Bases Genéticas de la estructura de los

anticuerpos

La respuesta inmune es supremamente diversa. Células B y T presentan desde 1015 hasta 1018 especificidades antigénicas.Los genes Ig y TCR usan una estrategia particular para lograr una enorme diversidad, utilizando centenares de genes en lugar de millones.Las regiones constantes y variables están codificadas por diferentes genes. Muchos genes de regiones variables (V) pueden unirse a un único gen de la región constante (C).

Tonegawa encontró que los genes de las Igs se pueden mover y re-arreglar dentro del genoma de una célula diferenciada.

El re-arreglo de los genes durante la diferenciación coloca juntos un conjunto apropiado de genes para las regiones V y C.

El conjunto de genes re-arreglados luego se transcribe y traduce en una cadena completa H o L.

Davis demostró que se aplican muchos de los mismos principios para la generación de la diversidad de los genes que codifican los TCR.

Al parecer los mecanismos genéticos utilizados para generar receptores antígeno-específicos sobre células B y T son únicos.

Estructura y expresión genética de genes

Organización y expresión de genes. Ver figura.

1.El genoma de un individuo consiste de un arreglo lineal de genes en las cadenas de ADN en diversos cromosomas.

2.Cada célula diploide contiene el mismo conjunto de genes. La única excepción son los linfocitos, que difieren entre si y de otros tipos de células en el contenido de genes que codifican para su receptor antígeno-específico.

Las células difieren debido a que expresan (transcriben y traducen) diferentes genes.

3. La expresión de un patrón especifico de genes determina la función celular. La expresión genética se puede controlar a diferentes niveles: actividad de factores de transcripción, tasa de transcripción y vida media del ARNm.

4. La mayoría de los genes que codifican para una proteína tienen una estructura característica que incluye axones e intrones. Los exones posteriormente se transcriben en ARNm maduro.

5. Transcrito primario de ARN consta de axones e intrones. Posteriormente enzimas especiales realizan “splicing”, uniendo todos los exones requeridos para codificar la proteína final.

Generalmente los exones codifican para una región discreta de la proteína, como, un dominio extracelular, región transmembrana, o una cola citoplasmática.

6. Genes que codifican una proteína que se expresa sobre su superficie celular presentan hacia el extremo 5’ de la región codificadora una secuencia líder, que codifica para un péptido señal de ~ 20 aa de longitud, el cuál provee una región hidrofóbica N-terminal utilizada para transportar vía RE y AG hasta el lugar de destino.

• La estructura de los genes de las Igs difieren en varios aspectos respecto de otros genes del genoma: varias cadenas glucosiladas (cadenas H y L deben ensamblarse y glucosilarse dentro de la célula antes de alcanzar la superficie celular), cada cadena IG tiene una cola citoplasmática muy corta.

Eventos genéticos en la síntesis de las cadenas de las Igs

Organización y re-arreglo de los genes de las cadenas livianas

Los polipéptidos κ y λ consisten de dos dominios principales VL y CL.

VL es una región N-terminal de ~ 108 residuos aa, codificada por dos segmentos genéticos separados: un segmento variable (V) que codifica por 95 residuos del extremo N-terminal y un segmento pequeño (J) “joining” que codifica por 13 residuos (96-108) del extremo C-terminal.

• Un gen V y uno J se unen en el genoma para crear un gen único, que junto con el gen de la región C, codifica por una cadena L completa de Ig.

• Este mecanismo de re-arreglo genético se conoce como recombinación V (D) J. D, segmento involucrado en el re-arreglo de cadenas H de las Igs.

Muchos de los pasos en este re-arreglo genético parece son comunes tanto para células B como para T.

La recombinasa V (D) J media el re-arreglo para los genes receptores en células B y T.

Este complejo enzimático se encuentra en todas las células y esta involucrado en el reparo de las cadenas de ADN.

¿Qué distingue a la de los linfocitos? El producto de dos genes, RAG-1 y RAG-2 (recombination-activating-genes), expresados exclusivamente en linfocitos y requeridos en los primeros estadios de corte del ADN de Ig (y TCR). Genes RAG son esenciales para el desarrollo de células B y T. “RAG knockout mice” son deficientes en células B y T.

Síntesis de la cadena κEl locus κ se encuentra sobre el

cromosoma 2. El análisis genético ha demostrado que en

línea germinal de cualquier célula los genes κ están arreglados así: ~ 40 diferentes genes Vk arreglados linealmente y con su propia secuencia L y separados por intrones, cada uno codifica para los 95 aa de la región N-terminal de la región variable k.

Corriente abajo se encuentran un conjunto de 5 segmentos genéticos Jk, cada uno codifica los 13 aa restantes de la región C-terminal de la región variable k.

Un intrón largo separa al único segmento codificador de la región constante de la cadena k (Ck). Ver figura. Como se realiza una cadena k.

Organización y re-arreglo de los genes de las cadenas pesadas

Genes de las cadenas pesadas se encuentran sobre el cromosoma 14.

Región variable esta construida de tres segmentos genéticos (VH DH y JH ). Segmento D “diversity” es adicional respecto de las cadenas livianas.

Los segmentos D y J codifican por los aa de la tercera región hipervariable o región determinante de complementariedad (CDR3).

Locus humano de la cadena pesada comprende ~ 50 genes VH, ~ 20 segmentos genéticos DH y 6 segmentos genéticos JH.

Presenta múltiples genes para la región C de la cadena pesada de la Ig. La región C determina la clase y por lo tanto la función biológica del ac particular.

Cada gen C esta flanqueado por intrones y esta separado de los genes VH por un intrón largo. Ver figura.

Alternative (or Differential) Splicingfor IgM / IgD Synthesis

Célula temprana de la línea de diferenciación del linfocito B sufre:

1. Selección de uno de los genes Vk y unión a uno de los segmentos Jk. ¿Cómo? Parece al azar.

2. La unión es dirigida por secuencias de reconocimiento, encontradas en los extremos de estos genes.

1. Transcrito primario de ARN sufre splicing para eliminar secuencias no codificadoras y unir los exones Vk, Jk y Ck.

2. ARNm maduro se traduce en la cadena polipeptídica k en ribosomas sobre RE, y luego se transportan, se elimina péptido señal y cadena k queda libre para unirse a cadena H y formar una molécula Ig. Ver figura.

Síntesis de cadena λGenes λ se encuentran sobre el

cromosoma 22. Es en principio similar a la síntesis de las cadenas k, es decir: involucra re-arreglo de ADN, unión de gen V λ (codifica por la región N-terminal de la región variable λ) con un segmento J λ (codifica por los restantes 13 aa de la región variable λ).

Locus humano λ comprende ~ 40 genes V λ y 4 genes J λ. (la región J λ contiene también “pseudogenes”).

• Cada J λ esta asociado con un gen diferente C λ, es decir hay tres tipos diferentes de polipéptidos C λ en el humano.

• Los genes C mas cerca de los de la región V son “μ” y “δ”, que se transcriben primero durante el desarrollo de células B.

• Utiliza el mismo mecanismo de re-arreglo de las cadenas L. La unión de los diferentes segmentos genéticos es mediada por la recombinasa V(D)J.

• Deben ocurrir dos mecanismos de re-arreglo durante la vida temprana de una célula B particular: Unión de un segmento D con un segmento J, Unión de un segmento V a la unidad DJ, determinando así la especificidad antigénica de la cadena pesada.

• Además ADN re-arreglado se transcribe junto con los genes “μ” y “δ” de la región C.

• Transcrito primario puede sufrir dos splicing alternativos para producir dos tipos de ARNm, VDJ-”μ” o VDJ-” δ”.

• Traducción en RE puede generar dos tipos de polipéptidos “μ” o “δ”.

• ¿Los polipéptidos “μ” y “δ” tienen la misma especificidad antigénica?

Regulación de la expresión genética de las Igs

- Una célula B produce una Ig de una única especificidad antigénica.

- En teoría, podría producir dos tipos de moléculas Ig una sola célula B por tener dos juegos de cromosomas (diploide),?

- Las cadenas Ig (y TCRs) están codificadas por únicamente un conjunto de genes, bien sea materno o paterno. La utilización de un solo cromosoma parental se conoce como exclusión alélica. ¿Cómo explicar este fenómeno?

- Re-arreglo comienza en ambos cromosomas, el primer re-arreglo exitoso sobre un cromosoma inhibe de alguna manera el re-arreglo sobre el otro cromosoma.

- Para cadenas H, re-arreglo VDJ, y para cadenas L, re-arreglo VJ primero para los genes de la cadena k y luego para los de la cadena Lambda.

- Que pasa si la célula no produce re-arreglos de cadenas H y L? No produce receptores Ig y muere por apoptósis.

Cambio de clase o isotipoLos re-arreglos VJ (cadena liviana) y

VDJ (cadena pesada) ocurren en ausencia de antígenos en estadios tempranos de diferenciación de células B. Si embargo, durante la vida de una célula individual, esta puede cambiar y producir una clase diferente de ac, como IgG, IgE o IgA, reteniendo la misma especificidad antigénica, proceso conocido como cambio de clase o isotipo.

¿Qué re-arreglo posterior de ADN involucra?

Cambio de clase: - ocurre en células B maduras,

- es dependiente de estimulación antigénica

y de citoquinas liberadas por células T

- y es distintivo de las cadenas H.Las citoquinas que afectan el cambio de

clase inducen posterior re-arreglo del ADN de la célula B y produce el cambio a otras clases de Igs en una progresión corriente-abajo. De modo que una sola célula B con una única especificidad es capaz de hacer un ac de todas las clases posibles.

• ¿Cómo ocurre el cambio de clase en las células B maduras? Ver figura.

• Todo gen de la región C de la cadena H (CH), a excepción del gen delta, tiene hacia su extremo 5’ una secuencia de bases repetida llamada región S (switch), la cual permite a cualquier región CH asociarse a una unidad VDJ.

• Estimulación ag y de citoquinas lleva a que una célula B con una afinidad VDJ ligada a C “miu” y C “delta” re-arregle su ADN y ligue una VDJ a una región S de otro gen de las región C. El ADN de la región C involucrada se pierde.

• ¿Se puede revertir el cambio de clase?

Isotype Switching

• Se produce un transcrito primario de ARN a partir del ADN re-arreglado. Splicing de transcrito primario genera un ARNm codificador de la Ig a producir.

• El gen CH seleccionado para el cambio de clase depende de la citoquina presente en el momento de la activación antigénica de la célula B.

• En ratones, el interferon alfa promueve síntesis de IgG2, IL-4 promueve síntesis de IgG4 o IgE.

• ¿Cómo las citoquinas realizan esta función?

• Relajando la estructura de la molécula de ADN en ciertos puntos a lo largo del locus Ig, habilitando a la “recombinasa de cambio” reconocer ADN que codifica regiones C especificas.

Generación de la diversidad de acs• Existen varios mecanismos para generar

diversidad: VJ y VDJ1.Presencia de múltiples genes V en línea

germinal 2.Asociación combinatoria VJ y VDJ.

Región variable de cadena liviana. Asociación de cualquier segmento genético V con cualquier segmento genético J puede formar una cadena polipeptídica liviana de 200 cadenas posibles κ y una de 160 cadenas posibles λ.

¿Por qué?

4 ------

40 22

λ Light chain

5 ------ 40 2

κ Light

chain

6 20 50 14

Heavy

chain

# J gene segments

# D gene segments

# V gene segments

Chrom-

osome # Total of

165different

gene segments

Multiple Germ-line Gene Segments

3. Región variable de cadena pesada. Asociación de cualquier segmento genético V con cualquier segmento genético D y J puede formar una cadena polipeptídica pesada de 6.000 cadenas pesadas posibles.

¿Por qué?

Combinatorial V-(D)-J Joining

• heavy chain: 50 (V) x 20 (D) x 6 (J) = 6000 possibilities

• kappa chain: 40 (V) x 5 (J) = 200 possibilities

• lambda chain:40 (V) x 4 (J) = 160 possibilities

Random Association of Heavy and Light Chains

• Kappa-containing Ig molecules: 6000 (H) x 200 (L) = 1.2 x 106 possibilities

• Lambda-containing Ig molecules: 6000 (H) x 160 (L) = 9.6 x 105 possibilities

Therefore 165 germ line gene segments, using combinatorial V-D-J joining and random association of heavy and light chains, can generate a

total of approximately two million DIFFERENT antibody molecules. Additional diversity is created by the remaining four mechanisms.

4.Diversidad de unión e inserción.

Diversidad de unión.

Por falta de precisión en la unión de los segmentos V, J, o V, D y J se pueden generar delecciones o falta de aa que afectan el sitio de unión al ag.

Diversidad de inserción.

Por inserción de pequeños conjuntos de nt en las uniones V-D y D-J. ¿Mecanismo? Enzima TdT (deoxonucleotidiltransferasa terminal).

5. Hipermutación somática. El fenómeno de maduración de afinidad en la respuesta secundaria es explicado por mutaciones puntuales en la unidad recombinada V(D)J, que llevan a cambios individuales de aa.

Estas mutaciones ocurren a una tasa 1.000 veces mayor de lo normal, la hipermutación somática incrementa la variedad de ac producidos por la población de células B.

Parece que ocurre justo después de estimulación ag en centros germinales de bazo y ganglio linfático.

Conversión somática de genes. •En estudios de células de ratón y humanas la diversidad Ig es generada por recombinación V(D)J e hipermutación somática.•Gallinas, conejos, vacas, cerdos, utilizan un mecanismo conocido como conversión somática de genes para generar diversidad de especificidades de células B. •¿Cómo? Involucra intercambio no-recíproco de secuencias entre genes: parte del gen donante se copia en un gen aceptor quien es alterado. Ver figura.

¿Mecanismo? Todavía no está claro. Muchas especies (gallinas, conejos, vacas, y cerdos), a diferencia de ratones y humanos, utilizan conversión somática de genes e hipermutación somática para generar diversidad antes de estimulación ag.

7. Edición del receptor.

Proceso que involucra un segundo arreglo de la unidad recombinada V(D)J. Involucra segmentos no re-arreglados V y D y V y J, para cadenas pesadas. Ver figura.

Este proceso puede ocurrir cuando una célula B interactúa con un ag propio; el segundo re-arreglo puede generar una unidad de reconocimiento V(D)J para un ag foráneo, en lugar de un ag propio.

• Los siete mecanismos mencionados contribuyen a la formación de un repertorio gigantesco de linfocitos B con todas (o casi todas) las especificidades requeridas para tratar con el universo de diversos epítopos.

• El número total de especificidades Ig es de ~ 1015 , el cuál puede aumentar por hipermutación somática.