko du kikara guztietan, lehen zutabekoetan izan ezik. Antigorputz edo serum aztergaiaren 200 µL gehituko du A1 kikaran eta kontrol negatiboko serumaren 200 µL B1 kikaran. Ondoren, diluzio bikoitz seriatuak egingo ditu, 100 µL 7. kikararaino transferituz eta azken 100 µL-ak baztertuz (A8 eta B8 kikarak: serum gabeko kontrola). Azkenik, 30 minutuz inkubatuko du 37 ºC-tan. Antigorputz konjugatuak detektatzea. Ikasleek serum aztergaian dauden antigorputzen frakzio konstantea detektatuko dute. Horretarako, 3 aldiz garbituko dute PBS-Tween indargetzailearekin, kikarak 300 µl-rekin betez, bi zutabeetako edukia nahasi gabe, eta plaka irauliz hustuko dute. Gero, iragazpaper gainean lehortu eta konjugatuaren 100 µL gehituko dute kikara guztietan. Azkenik, 45 minutuz inkubatuko dute 37 ºC-tan. Errebelatzea. Ikasleak antigorputzen presentzia eta antigenoarekiko lotura behatuko du metodo kolorimetriko baten bitartez. Horretarako, 3 aldiz garbituko du PBS-Tween indargetzailearekin, lehortu eta 100 µL substratu gehituko du kikara guztietan. Gero, 15 minutuz inkubatuko du giro-tenperaturan ilunpetan, erreakzioa % 1,25 sodio fluorurorekin geldiarazi eta espektrofotometria bidez kuantifikatuko ditu emaitzak, kontrol negatibokoekin konparatuta

Tween. Hodi bat substratuaren 3 mL-rekin (esate baterako, ABTS). Honela prestatzen da:

• 1. disoluzioa: 10,49 g azido zitriko anhidro + ura 500 mL arte.

• 2. disoluzioa: 14,7 g sodio zitrato tribasiko 2H2O + ura 500 mL arte.

• Substraturako indargetzailea: 1. disoluzioaren 49,5 mL + 2. disoluzioaren 35,25 mL + ura 150 mL arte.

• 3. disoluzioa (berehala prestatu erabili baino lehen): 480 µL ur destilatu + 20 µL H2O2.

• 16,5 mg ABTS eta 3. disoluzioaren 57 µL gehitu substraturako indargetzaileari eta proportzionalki banatu (3 mL hodi bakoitzean).

% 1,25 sodio fluoruro.


KIMIKA


(serum positiboaren kikara guztiek kolore bera baldin badute, erreakzioa aseta dagoela esan nahi du, eta serumaren diluzio gehiago egin beharko lirateke). Ikasleek emaitzak ikaskideekin partekatuko dituzte eta haien laguntzarekin zuzendu egingo dituzte, irakaslearen gidaritza eta gainbegiratupean. Irakasleak, gainera, dagokion txostena ebaluatuko du.





OHARRAK

• Unitate didaktiko honetan, J5-E5 eta J6-E6 jarduerak praktika autonomotzat jotzen dira, ikasleek aurreko unitate didaktikoetan (zehazki, 2. eta 5. unitateetan) gauzatu dituzten hiru teknika jasotzen dituzte-eta: PCRa, elektroforesia eta ELISA. Horrela, jarduera horiek aurretik ikasitakoa laburbiltzeko eta berrikusteko aukera ematen diete ikasleei programazioaren azkeneko unitate didaktiko honetan.

• Mikroorganismoen identifikazioa lantzen ari garenez, komenigarria izango litzateke modulu honen irakasleak unitate didaktikoa irakasteko lanak "Saiakuntza mikrobiologikoak" moduluaren irakaslearekin koordinatzea, zeren J2-E2 eta J3-E3 jarduerak, izan ere, modulu horretan ere egin baitaitezke. Horrenbestez, bi moduluen arteko koordinazio egokiak baliabideak eta denbora optimizatzeko aukera emango luke eta ikasleen trebakuntza eraginkorragoa ekarriko luke.

• Unean-unean, baliabideen artean argitalpenak, liburuak eta dokumentuak aipatzen dira. Horien ordez helburu beretarako baliagarriak diren beste batzuk erabil daitezke.

7. modulua: Saiakuntza Bioteknologikoak · Biomolekula organiko nagusiak (gluzidoak, lipidoak,...

Documents

Transcript of 7. modulua: Saiakuntza Bioteknologikoak · Biomolekula organiko nagusiak (gluzidoak, lipidoak,...