V. Resultados

El segundo tratamiento empleó un medio de autoinducción suplementado con

NaCl (con una concentración final de 450 mM). En principio, este medio podría brindar

mejores condiciones para la expresión soluble de la proteína, pero el resultado obtenido

(Figura 21) indica que esto no ocurre en el caso de la fotoliasa. A las 13 horas de

autoinducción, se inicia la sobreexpresión de la fotoliasa. Al cabo de 45 horas, la proteína

sobreexpresada no se observa soluble como parte del sobrenadante, sino en el pellet

formando parte de cuerpos de inclusión.

Figura 21. Autoinducción en medio salino, NaCl 450 mM. Izquierda: SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie, correspondiente al pellet obtenido tras lisar el cultivo BL21(DE3)pLysS (transformado con pET28-a(+)/fotoliasa), a lo largo de la autoinducción. La columna To corresponde al tiempo inicial, las demás columnas corresponden a diferentes horas a las cuales se monitoréo la autoinducción. La presencia de la proteína recombinante en el pellet, indica que no se sobreexpresa de manera soluble Derecha: SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie, en el cual se presentan los sobrenadantes obtenidos tras la lisis del cultivo autoinducido. EPM “Amersham LMW 14000-97000”. En vista de que estos ensayos de inducción no permitieron obtener la proteína

fotoliasa de forma soluble y que las cantidades de proteína sobreexpresada son

considerables, se procedió a purificar la misma a partir de los cuerpos de inclusión. Para

ello se empleó una columna His-Link y se ensayaron diferentes protocolos de purificación

bajo condiciones desnaturalizantes. 6. Purificación de la proteína recombinante bajo condiciones desnaturalizantes En el primer protocolo de purificación se empleó urea 8M como agente

desnaturalizante. Al eluir las proteínas bacterianas de la columna His-Link, se evidenció

que la fotoliasa recombinante no se adhiere a la columna y sale como parte de los primeros

lavados (Figura 22). Esto indica que la urea no es un agente útil para solubilizar los

cuerpos de inclusión en los que se halla la fotoliasa.

65

V. Resultados

Figura 22. Purificación bajo condiciones desnaturalizantes en una columna His-Link, con Urea 8M. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie, correspondiente a las diferentes fracciones eluidas durante la purificación. De izquierda a derecha: EPM “Amersham LMW 14000-97000”. Pellet obtenido tras sonicar el cultivo BL21(DE3)pLysS (transformado con pET28-a(+)/fotoliasa), inducido con IPTG 0,4mM. Eluido (E) con Urea 8M a pH 7,8. Lavados 1 (L1) y 2 (L2) a pH 6, pH 5,3 y pH 4. La proteína recombinante es eluida en los primeros lavados, lo cual indica que no se adhiere a la columna His-Link.

Este resultado conllevo al uso de otro agente desnaturalizante, la guanidina.

Empleando guanidina 6M, se solubilizaron los cuerpos de inclusión durante una hora

previa a la incubación con la columna His-Link. Como se aprecia en la Figura 23, la

columna correspondiente a las proteínas que no se adhirieron a la columna His-link

(eluido), así como los lavados realizados con guanidina 6M pH 7,8 no se aprecian en el

SDS-PAGE, debido a que las muestras contenían cierta cantidad de guanidina que impidió

que las proteínas fueran cargadas adecuadamente en el gel. En las columnas

correspondientes a los lavados con Urea 8M pH 4 y con Imidazol 1M, se observa la

proteína fotoliasa purificada, lo cual sugiere que este método logra solubilizar

parcialmente los cuerpos de inclusión. No obstante, al calcular el rendimiento para la

obtención de esta proteína (en base a los mg totales obtenidos tras la purificación y el

volumen de cultivo) se obtuvo que por cada litro de cultivo inducido con IPTG, se

purifican 3,3 mg de la fotoliasa recombinante. Este rendimiento no era apropiado para

realizar los protocolos de inmunización posteriores, por lo cual se decidió evaluar un

tercer agente desnaturalizante, el N-lauroyl-sarcosine.

El N-lauroyl sarcosine es un detergente aniónico empleado en la solubilización y

separación de proteínas de membranas. En este caso, se empleó para solubilizar los

cuerpos de inclusión que contienen la proteína fotoliasa recombinante. Tras una hora de

incubación en el detergente, los cuerpos de inclusión fueron solubilizados para luego

realizar la incubación con la columna His-Link.

66

V. Resultados

Figura 23. Purificación bajo condiciones desnaturalizantes en una columna His-Link, con Guanidina 6M. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie, correspondiente a las diferentes fracciones eluidas durante la purificación. Izquierda: EPM “Amersham LMW 14000-97000”. Sobrenadante obtenido tras sonicar el cultivo BL21(DE3)pLysS (transformado con pET28-a(+)/fotoliasa), inducido con IPTG 0,4mM. Lavados 1 (L1) y 2 (L2) con Triton 1%. Eluido (E), lavados 1 y 2 con Guanidina 6M a pH 7,8. Lavados 1 y 2 con Urea 8M pH 6. Derecha: Lavados 1-6 con Urea 8M pH 4. Lavados 1 y 2 con Imidazol 1M. La proteína recombinante es purificada con un bajo rendimiento.

La columna correspondiente al eluido (proteínas que no se adhieren a la columna),

así como los lavados con el buffer de lisis contenían cierta cantidad de proteína

recombinante (Figura 24), pero al realizar la elusión con el buffer de lavado, en

concentraciones crecientes de Imidazol, se pudo evidenciar la liberación de la proteína

recombinante adherida a la columna. Tras juntar las fracciones L2, L3 a 30 mM y L1-L3

100 mM Imidazol, se determinó que éste protocolo posee un rendimiento de 18,3mg de

proteína purificada a partir de 1L de cultivo inducido con IPTG; el mejor rendimiento

entre los métodos de purificación ensayados.

Figura 24. Purificación bajo condiciones desnaturalizantes en una columna His-Link, con N-lauroyl-sarcosine al 0,3%. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie, correspondiente a las diferentes fracciones eluidas durante la purificación. Izquierda: EPM “Amersham LMW 14000-97000”. Homogenato y pellet obtenidos tras sonicar el cultivo BL2(DE3)pLysS (transformado con pET28-a(+)/fotoliasa), inducido con IPTG 0,4mM. Eluido y lavados con Buffer de Lisis. Lavados 1-3 con Buffer de lavado, 30mM Imidazol. Derecha: Lavados 1-3 con Buffer de lavado, 100mM Imidazol. Lavados 1 y 2 con 200mM y 500mM de Imidazol. La proteina recombinante es purificada con un mejor rendimiento.

67

V. Resultados

Dado que la concentración a la cual se obtenía la proteína purificada era muy baja

(0,05 mg/ml), se juntaron las diferentes fracciones que contenían la fotoliasa recombinante

para luego precipitarla con sulfato de amonio, al 80% de saturación. Una vez precipitada,

la proteína fue resuspendida en un volumen de solución Tris-HCl 50 mM, NaCl 10 mM

pH 7,5, para obtener una concentración final de 0,54 mg/ml. La proteína precipitada

presentó una coloración azul (Figura 25.A) de manera similar a la fotoliasa purificada de

E. coli (Sancar, 2008), indicando la presencia de los cromóforos en la proteína

recombinante. A partir de esta proteína purificada y concentrada (Figura 24.B), se realizó

el protocolo de inmunización para obtener suero anti-fotoliasa en conejo.

Figura 25. Precipitación con sulfato de amonio al 80% de saturación. A: Eppendorf que contiene la fotoliasa recombinante, de color azul, tras la purificación y precipitación con sulfato de amonio. B: SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. H: homogenato obtenido tras sonicar el cultivo BL2(DE3)pLysS (transformado con pET28-a(+)/fotoliasa), inducido con IPTG 0,4mM. Pp: Proteína recombinante purificada, precipitada con sulfato de amonio y dializada. EPM “Amersham LMW 14000-97000”.

7. Prueba de reacción cruzada de los anticuerpos anti-fotoliasa

Una vez obtenido el suero anti-fotoliasa, se estandarizaron las condiciones óptimas

para realizar los ensayos por Western blot.

Se encontró que en Western blots en los que se empleaban muestras de la proteína

recombinante purificada, el suero anti-fotoliasa reconoce una banda única con un peso

molecular aparente de 69 kDa que corresponde a la fotoliasa. Adicionalmente, en ensayos

con suero preinmune, no se reconoció ninguna proteína (datos no mostrados).

Para verificar la especificidad del suero anti-fotoliasa, se realizó un Western blot

en el cual se analizaron muestras de las proteínas recombinantes fotoliasa (L. mexicana) y

criptocromo (tanto de L. mexicana como de T. cruzi ). El resultado obtenido (Figura 26)

indica que en el suero existen anticuerpos que reconocen a la fotoliasa, pero también

68

V. Resultados reconocen a la proteína criptocromo de la misma especie. No se observa reacción cruzada

con el criptocromo de T. cruzi.

Tras comprobar la presencia de anticuerpos anti-fotoliasa en el suero obtenido, se

procedió a estudiar la expresión de la proteína en los diferentes estadíos morfológicos de

L. mexicana.

Figura 26. Ensayo de reconocimiento del anticuerpo anti-fotoliasa por Western Blot. Izquierda. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. 1. Proteína recombinante fotoliasa de L. mexicana purificada. 2. Proteína recombinante criptocromo de L. mexicana parcialmente purificada. 3. Proteína recombinante criptocromo de T. cruzi purificada. EPM: “Amersham LMW 14000-97000”. Derecha. Western blot, empleando el anticuerpo anti-fotoliasa (dilución 1/10.000) y el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, acoplado a fosfatasa alcalina (dilución 1/10.000). Escalera preteñida de peso molecular “Biorad ” (14 - 204 kDa).

8. Expresión de la fotoliasa en diferentes estadios morfológicos

de L. mexicana Para determinar si la fotoliasa se expresa diferencialmente en los estadios

morfológicos descritos, se realizaron dos ensayos. En el primer ensayo se analizaron

extractos proteicos que poseían la misma cantidad de proteína (CP), en tanto que en el

segundo ensayo fueron analizados extractos que correspondían a un mismo número de

parásitos (NP).

Una vez calculada la concentración de proteínas, se realizó un Western blot para

comparar la expresión de la fotoliasa en promastigotes, amastigotes y amastigotes-like,

empleando un volumen correspondiente a 30 μg de proteínas por cada extracto. Como

indica la Figura 27, en los extractos de promastigotes y amastigotes-like, los anticuerpos

anti-fotoliasa reconocen tres proteínas de diferentes tamaños; en tanto que en el extracto

de amastigotes, los anticuerpos solo reconocen dos. Al comparar las proteínas reconocidas

con la proteína recombinante purificada, se observa que en los tres estadios existe una

banda con un tamaño similar. Esta banda corresponde a la proteína fotoliasa, la cual se

69

V. Resultados observa con mayor intensidad en el extracto de promastigotes. Esto sugiere que la proteína

podría expresarse en mayores cantidades en éste estadio.

Para corroborar el resultado anterior, se realizó el ensayo NP. Se calculó el volumen de

muestra equivalente a aproximadamente 14 x 106 parásitos y se realizó nuevamente un

Western blot para comparar el grado de expresión de la proteína de interés.

Figura 27. Niveles de expresión de la fotoliasa en diferentes estadios morfológicos de L. mexicana, empleando extractos con igual cantidad de proteína. Izquierda. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. 1. Proteína recombinante fotoliasa de L. mexicana purificada. 2. Extracto proteico de promastigotes, correspondiente a 30μg de proteína. 3. Extracto proteico de amastigotes. 4. Extracto proteico de amastigotes-like. EPM: “Amersham LMW 14000-97000”. Derecha. Western blot, empleando anticuerpo anti-fotoliasa (dilución 1/750) y anticuerpo secundario (dilución 1/10.000). La proteína fotoliasa es indicada con una flecha. EPM “Biorad” (14 - 204 kDa).

El resultado obtenido (Figura 28) es similar al del ensayo CP. Los anticuerpos

reconocen más de dos bandas en los diferentes extractos. Tomando la señal perteneciente

a la proteína recombinante como referencia, se observa una banda de tamaño similar que

se expresa más en el promastigote que en los otros dos estadíos. Este hallazgo sugiere

nuevamente que la proteína fotoliasa se expresa en mayor cantidad en éste estadio.

La presencia de múltiples bandas en los extractos mencionados, indica que los

anticuerpos anti-fotoliasa son capaces de reconocer otras proteínas. Se realizaron ensayos

para verificar si una de las bandas observadas correspondía a la proteína criptocromo, la

cual puede ser reconocida por los anticuerpos en cuestión. Los resultados demostraban que

las bandas detectadas no presentaban el tamaño correspondiente al criptocromo

recombinante o su forma nativa (datos no mostrados).

70

V. Resultados

Figura 28. Niveles de expresión de la fotoliasa en diferentes estadios morfológicos de L. mexicana, empleando extractos correspondientes al mismo número de parásitos. Izquierda. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. EPM: “Amersham LMW 14000-97000”. 1. Proteína recombinante fotoliasa de L. mexicana purificada. 2. Extracto proteico de promastigotes, correspondiente a 14 x 106 parásitos. 3. Extracto proteico de amastigotes. 4. Extracto proteico de amastigotes-like. Derecha. Western blot, empleando anticuerpo anti-fotoliasa (dilución 1/750) y anticuerpo secundario (dilución 1/10.000). La proteína fotoliasa es indicada con una flecha. EPM “Biorad” (14 - 204 kDa).

Adicionalmente, estudios realizados con anticuerpos anti-criptocromo de L.

mexicana (Rojas, datos no publicados), revelan que los niveles de expresión de la proteína

nativa son comparativamente bajos; al realizar Western blots con extractos de 30 μg de

proteína procedente de promastigotes, difícilmente puede observarse una señal; la banda

correspondiente a la proteína criptocromo ha sido observada empleando más de 40 μg de

proteína por extracto.

En conjunto, los resultados mencionados sugieren que las bandas observadas en los

ensayos CP y NP podrían corresponder a proteínas conservadas que son reconocidas por

anticuerpos antibacteriales presentes en el suero anti-fotoliasa.

Dado que era necesario disminuir el titulo de estos anticuerpos para poder llevar a

cabo los estudios de ubicación subcelular, se empleó el protocolo de absorción de

anticuerpos antibacteriales descrito por Gruber y Zingales (1995).

9. Absorción de anticuerpos antibacteriales en el suero anti-fotoliasa

Un volumen de 2 ml del suero anti-fotoliasa fue absorbido, según el protocolo

descrito en la metodologia (sección 8.1). Una vez obtenido el suero absorbido, se realizó

un Western blot empleando la proteína recombinante purificada y un extracto de

promastigotes de L. mexicana (25 μg de proteína), para evaluar la especificidad de los

anticuerpos.

71

V. Resultados

Figura 29. Ensayo de reconocimiento del anticuerpo anti-fotoliasa absorbido, por Western Blot. Izquierda. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. EPM: “Amersham LMW 14000-97000”. 1. Proteína recombinante fotoliasa de L. mexicana purificada. 2. Extracto proteico de promastigotes. Derecha. Western blot, empleando el anticuerpo anti-fotoliasa absorbido (dilución 1/75, lo cual equivale a 1/560 de anticuerpo no absorbido) y el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, acoplado a fosfatasa alcalina (dilución 1/10.000). Escalera preteñida de peso molecular “Biorad ” (14 - 204 kDa).

PM PM

La Figura 29 indica que el protocolo de absorción fue de utilidad para disminuir el

reconocimiento de anticuerpos antibacteriales. En lugar de reconocer tres bandas, los

anticuerpos anti-fotoliasa reconocen solamente dos, siendo la señal de la banda

correspondiente a la fotoliasa más intensa que la emitida por la otra proteína. Empleando

éste suero anti-fotoliasa absorbido, se estudió la ubicación subcelular de la fotoliasa. 10. Ubicación subcelular de la fotoliasa en promastigotes de L. mexicana

Considerando que la fotoliasa se expresaba en mayor cantidad en la fase

promastigote, se procedió a determinar la ubicación subcelular de la proteína en éste

estadio. Para ello se realizó una prueba de inmunofluorescencia y un fraccionamiento

subcelular por centrifugación diferencial.

10.1. Inmunofluorescencia

El análisis por inmunofluorescencia fue realizado por medio de microscopía de

laser confocal. Está técnica genera imágenes del interior celular, por medio de

componentes marcados con compuestos fluorescentes. En este caso la detección de la

fotoliasa se llevó a cabo utilizando el anticuerpo anti-fotoliasa absorbido y un anticuerpo

secundario acoplado a FITC, que absorbe luz a una longitud de onda de 492 nm y emite a

520 nm. Adicionalmente, se emplearon marcadores de ADN (el sustrato de la fotoliasa),

para establecer la ubicación de la proteína por colocalización; en esta ocasión, el marcador

empleado fue el ioduro de propidio, el cual absorbe luz a 536 y emite a 617 nm.

72

V. Resultados El resultado obtenido se muestra en la Figura 30. Las imágenes en verde

corresponden a la señal emitida por la fotoliasa, en tanto que las imágenes en rojo

pertenecen al la señal del ADN.

En promastigotes no tratados con formaldehido (Figuras A1-A4), el marcaje con

ioduro de propidio permite observar claramente las estructuras que portan ADN: el núcleo

y el kinetoplasto. Para la fotoliasa, se observó un marcaje definido en una región particular

de la célula. La superposición de ambas imágenes no muestra una colocalizacion, pero

indica que la fotoliasa se concentra en una región aledaña al kinetoplasto. En los tres

parásitos observados en esta figura, puede observarse que la fotoliasa tiende a ubicarse a

un lado del kinetoplasto, orientándose hacia la zona ocupada por el pocket flagelar.

En promastigotes tratados con formaldehído (Figuras B1-B4), los resultados son

similares. El núcleo y el kinetoplasto no se observan con igual intensidad, pero el marcaje

de la fotoliasa y la imagen superpuesta indican nuevamente que la proteína se concentra en

una región cercana al kinetoplasto, orientada hacia el flagelo.

10.2. Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial es un método de fraccionamiento subcelular que

permite separar diferentes componentes celulares en base a su coeficiente de

sedimentación, para obtener fracciones enriquecidas con los mismos. En este caso, con el

resultado del fraccionamiento, se midió la actividad de varias enzimas marcadoras de

localización conocida, para luego determinar, por Western blot, la ubicación de la

fotoliasa.

Los resultados de las actividades específicas fueron graficados y se muestran en la

Figura 31. La MDH, una enzima reportada en mitocondrias, glicosomas y citosol de L.

mexicana (Leroux et al., 2006) presenta mayor actividad en el citosol; también se reporta

cierta actividad en la FRG y en la fracción F1. Esto indica que en la F1 hay presencia de

mitocondrias, razón por la cual se catalogó esta fracción como fracción granular 1 en lugar

de fracción nuclear.

73

V. Resultados

Figura 30. Detección de la fotoliasa en promastigotes de L. mexicana, por inmunomicroscopia de laser confocal. A. Varios parásitos permeabilizados con Triton X-100 al 0,2%. A1 Corresponde al anticuerpo primario anti fotoliasa y el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo acoplado a FITC.; A2 Pertenece al tratamiento con ioduro de propidio, A3 a la imagen superpuesta y A4 a la imagen bajo luz. B. Un parásito, tratado con Tritón X-100 al 0,2% y formaldehido al 4%. Las imágenes B1-B4 presentan tratamientos que se corresponden con las muestras respectivas en A.

74

V. Resultados

MDH

% de proteina total

0 20 40 60 80 100

AE

(U/m

g)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

F1

F2

FRG

FM

C

EM

% de proteina total

0 20 40 60 80 100

AE

(U/m

g)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

HK

% de proteina total

0 20 40 60 80 100

AE

(U/m

g)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Figura 31. Distribución de la actividad de marcarodores enzimáticos, en fracciones obtenidas por centrifugación diferencial de promastigotes de L. mexicana. MDH: Malato Deshidrogenasa; EM: Enzima Málica; HK: Hexoquinasa. De izquierda a derecha en cada gráfico: F1: Fracción Granular 1. F2: Fracción Granular 2. FRG: Fracción Rica en Glicosomas. FM: Fracción Microsomal. C: Citosol.

75

V. Resultados

La enzima málica, una enzima reportada en mitocondrias y en citosol de T. cruzi

(Cannata y Cazzulo, 1984), presentó actividad en la fracción F1, lo cual sugiere

nuevamente la presencia de mitocondrias en esta fracción. Adicionalmente, la actividad

registrada en citosol, indica la posibilidad de que en el proceso de ruptura de los parásitos,

la mitocondria es fragmentada en vesículas, y proteínas solubles de la matriz pueden ser

recolectadas en esta fracción.

Por su parte, la actividad de la hexoquinasa fue mayor en la fracción glicosomal, lo

cual concuerda con reportes anteriores en los cuales la proteína hexoquinasa de L.

mexicana ha sido ubicada en glicosomas (Pabón et al. 2007).

El Western Blot realizado empleando anticuerpos anti-fotoliasa absorbidos (Figura

32), indica una mayor presencia de la proteína fotorreparadora en la fracción 1 y en la

fracción citosólica. Considerando esta observación y el perfil de actividades enzimáticas

previamente descrito, se puede inferir que la proteína fotoliasa se localiza principalmente

en la mitocondria.

Figura 32. Western blot del fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial, de promastigotes de L. mexicana. Izquierda. SDS-PAGE al 10%, teñido con azul de Comassie. EPM: “Amersham LMW 14000-97000”. 1. Proteína recombinante fotoliasa purificada de L. mexicana. 2. Pre-Homogenato. 3. Homogenato. 4. Fracción Granular 1. 5. Fracción Granular 2. 6. Fracción Rica en Glicosomas. 7. Fracción Microsomal. 8. Citosol. Derecha. Western blot, empleando el anticuerpo anti-fotoliasa absorbido (dilución 1/267, lo cual equivale a 1/2000 de anticuerpo no absorbido) y el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, acoplado a fosfatasa alcalina (dilución 1/10.000). Escalera preteñida de peso molecular “Biorad ” (14 - 204 kDa).

76

VI. Discusión

 

VI. DISCUSIÓN

Tras completarse el secuenciamiento genómico de las especies L. major, L.

braziliensis y L. infantum, se dispone de una base de datos con la cual se accede a los

genes y al proteoma del género Leishmania. La identificación del gen de la fotoliasa

dentro de este genoma, incentivó el estudio de la expresión de esta proteína dentro de la

especie L. mexicana; para ello se realizó una sobreexpresión heteróloga de esta proteína,

para obtener anticuerpos en conejo con los cuales se pudo determinar la expresión y

ubicación subcelular de la fotoliasa.

La fotoliasa de L. mexicana dentro de la subfamilia Fotoliasa CPD Tipo I

Amplificar el gen que codificaba la fotoliasa de L. mexicana y realizar la

construcción de un vector de clonamiento en el cual estaba contenido dicho gen, fueron

procedimientos preliminares que permitieron el secuenciamiento del mismo. Una vez

obtenida dicha secuencia, los análisis filogenéticos señalaron que el gen en cuestión

pertenecía a la familia fotoliasa/criptocromo y que presentaba características estructurales

que permitía agruparlo en la subfamilia fotoliasa CPD tipo I.

En la secuencia obtenida de 1626 pb, se identificaron los dominios funcionales

ADN fotoliasa y el dominio FAD. En el primer dominio se localiza un cromóforo que

absorbe energía lumínica, en tanto que el segundo dominio porta el cofactor catalítico

FAD. Dado que todas las fotoliasas conocidas emplean como cofactor el FAD y que

adicionalmente contienen un segundo cromóforo que participa en la captación de luz

(Sancar, 2008), se puede afirmar que la secuencia en cuestión porta las características

estructurales distintivas de las fotoliasas. No obstante, dado que criptocromos y fotoliasas

comparten una región conservada en la cual se hallan el cromóforo y el cofactor FAD

(Essen, 2006), fue necesario llevar a cabo otros análisis para poder subclasificar a la

secuencia de interés.

Además de los dominios mencionados, los criptocromos, poseen un dominio C-

terminal de 30 a 250 aminoácidos que se extiende más allá de la región homóloga a las

77

VI. Discusión

fotoliasas (Essen, 2006). Este dominio C-terminal puede actuar como péptido señal o

participar en diferentes interacciones proteína-proteína. Al llevar a cabo este tipo de

función, el dominio debe poseer una energía de interacción elevada que le confiere cierta

tendencia al desorden (Dosztányi et al., 2005). En el caso particular de la secuencia de L.

mexicana, la ausencia de una región desordenada en el extremo C-terminal permite inferir

que la secuencia en cuestión no corresponde a la de un criptocromo. Adicionalmente,

alineamientos múltiples realizados con proteínas fotoliasas y criptocromos, indican que la

proteína analizada no posee el dominio C-terminal propio de criptocromos, lo cual

confirma su identidad como una fotoliasa.

Para subclasificar a la fotoliasa se realizó un alineamiento múltiple con secuencias

pertenecientes a diferentes subfamilias fotoliasa/criptocromo, empleando el software

Clustal X. En una primera etapa, las secuencias fueron alineadas por pares, para generar

puntuaciones (una medida cuantitativa del grado de similitud entre secuencias) que

producen un árbol filogénetico. A continuación, se empleó dicho árbol filogenético como

guía para realizar un alineamiento progresivo empleando un algoritmo dinámico, el cual

alinea en primer término las secuencias más relacionadas entre sí, para luego añadir

secuencias o grupos menos relacionados (Mount, D., 2004). De esta forma, se generó un

cladograma en el cual las secuencias fueron agrupadas en las seis subfamilias

fotoliasa/criptocromo; la fotoliasa de L. mexicana, al igual que otras fotoliasas de

tripanosomatidios, fue ubicada dentro del grupo de proteínas pertenecientes a las fotoliasas

CPD tipo I.

En términos estructurales, las fotoliasas de tripanosomatidios poseen secuencias

aminoácidas similares a las reportadas para fotoliasas CPD tipo I. Como parte de esta

subfamilia, la proteína de L. mexicana presentó una mayor relación filogenética con las

fotoliasas de L. major y L. infantum, y cierta divergencia con respecto a las fotoliasas de L.

braziliensis y T. brucei; esto concuerda con la divergencia reportada entre las tres especies

de Leishmania cuyo genoma fue secuenciado (Smith et al., 2007).

El estudio teórico de la fotoliasa, fue completado el emplear diferentes algoritmos

para predecir su ubicación subcelular. Los tres algoritmos utilizados, indican que la

proteína podría tener una ubicación dual, en el citosol y en la mitocondria; sin embargo,

78

VI. Discusión

estos resultados no son concluyentes dado que la probabilidad de ubicación en cada caso

no es elevada (simplemente es mayor que la probabilidad de ubicarse en otro lugar dentro

de la célula). Aunado a esto, deben considerarse ciertos factores que limitan la capacidad

de predicción de los algoritmos empleados en bioinformática: (1) las diferencias que

pueden existir entre las señales consenso propias de tripanosomátides y aquellas

empleadas como referencia por los programas de predicción subcelular. (2) Los genes de

Leishmania se transcriben de forma policistrónica y se hallan expuestos a múltiples

mecanismos de regulación post-transcripcionales (Smith et al., 2007) (3) La expresión

diferencial de genes, entre los estadíos morfológicos de Leishmania, puede estar asociada

a modificaciones traduccionales y post-traduccionales (McNicoll et al., 2006). En

conjunto, estos factores hacen improbable predecir de forma acertada la ubicación

subcelular en Leishmania, partiendo de las secuencias nucleotídicas o aminoácidas en sí.

Sobreexpresión heteróloga de la fotoliasa

Tras clonar el gen en un vector de expresión, se logró sobreexpresar la proteína

fotoliasa recombinante de L. mexicana de forma insoluble. La proteína recombinante

acumulada intracelularmente dentro de la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS se depositó en

la forma de cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión son agregados de proteínas

desdobladas, cuyas regiones hidrofóbicas son expuestas e interactúan entre sí, haciéndolas

insolubles. Las razones por las cuales se forman dichos cuerpos no han sido

completamente dilucidadas; se consideran el resultado de la incapacidad de proteínas

chaperonas y de proteasas de conferir conformación o degradar proteínas desdobladas,

respectivamente, debido a sus limitadas cantidades en células recombinantes cuando la

síntesis de proteínas ocurre a elevadas tasas (Villaverde y Carrió, 2002).

Las condiciones genéticas apropiadas para producir proteínas solubles en sistemas

de expresión heterólogos no han sido establecidas. Sin embargo, la formación de cuerpos

de inclusión puede ser minimizada mediante el control de parámetros como la

temperatura, la disminución de la tasa de crecimiento de la cepa bacterial, la reducción de

la tasa de expresión de genes recombinantes o la co-expresión de genes plasmídicos, que

codifican proteínas chaperonas (Wall y Plücktun, 1995). Dependiendo de la proteína a

79

VI. Discusión

sobreexpresar, los resultados obtenidos con estas estrategias pueden variar. En el marco de

este estudio, se evaluaron algunas de estas estrategias con miras a obtener la proteína

fotoliasa soluble.

El gen que codifica para la fotoliasa, subclonado en el vector de expresión pET28-

a(+), está bajo el control del promotor transcripcional del bacteriófago T7 y su expresión

es inducida por una fuente de la ARN polimersa T7. Este vector fue transformado dentro

de la cepa E. coli BL21(DE3)pLysS, en la cual el plásmido DE3 porta el gen lacI, el

promotor lacUV5 y el gen para la ARN polimerasa de T7; de esta manera, el único

promotor que dirige la transcripción de la ARN polimerasa T7 es lacUV5, el cual puede

ser inducido por IPTG.

La inducción con IPTG 0,4 mM permitió la síntesis de cantidades considerables de

fotoliasa recombinante. Dado que el IPTG es un buen inductor de los sistemas de

expresión T7 y que la ARN polimerasa T7 es tan selectiva y activa, la cantidad de proteína

recombinante producida es elevada y se convierte en una fracción considerable del

contenido proteico total de la célula (Studier, 2005). Esta elevada tasa de síntesis hace que

muchas proteínas sobreexpresadas sean insolubles, como ocurre con la fotoliasa.

Una de las condiciones evaluadas para obtener la proteína soluble, fue disminuir la

tasa de crecimiento, por medio de una reducción en la temperatura del medio (a 18ºC) y

emplear una concentración menor de IPTG, 30μM. Los resultados obtenidos, si bien no

fueron concluyentes, indicaban que estos parámetros no inciden sobre la expresión

insoluble de la proteína. En consecuencia, se evaluó un medio diferente de inducción,

denominado medio de autoinducción.

La autoinducción depende de los mecanismos empleados por las bacterias para

regular el uso de carbono y las fuentes de energía presentes en el medio (glucosa y

lactosa). En presencia de glucosa, la represión por catabolito y la exclusión del inductor

previenen la expresión de la lactosa permeasa, producto del gen lacY, sin la cual no se

puede tomar lactosa del medio. Cuando la glucosa disminuye, se expresa el gen lacY y la

lactosa puede ser tomada y convertida en alolactosa, el inductor natural del operon lac, por

acción de la β-galactosidasa (Studier, 2005). En las fases tempranas del crecimiento y en

ausencia de glucosa, los aminoácidos disponibles en el medio modulan o previenen la

inducción de la proteína recombinante por la alolactosa; al llegar a la fase estacionaria, es

80

VI. Discusión

el oxigeno quien se convierte en un factor limitante de la inducción. Al disminuir el

crecimiento por la poca disponibilidad de oxigeno, los niveles de alolactosa pueden

incrementar y se ve favorecida la inducción.

Los sistemas de expresión T7 han demostrados elevados niveles de producción de

proteínas recombinantes al emplear esta forma de inducción (Studier, 2005). A pesar de

que este procedimiento permite disminuir la tasa de crecimiento de las cepas, así como

inducir de forma atenuada la expresión de la proteína recombinante (factores que pueden

disminuir la formación de cuerpos de inclusión) la fotoliasa sobreexpresada por éste

método era insoluble.

El último protocolo de expresión evaluado en este estudio fue la autoinducción en

medio salino (con NaCl 450 mM). La mayoría de las proteínas no bacteriales producidas

en sistemas de expresión heterólogos (en bacterias), son incapaces de adquirir su

conformación nativa, en especial cuando su síntesis es elevada; proteínas chaperonas de

bacterias, producidas bajo estrés térmico u otras formas de estrés, están involucradas en el

procesamiento conformacional de una fracción mínima de polipéptidos celulares y pueden

ayudar a estas proteínas recombinantes (Villaverde y Carrió, 2002). En este ensayo, el

estrés osmótico al cual fueron sometidas las bacterias en el medio de autoinducción salino,

redujo su tasa de crecimiento y podía conllevar a la síntesis de proteínas chaperonas. Sin

embargo, el resultado indicó nuevamente que la fotoliasa recombinante no podía

expresarse de manera soluble.

En vista de que los cuerpos de inclusión son estructuras sumamente dinámicas,

cuyo rol fisiológico dentro de las bacterias no es del todo claro, y que no fue posible

expresar la fotoliasa de forma soluble por medio de los protocolos empleados, se procedió

a purificar la proteína a partir de dichos cuerpos de inclusión, empleando agentes

desnaturalizantes.

La guanidina y la urea son agentes desnaturalizantes utilizados comúnmente para

solubilizar proteínas expresadas en cuerpos de inclusión. Ambos promueven la disrupción

de interacciones intermoleculares y el desdoblamiento completo de la proteína

(Middelberg, 2002). En el caso de la proteína fotoliasa, los cuerpos de inclusión no fueron

solubilizados con urea 8M pero fueron parcialmente solubilizados por guanidina 6M. La

fotoliasa tratada con guanidina, un agente desnaturalizante fuerte, fue purificada en la

81

VI. Discusión

columna His-Link, donde era obtenida en poca cantidad y precipitaba a medida que el

agente desnatualizante era removido por diálisis.

La reducción gradual del agente desnaturalizante y el uso de solventes como

glicerol, l-arginina y glutatión han mejorado el reajuste estructural de proteínas

solubilizadas con guanidinda, pero los resultados varían de acuerdo a la proteína en

cuestión (Leal et al., 2006). En este estudio no se probaron estos agentes, debido a que el

N-lauroyl-sarcosine resultó ser un mejor agente desnaturalizante para los cuerpos de

inclusión de la fotoliasa.

El N-lauroyl-sarcosine es un detergente aniónico que disminuye la hidrofobicidad

de los cuerpos de inclusión, debido a su capacidad de interactuar con residuos

hidrofóbicos, y puede ser removido por diálisis cuando su concentración está por debajo

de la concentración micelial crítica (la concentración de surfactantes por encima de la cual

los micelos se forman espontáneamente) (Leal et al., 2006). Al emplear N-lauroyl –

sarcosine al 0,3%, se logró solubilizar los cuerpos de inclusión; la purificación de la

proteína recombinante se llevó a cabo bajo condiciones desnaturalizantes, obteniendo un

mayor rendimiento que el reportado en los procedimientos anteriores. Esto sugiere que el

detergente en cuestión no interfiere en la adsorción de las proteínas a la columna His-Link.

La proteína fue eluída a 30 y 100 mM de Imidazol y luego dializada, con una reducción

gradual de pH. A diferencia de lo observado al dializar contra guanidina, la proteína

dializada contra N-lauroyl-sarcosine no precipitaba (a pH 10 y pH 9) o precipitaba muy

poco (pH 8).

Tras ser concentrada por medio de una precipitación con sulfato de amonio al 80%

de saturación, se observó que la fotoliasa recombinante presentaba una coloración azul

(Figura 25). En E. coli, la coloración azul de la fotoliasa indica que el cofactor catalítico

FAD se ha oxidado a su forma radical neutra FADHo; por el contrario, en su estado

reducido FADH- el color de la proteína es dominado por el cromóforo MTHF, el cual le

confiere una coloración amarilla (Sancar, 2008). En el caso de la fotoliasa de L. mexicana,

la coloración azul es un indicio de la presencia del cofactor FAD; se requiere de estudios

de espectroscopia y de fluorescencia para corroborar si el cofactor se halla en su estado

oxidado.

82

VI. Discusión

Al obtener la proteína fotoliasa purificada, se llevó a cabo la inmunización del

conejo, que permitió a la larga obtener los anticuerpos anti-fotoliasa con los cuales se

estudió su expresión.

Expresión de la fotoliasa en los estadios morfológicos de L. mexicana

El género Leishmania está constituido por parásitos intracelulares obligados cuyo

ciclo de vida transcurre entre el intestino medio de los flebotominos (el vector) y los

fagolisosomas, en macrófagos de mamíferos (el hospedador). Durante este ciclo, los

parásitos son expuestos a una serie de cambios ambientales drásticos: dentro del

flebotomino, los promastigotes (la forma extracelular) son expuestos a un ambiente

hidrolítico, con un pH relativamente básico y fluctuaciones abruptas de la temperatura. Al

convertirse en amastigotes (la forma intracelular) dentro del hospedador mamífero, deben

adaptarse a una temperatura poco fluctuante (entre 33 y 37 ºC, dependiendo si la infección

es cutánea o visceral), un ambiente hidrolítico, propio del lisosoma, en el cual el pH es

ácido (pH 4,4 – 5,5) y está sujetos a factores que generan estrés oxidativo, proteolítico y

metabólico (Papadopoulou et al., 2003). Para lidiar con estas condiciones, los amastigotes

expresan una variedad de genes regulados, propios de este estadio morfológico.

Los pocos genes estadio-específicos identificados en el género Leishmania

codifican proteínas de membrana (relacionadas con la infectividad y la virulencia),

proteinasas, chaperoninas (inducidas por estrés térmico) e histonas. En Leishmania la

trascripción ocurre de manera policistrónica y la regulación de la expresión de estos genes

ocurre a nivel post-transcripcional. La regulación post-transcripcional depende de

reacciones de procesamiento del ARNm, la estabilidad y traducción de éste último, la

estabilidad de las proteínas y el control post-traduccional (Papadopoulou et al., 2003).

Los cambios ambientales a los cuales se exponen los parásitos durante su

transición de la forma promastigote a la forma amastigote, son cruciales en la activación

de estos mecanismos regulatorios que controlan la expresión tanto global como específica

de genes, permitiendo así la diferenciación en Leishmania.

Considerando este contexto, se pensaba que la proteína fotoliasa posiblemente se

expresaba de manera diferencial, solo en la fase promastigote de L. mexicana. La actividad

83

VI. Discusión

fotoreparadora de la fotoliasa depende de la absorción de luz azul y en vista de que en la

fase promastigote hay una mayor exposición a la luz, la proteína solo debía expresarse en

esta fase. Sin embargo, los resultados obtenidos para la expresión de la fotoliasa indican lo

contrario: la proteína se expresa en ambos estadios del ciclo de vida de L. mexicana.

Los ensayos realizados por Western blot, partían de dos criterios para determinar la

expresión de la fotoliasa: la concentración de proteína total de cada extracto y el número

de parásitos. Al analizar extractos con igual cantidad de proteína, se evidenció la expresión

tanto en promastigotes como en amastigotes y amastigotes-like (Figura 27), siendo mayor

la expresión en el primer estadio mencionado.

Los amastigotes-like pueden ser obtenidos por cultivos axénicos y expresan

proteínas que son propias de la fase amastigote, como el antígeno de superficie amastina

(Papadopoulou et al., 2003). Se emplearon en este estudio para corroborar la diferencia en

la expresión de la fotoliasa entre estadios morfológicos. Dado que en este grupo, al igual

que en amastigotes, la señal emitida por la fotoliasa en el Western blot era menor en

comparación con el extracto de promastigotes, se puede inferir que hay una disminución

en los niveles de expresión de la fotoliasa al pasar de una forma morfológica a la otra.

Para corroborar esta observación, se emplearon los resultados del ensayo

correspondiente a un número igual de parásitos. En vista de que los extractos de

amastigotes no se pueden purificar al 100% - suelen presentar restos de macrófagos u otras

células – la concentración de proteínas que se determina no corresponde enteramente a las

células del parásito. Para lidiar con esta limitación, se realizó un conteo de los amastigotes,

amastigotes-like y promastigotes, para luego preparar extractos con los cuales se podía

analizar la expresión en cantidades iguales de parásitos. El resultado generado (Figura 28)

indica nuevamente que la fotoliasa se expresa en mayor medida en promastigotes.

En conjunto, ambos resultados sugieren que la fotoliasa se expresa en los dos

estadios del ciclo de vida de L. mexicana. La diferencia en los niveles de expresión, puede

radicar en mecanismos de control post-traduccional que afectan la expresión global de los

genes y que responderían, a su vez, a los cambios en las condiciones ambientales a las

cuales están expuestos promastigotes y amastigotes.

En el insecto vector, el promastigote puede estar expuesto a mayores cantidades de

luz, lo cual justifica una mayor expresión de la fotoliasa en esta fase. Pero considerando

84

VI. Discusión

que los amastigotes de L. mexicana se acumulan en protuberancias intradérmicas –

produciendo la manifestación clínica conocida como leishmaniasis cutánea – es posible

que la fotoliasa pueda absorber la luz que logra atravesar el tejido de la piel, para llevar a

cabo el proceso de fotoreparación. Estudios funcionales de esta proteína podrían

corroborar estas conjeturas, para así determinar el rol que cumple la fotoliasa en los dos

estadios morfológicos.

Ubicación subcelular de la fotoliasa en promastigotes

Los resultados obtenidos por inmunomicroscopia con laser confocal y por

centrifugación diferencial indican que la fotoliasa de L. mexicana podría ubicarse

principalmente en la mitocondria del promastigote. Estos resultados concuerdan en parte

con la información aportada por el análisis bioinformático, con respecto a la posible

ubicación subcelular de la fotoliasa en mitocondria.

Las imágenes obtenidas por inmunomicroscopia (Figura 30) indican que la

fotoliasa no colocaliza con el kinetoplasto, pero se agrupa en una región aledaña al mismo

orientándose hacia el pocket flagelar. Se descarta la presencia de la fotoliasa en el núcleo

ya que no hay emisión de fluorescencia en la región ocupada por él.

Para complementar los resultados obtenidos por inmunofluorescencia, se realizó

una centrifugación diferencial en la cual se obtuvieron resultados similares. El western

blot realizado con las fracciones subcelulares obtenidas, indicó que la fotoliasa se localiza

principalmente en una fracción granular (F1), reportándose también, con menor

intensidad, en el citosol.

Las actividades específicas obtenidas para las enzimas MDH y EM indican que en

la centrifugación realizada, no se obtuvo una fracción nuclear pura; en su lugar, se obtuvo

una fracción granular enriquecida con mitocondrias. Adicionalmente, la actividad

especifica de la EM registrada en citosol, indica la posibilidad de que en el proceso de

ruptura de los parásitos, proteínas solubles de la matriz puedan ser liberadas al

fragmentarse las mitocondrias, para luego ser recolectadas en esta fracción.

El resultado obtenido por el Western blot, aunado al perfil de actividades

específicas, sugiere que la fotoliasa posee principalmente una localización mitocondrial.

85

VI. Discusión

Esta no sería la primera vez que una fotoliasa es asociada a la mitocondria. En hongos

como Trichoderma atroviridae, Neurospora crassa y Fusarium oxyosporum, las

secuencias reportadas para las fotoliasas presentan señales de localización mitocondrial en

el extremo N-terminal (Berrocal et al., 2007). Adicionalmente, Yasui et al. (1992)

compararon la actividad fotoreparadora de la fotoliasa de Saccharomyces cerevisiae con la

actividad de la fotoliasa recombinante de E. coli, expresada dentro de la levadura; los

resultados obtenidos indicaron que la fotoliasa de S. cerevisiae era capaz de reparar ADN

mitocondrial, en tanto que la proteína recombinante no realizaba dicha actividad

fotoreparadora. También se reconoció la importancia de la región N-terminal en el

transporte de la fotoliasa hacia la mitocondria.

En L. mexicana, la ubicación de la fotoliasa en una región próxima al kinetoplasto,

sugiere la posibilidad de que la enzima lleve a cabo la actividad fotoreparadora del ADN

kinetoplastidico. Es recomendable llevar a cabo estudios funcionales que puedan

confirmar que la fotoliasa expresada es activa y actúa a nivel del kinetoplasto.

Al determinar que la proteína fotoliasa se expresa en los dos estadíos morfológicos

de Leishmania mexicana, así como su ubicación subcelular, se genera información de

utilidad para trabajos posteriores que busquen esclarecer aun más la función que lleva a

cabo dicha proteína dentro del parásito; con miras a emplear a la fotoliasa como un posible

blanco terapéutico para el control del patógeno.

86

VII. Conclusiones

VII. CONCLUSIONES

- Análisis bioinformáticos indican que la secuencia de la fotoliasa putativa de L.

mexicana corresponde a una fotoliasa CPD tipo I.

- La proteína fotoliasa recombinante, expresada en el vector de expresión pET28a(+)

en la cepa BL21(DE3)pLysS, no puede expresarse de forma soluble por medio de

la inducción con IPTG o la autoinducción.

- El rendimiento de purificación de la proteína fotoliasa recombinante con el agente

desnaturalizante N-lauroyl-sarcosine es mayor que el obtenido con guanidina y

urea.

- La fotoliasa se expresa en L. mexicana y su expresión es mayor en el estadío

promastigote que en el amastigote.

- Estudios de inmunomicroscopía y de fraccionamiento subcelular por

centrifugación diferencial, indican que la fotoliasa se ubica en la mitocondria de

promastigotes.

     

87

VIII. Perspectivas

VIII. PERSPECTIVAS

- Ensayar otros sistemas de expresión heteróloga para tratar de obtener una proteína

fotoliasa soluble.

- Purificar la fotoliasa nativa de L. mexicana, empleando los anticuerpos anti-

fotoliasa, para realizar estudios estructurales y funcionales.

- Realizar ensayos como la permeabilización con digitonina, la centrifugación

isopícnica e inmunomicrosocopía para corroborar la ubicación subcelular de la

fotoliasa en la mitocondria.

       

88

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