6º FORO INTERNACIONAL DE ALIMENTOS SANOS

DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA SLP, Mayo, 2018

“EL USO DEL ANÁLISIS MOLECULAR COMO FORTALEZA EN LA INOCUIDAD AGROALIMENTARIA A NIVEL MUNDIAL”

PRIORIDADES ESTRATÉGICAS

Regula los estándares sanitarios y fitosanitarios

Protege contra plagas y enfermedades exóticas

Lucha contra plagas y enfermedades presentes en el territorio mexicano

Genera confianza en la seguridad y calidad alimentaria

Promueve las exportaciones agrícolas, así como la cultura de la sanidad e inocuidad agroalimentaria

SENASICA es un órgano desconcentrado de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación que:

Dirección General de Inocuidad

Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera

Dirección de Establecimientos Tipo

Inspección Federal

Dirección de Inocuidad Agroalimentaria,

Operación Orgánica y Plaguicidas de Uso

Agrícola

Dirección de Bioseguridad para

Organismos Genéticamente

Modificados

Dirección del Centro Nacional de Referencia

de Plaguicidas y Contaminantes

Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y

Contaminantes

Laboratorio de Diagnóstico para la

Detección de Organismos Patógenos

Centro Nacional De Referencia para la Detección de OGM

SENASICA

CONCEPTOS BÁSICOS

GENOMAS BACTERIANOS • Cromosoma único y circular +

material extracromosómico • Diversos • Dinámicos (variación horizontal)

MUTACIONES, FUENTE DE VARIACIÓN VERTICAL

Secuencia original

Mutación puntual

Es la determinación del orden de las bases nucleotídicas que conforman el ADN de un organismo.

¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN DE ADN?

https://www.genome.gov/27563183/secuenciacin-del-adn/

• La secuenciación representa la tecnología más relevante para el análisis de ADN. • Si conocemos la secuencia de ADN de un organismo (genoma), podemos

caracterizarlo, conocer toda su historia.

El orden de las notas determina la melodía

El orden de las bases nucleotídicas, así como su

interacción con el ambiente, determina al organismo

>CP003278.1 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. P-stx-12, complete genome AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATATCGCCAG ACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGCGGGCAGATACTTTAA TATAGGAATACAAGACAGACAAATAAAAATGACAGAGTACACAACATCCATGAACCGCATCAGCAC ACCATTACCACCATCACCATTACCACAGGTAACGGTGCGGGCTGACGCGTACAGGAAACACAGAA CCCGCACCTGAACAGTGCGGGCTTTTTTTTCGACCAGAGATCACGAGGTAACAACCATGCGAGTG GTTCGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAACGTTTTCTGCGTGTTGCCGATATTCTGGAAAGCA AGGCAAGGGCAGGTAGCGACCGTACTTTCCGCCCCCGCGAAAATTACCAACCATCTGGTGGCGAT AAAAAACTATCGGCGGCCAGGATGCTTTGCCGAATATCAGCGATGCCGAACGTATTTTTTCTGACC CGCAGGACTTGCCAGCGCGCAGCCGGGATTCCCGCTTGCACGGTTGAAAATGGTTGTCGAACAA GCTCAGATCAAACATGTTTTGCATGGTATCAGCCTGCTGGGTCAGTGCCCGGATAGCATCAACGCC TGATTTGCCGTGGCGAAAAAATGTCGATCGCGATTATGGCGGGACTCCTGGAGGCGCGTGGACAT CACGGTGATCGATCCGGTAGAAAAACTGCTGGCGGTGGGCCATTACCTTGAATCTACCGTCGATAT GAATCGACTCGCCGTATCGCCGCCAGCCAGATCCCGGCCGATCACATGATCCTGATGGCGGGCTTT CCGGTAATGAAAAGGGTGAACTGGTGGTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTG CGCCTGTTTACGCGCTGACTGCTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCC CAGGTGCCGGACGCCAGGCTGTTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAGCTCTCTTACTT CTAAAGTCCTTCACCCTCGCACCATAACGCCTATCGCCCAGTTCCAGATCCCCTGTCTGATTAAAAA

¿CÓMO SE VE UN GENOMA?

>CP003278.1 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. P-stx-12, complete genome AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATATCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGCGGGCAGATACTTTAACCAATATAGGAATACAAGACAGACAAATAAAAATGACAGAGTACACAACATCCATGAACCGCATCAGCACCACCACCATTACCACCATCACCATTACCACAGGTAACGGTGCGGGCTGACGCGTACAGGAAAACAGAAAAAAGCCCGCACCTGAACAGTGCGGGCTTTTTTTTCGACCAGAGATCACGAGGTAACAACCTGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAACGTTTTCTGCGTGTTGCCGATATTCTGGAAA

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¿CÓMO SE VE UN SNP (Single Nucleotide Polimorfism)?

Listeria monocytogenes, EJEMPLO DE LA APLICACIÓN

DE LOS AVANCES CIENTÍFICOS-TECNOLÓGICOS EN FAVOR DE LA INOCUIDAD ALIMENTARIA

CASO USA

• Responsable del 19% de las muertes causadas por enfermedades transmitidas por almientos.

• $2.8 billones de dólares anuales. 1920: Reconocida como patógeno. Década de 1980 Reconocimiento del primer brote de origen alimentario (USA).

Listeria monocytogenes

Dr. Everitt Murray Bacterium monocytogenes

Dr. Joseph Lister

UNA RELACIÓN DE CONOCIMIENTO MÚTUO

Periodo Brotes/año Casos/año

1983-1997 0.3 54

1998-2004 2.3 11

2004-2013 3.5 5.5 Jackson et al., 2016

Periodo Brotes/año Casos/año

1983-1997 0.3 54

1998-2004 2.3 11

2004-2013 3.5 5.5

Red Pulsnet: Iniciativa de USA, laboratorios para sub-tipificación molecular. Laboratorios públicos locales, estatales y federales, coordinados por los CDC.

Electroforesis en Gel de Campos Pulsados (PFGE)

Periodo Brotes/año Casos/año

1983-1997 0.3 54

1998-2004 2.3 11

2004-2013 3.5 5.5

Iniciativa Listeria (a partir de un programa similar en Francia): • Entrevistas a todos los pacientes con listeriosis usando un

cuestionario estandarizado preguntando por >40 exposiciones a alimentos.

• Detección de un cluster por tipificación molecular, consulta de los datos de la Iniciativa Listeria para comparar sus exposiciones a alimentos e identificar al posible vehículo.

Periodo Brotes/año Casos/año

1983-1997 0.3 54

1998-2004 2.3 11

2004-2013 3.5 5.5

Limitantes de PFGE Mutaciones, insersiones, deleciones, rearreglos, o mutaciones puntuales pueden hacer que: • Aislados de Lm genéticamente relacionados tengan distintos

patrones de PFGE (falsos negativos) • Aislados que no están relacionados puedan parecer

indistinguibles (falsos poitivos)

2012 RED GENOMETRAKR

WGS de Lm y otros patógenos aislados de alimentos y muestras ambientales. Los laboratorios participantes comparten sus secuencias en una base de datos incluyendo metadatos mínimos. Comparación filogenética entre todas las secuencias de la base de datos.

2013 PROGRAMA PILOTO WGS (WHOLE GENOME SEQUENCING) CDC, FDA, USDA-FSIS (Food Safety and Inspection Service), NCBI (National Institute for Biotechnology Information). WGS en todos los aislados disponibles de Listeria monocytogenes.

RESOLUCIÓN ANTES Y RESPUÉS DE WGS

Jackson et al., 2016

PFGE vs WGS

PUNTOS DE MEJORA DE LA WGS PARA LA INVESTIGACIÓN DE BROTES

1. Delineó brotes con patrones diversos de PFGE 2. Determinación de fuente de “cold cases” 3. Demostró que ciertos clusters PFGE no consistían en aislados

altamente relacionados 4. Redefiniendo las “definiciones de casos de brote” (número

de SNPs) 5. Vinculando casos aparentemente aislados a un alimento

contaminado

WGS: DIVERSOS ENFOQUES

.

ENFOQUE “GENECÉNTRICO”

• Esquema de tipificación a partir del MLST (7 genes) a wgMLST (4808 genes) • Una diferencia de 1 a >100 SNPs se considera una diferencia alélica • Software de PulsNet

AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATATCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGCGGGCAGATACTTTAACCTATATAGGAATACAAGACAGACAAATAAAAATGA

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• Polimorfismos (diferencias) de un solo nucleótido. • hqSNPs. SNPs de alta calidad. Las filogenias construidas así

tienen un gran nivel de detalle. • Los análisis pueden ser computacionalmente muy demandantes

para aun gran número de aislados.

SNPs

AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATATCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGCGGGCAGATACTTT

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LA EXPERIENCIA EN MÉXICO

• 1983-1997 • 1998-2004 • 2004-2013:

– 2012. Creación del Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos.

– 2013. Implementación de técnicas confirmatorias, pruebas bioquímicas y campos pulsados.

2014 MÉXICO FORMA PARTE DE LA RED PULSNET DE LATINOAMÉRICA Y EL CARIBE

MISIÓN: Mantener red de laboratorios que utilicen métodos normalizados de genotipificación y compartir información inmediatamente con fin de mejorar vigilancia y alertar prontamente de brotes de enfermedades transmitidos por agua y alimentos.

En 2010 fue establecido el Centro Nacional de Referencia en Detección de Organismos Genéticamente Modificados (CNRDOGM) en Tecámac, Estado de México.

UNIDAD DE SECUENCIACIÓN Y BIOINFORMÁTICA.

Objetivo inicial. Detección, identificación, cuantificación y secuenciación de OGMs.

2013: Comienza el trabajo con bacterias

2010

454 FLX

2 a 4 muestras

2012

Ion Torrent

1 a 8 muestras

2015

MiSeq

20 a 32 muestras

2016 NextSeq 500

120 a 176 muestras

• Las mejoras tecnológicas y la automatización han aumentado la capacidad analítica de las plataformas de secuenciación, la cantidad y calidad de los datos generados.

CAPACIDAD ANALÍTICA POR PLATAFORMA DE SECUENCIACIÓN

https://www.cdc.gov/pulsenet/pdf/Genome-Sequencing-508c.pdf

La secuenciación de genoma completo (WGS) es un procedimiento de laboratorio que permite determinar el orden de las bases en el genoma completo de un organismo, en un solo proceso.

CAPACIDAD ANALÍTICA. SECUENCIACIÓN

2013 14 cepas (LDDOP)

2014 110 cepas

(LDDOP, CCAyAC, UNAM)

2015 121 cepas

(LDDOP, CCAyAC, UAS, UNAM,

GMI)

2016 976 cepas

(LDDOP, CCAyAC, GMI, CENAM,

DGSA)

2017 577 cepas

(LDDOP, CCAyAC, EQAS, GMI

ENCB,DGSA)

Se incrementó 70 veces la capacidad analítica

entre 2013 - 2016

2017 AÑO DE LA PRIMER RESOLUCIÓN DE CONTROVERSIA COMERCIAL EMPLEANDO WGS

Se analizaron 91 muestras totales de Salmonella relacionadas con el brote de Julio: WGS y Análisis bioinformáticos • 28 aislados mexicanos del “Programa de

seguimiento de atención de alertas sanitarias en materia de inocuidad agroalimentaria”

• Muestras de otras instituciones p. Ej. InDRE.

Análisis bioinformático • 63 aislados (WGS) proporcionados por

CDC entre el 27 de Julio y 9 de Agosto de 2017

ANÁLISIS DESARROLLADOS POR LA SSB (ALERTA DE PAPAYAS, 2017)

ESTRATEGIA GENERAL

WGS o descarga de secuencias de CDC

Filtrado por calidad (secuencias)

Serotipificación MLST (SeqSero/SRST2)

Construcción de árboles filogenéticos

con genoma completo (Realphy)

Análisis de hqSNPs mediante el Pipeline de los CDC (LyveSet)

Interpretación de los resultados,

elaboración de informes

FILOGENIA, hqSNPs

1 SNP

2 SNP

3 SNP

39 SNP

31 SNP

47 SNP

Lyve-Set: Pipeline para hq-SNPs empleado por CDC

CDC outbreak Isolates SENASICA outbreak Isolates SENASICA normal surveillance Isolates

CDC outbreak Isolates SENASICA outbreak Isolates

FILOGENIA, hqSNPs

2018 AÑO DE LA INCORPORACIÓN DEL SENASICA A LA RED

GENOMETRAKR

2014-2018 PROYECTO DE COLABORACIÓN “GENÓMICA Y

FILOGEOGRAFÍA DE Salmonella EN MÉXICO”

GENÓMICA Y FILOGEOGRAFÍA DE SALMONELLA EN MÉXICO

1557 aislados de Salmonella

secuenciados Año 2018

1783 aislados de Salmonella recibidos

75 SEROTIPOS IDENTIFICADOS

6260 GENES IDENTIFICADOS 594 CEPAS POTENCIALMENTE MULTIRESISTENTES

ANÁLISIS FILOGENÉTICOS. EJ. Salmonella Agona

• La brecha tecnológica con “el mundo” es cada vez más estrecha • SENASICA :

– Apuesta a la transparencia – Comprende la necesidad de compartir información en tiempo real – Trabaja con equipos interdisciplinarios – Establece colaboraciones interinstitucionales – Tiene instalaciones de punta para el Wet lab – Dry Lab – Desarrolla Bases de Datos, la información es “oro”

CONCLUSIONES

MÉXICO PRÓSPERO PARA TODOS

THANKS FOR YOUR ATTENTION senasica.gob.mx