6 oct la plata oct2012

“Inactivación microbiana por nuevas tecnologías”

Stella Maris AlzamoraUBA - CONICET

V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

La Plata, Pcia. de Buenos Aires, 9-11de octubre de 2012Carrera de Microbiología Clínica e Industrial

Facultad de Ciencias Veterinarias UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA


Nuevos agentes o factores de conservación de alimentos

Fuerzas impulsoras

Inocuidad (en países desarrollados, 1/4 ó 1/3 de la población es afectada por ETA’s cada año) (Scalla et al., Em. Inf. Dis. 17, 17, 2011; Gkogka et al., Em. Inf. Dis. 17, 1581, 2011).

(el costo económico asociado a ETA’s en USA es mayor a 50 billones de dólares/año, involucrando a más de 48 millones de personas) (Scharf, J. Food Prot. 75, 123, 2012)

Calidad sensorial, nutricional o funcional de productos de consumo directo o de materias primas y productos intermedios antes de su industrialización


Algunos factores emergentes “no térmicos” de preservación

Factor Aplicaciones potenciales para conservar alimentos/productos en el mercado

Efecto volumétrico

• altas presiones hidrostáticasAplicación de 100-800 Mpa debajo de 0ºC hasta 100ºC, desde seg. hasta 20’, instantánea y uniformemente a través de todo el alimento

Dulces, jaleas, jugos y purés de frutas, yogur, salsas, guacamole, carnes cocidas y curadas, ostras, comidas preparadas, etc. (1990 - ). Pasteurización y esterilización asistidos por alta presión.

• ultrasonidoEnergía generada por ondas de sonido de baja frecuencia (20-100 kHz) y alta intensidad (10-1000 W/cm2)

Sugerido para pasteurización de jugos, leche, etc.

• pulsos eléctricos Aplicación de pulsos de alta intensidad de campo eléctrico (10-80 kv/cm) de duración de micro a milisegundos

Sugerido para pasteurización de leche, yogurt, jugos, huevo líquido, sopas, aderezos y otras bebidas


Efecto superficial

• luz UV-CAplicación de radiación de la región del espectro electromagnético entre 200 – 280 nm

Pasteurización de alimentos líquidos (2000 - ). Descontaminación de superficies de alimentos

• pulsos de luz Aplicación de pulsos intensos y de corta duración (1 s á 0,1 s; 1-20 flashes /seg) de luz blanca de amplio espectro, desde el UV al IR ( 200 – 1100 nm)

Sugerido para la descontaminación de superficies de alimentos y de alimentos líquidos

• sanitizantes(O3, H2O2)

Descontaminación de superficies en general, granos, algunas carnes, productos marinos, etc.

Factores de inactivación “emergentes”

Mecanismos de acción no totalmente elucidados.

Efectivos contra células vegetativas pero esporas de bacterias y hongos y algunas enzimas son refractarias.

A altas dosis, deterioro en la calidad y/o limitaciones técnicas equipos/tecnologías

El concepto de preservación multifactorial (“hurdle effect”) constituye la base del procesamiento de alimentos mediante las nuevas tecnologías.


Los microorganismos que no son inactivados durante el proceso o que son inhibidos en su crecimiento consumen energía para oponerse al medio hostil, sufren agotamiento metabólico y posteriormente mueren.

La eficiencia de la inactivación puede ser incrementada por el uso de factores coadyuvantes.


Factores de inactivación emergentes

¿Adopción industrial?

Mayor conocimiento en:

Eficiencia en la inactivación de microorganismosMecanismos de acción de los factores de inactivación, sólos y en combinación, y la respuesta microbianaCinética de inactivación microbiana en función de la dosis y cuantificación de la conducta microbianaEvolución de los microorganismos tratados durante el almacenamientoPosibilidades de combinación

Impacto de la dosis en la calidad, estructura y funcionalidad del alimento

Uniformidad de los procesos

Educación y comunicación(Heldman et al., 2008)


Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes

Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo

Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados



Patrones de inactivación

Influenciados por:

Tipo de microorganismo y estado fisiológico

Agente de inactivación y niveles de aplicación; factores críticos del proceso

Distribución y estado del microorganismo en el alimento (biofilm o cultivo planctónico)

Dominio ambiental (composición del medio ambiente, aw, pH, medio líquido o sólido, temperatura, etc.)

Presencia de coadyuvantes de la inactivación.



Tipo de microorganismo

Patrones de inactivación durante la aplicación de altas presiones:-- 375 MPa, L. monocytogenes en leche

-+- 600 MPa, S. aureus en pollo-- 600 MPa, S. aureus en leche-- 600 MPa, E. coli en solución de fosfato

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20Time (min)

Lo

g(N

/No

)Patrones de inactivación durante la aplicación de UV-C en jugo de naranja:-о- S. cerevisiae KE 162-●- cocktail of yeasts -∆- E. coli ATCC 35218 -▲- cocktail of E. coli

(Patterson et al., 1995) (Char et al., 2009)



Tipo de agente/combinaciones

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20Time (min)

Lo

g (

N/N

o)

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20Time (min)

Log

(N

/No)

Curvas de supervivencia de E. coli ATCC35218 sujeto a US o a UV-C:- o - agua peptona-▲- jugo de manzana-■- jugo de naranja US

UV-C

Char et al., 2009

Excepto en el caso de jugo de naranja, el efecto letal de la luz UV-C fue 3-4 veces mayor que el del US.


300 MPa, agua peptona

300 MPa, jugo de zanahoria


Tipo de matriz

E. coli

S. aureus

(Pilavtepe-Celik et al., 2009)

E. coli

S. aureus

El jugo tuvo un efecto protector en S. aureus y un efecto ligeramente sensibilizante en E coli : modificación de las resistencias relativas.



Tipo de matriz

Esporas de Alyciclobacillus acidoterrestris

Pulsos de luz, 10 cm de la lámpara, 3 pulsos/s, fluencia a 60 s: 95,5 J/cm2

(Ferrario et al., resultados no publicados, 2012)

Interacción de la radiación con el medio de propagación y la muestra

Absorción

Dispersión

Reflexión

Refracción

(decaimiento exponencial de la intensidad con la distancia, ley de Lambert-Beer)

agua peptona pH 3,1



Cultivos planctónicos vs biofilmsCurvas de supervivencia de E. coli ATCC 35218 en biofilm y en solución buffer tratada con distintas concentraciones de peróxido de hidrógeno

(%p/v) (25ºC; pH 3,3)

-6,5

-5,5

-4,5

-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0 5 10 15 20 25

log

(N/N

o)

tiempo (min)

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

tiempo(min)

Lo

g (

N/N

o)

Biofilm maduro en acero inoxidable Desarrollo planctónico

pH 3,3

0,50%0,75%

1,00%1,50%

2,50%

control

1,00%

1,50%2,00%

(Raffellini et al.,2008)

1,00%

1,50%2,00%

0,50%

0,75%

1,00%

1,50%

Los biofilms representan sistemas biológicos con un alto nivel de organización, donde los microorganismos forman comunidades funcionales, estructuradas y coordinadas.Células en el biofilm protegidas de situaciones ambientales adversas (estrés osmótico, calor, ácidos, radiaciones, biocidas, antibióticos, u otros agentes biológicos). Mayor resistencia comparadas con cultivos planctónicos.

Mecanismos múltiples de resistencia: Resistencia física a la penetración de los agentes biocidas por la matriz extracelular. Activación de la respuesta al estrés de la fase estacionaria por la alta densidad celular. Subpoblación de fenotipos altamente protegidos para crecer en superficies. Producción de enzimas que degradan los antimicrobianos. Menor velocidad de crecimiento, menor metabolismo y por tanto más difíciles de inactivar.

Consecuencias: Serios problemas higiénicos (contaminación microbiana del producto, persistencia de patógenos en superficies, pérdidas económicas por deterioro).Diseño subdimensionado de procesos si estos se basan en cinéticas en medios planctónicos.


Enfoque mecanístico vs enfoque vitalístico


Modelado matemático de las curvas de supervivencia

tiempo tiempo

tiempo tiempo

Log N

Log N

Log N

Log N

Una subpoblación altamente resistente permanece viable durante un tiempo largo de tratamiento y/o se adapta al estrés(heterogeneidad en la respuesta de la población al factor de estrés)

La intensidad del factor debe exceder un valor umbral antes de que ocurra inactivación (heterogeneidad en la respuesta de la población al factor de estrés)

Cada miembro de la población tiene la misma sensibilidad al factor, pero sólo una fracción se afecta por el tratamiento letal a un dado tiempo (homogeneidad en la respuesta de la población al factor de estrés)

lineal

con “cola”con “hombro

sigmoidea



Modelado matemático de las curvas de supervivencia

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

tiempo(min)

log

(N/N

o)

Efecto de la concentración de peróxido de hidrógeno (%p/v) y el pH en la inactivación de E. coli ATCC 35218 (25ºC; soluciones buffer de ácido cítrico – Na2HPO4)

pH 7,2

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

tiempo(min)

Lo

g (N

/No

)

pH 3,3

0,50%0,75%1,00%

1,50%2,50%

Modelo de distribución de resistencias tipo Weibull

loge N(t)/No = -btn b: parámetro de escala o de veloc. no lineal n: parámetro de forma


- Frecuencia de distribución de resistencias de E. coli a peróxido de hidrógeno

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (min)

Frec

uenc

ia (1

/min

)

diferentes pHs (25ºC)

3,3 - 4,4 - 5,8 - 7,2

Reducción de pH

La magnitud de los parámetros b, n, moda, promedio, varianza y coeficiente de asimetría de la distribución varían con el medio y con la dosis del agente letal.

Conforme se incrementa la dosis del agente letal o los parámetros del medio se hacen más desfavorables, la distribución se corre a tiempos menores, y disminuye la varianza, indicando una población más homogénea en su respuesta.

(Raffellini et al. 2004)

0,75 % H2O2


Agenda




Criterio y método usual para evaluar viabilidad Habilidad de las células para reproducirse. (Recuento en placa).

No se cuentan microorganismos que no forman colonias: muertos dañados subletalmente viables pero no cultivables

Aquellas células capaces de realizar todas las funciones celulares necesarias para la supervivencia en circunstancias determinadas

Células viables


(Breeuwer & Abee, 2000)


Detectores de luz roja y naranja

Detector de luz verde

Detector de luz reflejada a 90º

Detector de luz incidente

Fuente de luz láser

Espejos reflectores de luz de determinadas longitudes de onda

Citometría de flujo

Luz desviada a ángulos altos y bajos: tamaño y granularidad (complejidad interna) de las células. Emisión de fluorescencia: estado fisiológico de las células a nivel individual. 500-5000 cél./seg Digitalización de la información y presentación de resultados como histogramas o gráficos de puntos.


Cuadrante Propiedades de fluorescencia de las

células de cada cuadrante

Explicación posible de los mecanismos celulares involucrados

1 F– PI+ Actividad de esterasa negativa, membranas comprometidas

2 F+ PI+ Esterasa activa, membranas mínimamente dañadas

3 F– PI- Actividad de esterasa no detectable (o expulsión de F de las células), membranas intactas

4 F+ PI- Esterasa activa, membranas intactas

2 1

4 3

Gráfico de densidad de fluorescencia (IP vs FDA)


21

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4

21

3 4 4

21

3

1 2

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4

1 2

3 4 4

1 2

3 4

21

3

S. cerevisiae

E. coli

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

0 2 4 6 8 10

Time (min)

Lo

g (

N/N

o)

S. cerevisiae

E. coli

L. innocua

L. innocua

0 min 1 min 2 min

0 min 1 min 2 min

0 min 1 min 2 min

3 min 5 min 7 min

3 min 5 min 10 min

3 min 5 min 8 min

Gráficos de densidad de fluorescencia de células teñidas con FDA y PI y sometidas a diferentes

tiempos de exposición a UV-C (0-5 kJ/m2)

Recuento de viables

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

0 5 10 15 20 25

Time (min)

Lo

g (

N/N

o)

Gráficos de densidad de fluorescencia de células de S. cerevisiae teñidas con FDA y PI

y sometidas a diferentes tiempos de exposición a ultrasonido (20 kHz, 600 W, 45ºC,

95,2 μm de amplitud de onda)

c

1 2

3 4 4

2

d

1

3

2

a

1

4 3

2

b

1

3 4

4

2

3

1

e

0 min 5 min

10 min 15 min

20 min

Curva de supervivencia de S. cerevisiae durante el tratamiento ultrasónico en caldo Sabouraud.

(Alzamora et al., 2010)

A los 20 min de tratamiento, el recuento de viables indicó más de 1 ciclo log de reducción pero el estudio de citometría de flujo reveló sólo 37% de células con daño en membrana (cuadrantes 1+ 2) la pérdida de viabilidad de la levadura no ocurre sólo por daño a membranas


CBA

C C

S

S

S

S

La acción disruptiva del ultrasonido se refleja en varios blancos en la célula de la levadura: pared celular, membrana citoplasmática, estructura interna.

Pérdida de material internoRestos de pared celular y membrana plasmáticaDisrupción contenido internoHinchamiento de pared celular con encogimiento material interno y completa disrupción de organelas.

Imágenes de TEM de células de S. cerevisiae sonicadas 20 min.

control

sonicadas


Agenda




Estudios focalizados en microorganismos patógenos más que en microorganismos deteriorantes, el efecto del tratamiento per se más que en la conducta durante el almacenamiento.

Muchas de estas tecnologías combinadas pueden:extender la vida útilincrementar la inocuidadaumentar la vida útil y la inocuidad

Problemas potenciales? La prolongación de la vida útil por reducción de la microflora incrementa la probabilidad de crecimiento de los patógenos resistentes a la inactivación durante el almacenamiento, agravado por la destrucción de la flora competitiva. Si el daño a la estructura del alimento por el tratamiento de inactivación es alto se puede incrementar el crecimiento de patógenos remanentes durante el almacenamiento (pérdida de fluidos con nutrientes).

Gómez-López et al., 2008; Alzamora et al., 2012

Estudio integrado de flora nativa y de patógenos después del tratamiento y a lo largo del almacenamiento pretendido



0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8Storage time (day)

N (

UF

C/g

)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 2 4 6 8Storage time (day)

N (

UF

C/g

)-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 20 40 60 80 100 120

Exposure time (s)

Lo

g (

N/N

0)

Ejemplo: Manzanas cortadasIrradiadas con pulsos de luz a 10 cm o 5 cm de la lámpara. Supervivencia de m.o. inoculados y evolución de la flora nativa a 5ºC

E. coli Flora nativa: bacterias totales

L. innocuaFlora nativa: hongos y levaduras

Almacenamiento:después de 10s ó 60s de radiación:No existió crecimiento de E. coliReducción de L. innocua

control 10 s, 10 cm 60 s, 10 cm

(Gómez et al., 2011)

Tratamiento per se Almacenamiento

control 10 s, 10 cm 60 s, 10 cm

5 cm

5 cm

10 cm

10 cm

Incremento de inocuidad y vida útil aún a la menor dosis (10s- 10 cm)



-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20 25 30

Log

N/N

o

Time (min)

A

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20 25 30

Log

N/N

o

Time (min)

C

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20 25 30

Log

N/N

o

Time (min)

D

-4

-3,5

-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

-1 1 3 5 7 9 11 13 15

Log

N/N

o

Time (day)

A

-5

-4,5

-4

-3,5

-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

-1 1 3 5 7 9 11 13

Log

N/N

o

Time (day)

C

-7,5

-6,5

-5,5

-4,5

-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

-1 1 3 5 7 9 11

Log

N/N

o

Time (day)

D

Ejemplo: Jugo de naranjaAdicionado con antimicrobianos naturales, irradiado con luz UV-C 30 min y almacenado en refrigeración UV-C UV-C/100 ppm citral/1000 ppm vanillina UV-C/50 ppm citral/1500 ppm vanillina

Ferrario et al., 2011

S. cerevisiae E. coli L. innocua

PROCESO

ALMACENAMIENTO

Los antimicrobianos no mejoraron la inactivación por irradiación con luz UV-C pero en determinadas concentraciones se minimizó el desarrollo de las levaduras que resistieron el tratamiento con luz UV-C o que se recuperaron después del mismo UV-C como único factor contribuiría a la inocuidad sin modificar la vida útil pero ésta se incrementaría por el agregado de 100 ppm de citral y 1000 ppm de vainillina.

Conclusiones

Cinética de inactivación

Específica para un dado microorganismo, dominio ambiental y factor de inactivación (en combinación o no con otros factores de estrés).

Evaluación en microorganismos adheridos en biofilms.

Cuantificación de la cinética de inactivación microbiana por modelos de distribución de resistencias de acuerdo al enfoque vitalístico

Estudios simultáneos de la respuesta microbiana de la flora nativa y de los microorganismos inoculados, tanto en el tratamiento per se como durante el almacenamiento



Muchas gracias!

[email protected]

Grupo de investigaciónDra Sandra GuerreroDra Cielo CharDra Silvia RaffelliniDra Marcela SchenkLic. Mariana Ferrario

Factors affecting inactivation and explaining the great variance values of the mean inactivation time

The presence of colored compounds and pulp particles which caused poor UV-C light transmission (UV-C light absorption by dissolved solids; UV-C scattering and reflection, and a site for the aggregation of bacteria to particles surfaces by solids in suspension).

The complex flow pattern in the system and the great distribution of residence times.

The difference in the response per se between the members of E. coli population (different sensibility to the treatment).

Gráficos de densidad de fluorescencia de células de S. cerevisiae teñidas con cFDA y PI y sometidas a diferentes tiempos de exposición a pulsos de luz (0-71,6 J/cm2)

Agua peptonada pH 3,5


Jugo de manzana comercial



Jugo de manzana comercial

0 s 1 s 5 s 10 s 20 s 60 s

6 oct la plata oct2012

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