Presentacin de PowerPoint

RECUPERACIONANTIGENICAGiancarlo Del CarpioEQUIPO BASICO EstufaEQUIPO BASICO Bao de MaraEQUIPO BASICO MicroscopioEQUIPO BASICO Medidor de ph.EQUIPO BASICO Refrigeradoraexclusiva para IHQEQUIPO BASICO Bascula analticaREACTIVOSBASICOS Descripcin.PBS para LavarTRIS - 7.6Recuperador antignico Hidrxido de sodio Alcohol acidoAcetonaXilanoHematoxilina de Mayer Amoniaco (Toxico) Carbonato de litioPeroxido de HidrogenoDAB (carcinognico)(toxico)TECNICA DE IHQ Para un proceso tcnico de Inmunohistoqumica IHQ se requiere de la solicitud debidamente rotulada por el medico.LAMINAS CON ADHESIVO Se clasifican en:CargadasXilanizadas (comerciales laboratorio de IHQ) y de Poly-l-lisinaypreparadasen elNota:Se rotulan las laminas con el numerodebiopsia, anticuerpospositivo.amarcarycontrolControles positivos Importancia:Calidad de elaboracin de tcnica.Confirmacin de diagnostico.Respaldo legalCORTE Procedimiento Enfriar los bloques y cortar en cinco micras). Se utiliza cuchilla descartable.el microtomo (de tresa Cuidar que el corte sea liso y no presente pliegues. Se utiliza el bao de flotacin a 45 grados centgrados de temperatura. Secar en la estufa por 30 minutos a 60 grados centgrados.MICROTOMOESTUFARECUPERACIONANTIGENICA Se dividen en:EnzimticaNo EnzimticaEnzimtica:La temperaturaoptimay el tiempo deincubacin depender del tiempo en quelostejidos hayan sido sometidos al tipo de fijadordel antigeno buscado.CONTINUACION RECUPERACIONANTIGENICANo Enzimtica:Horno microondas.Su uso es un mtodo muy eficiente para el tratamiento de la recuperacin antignica.Se recomienda estandarizar la cantidad de solucin a usar, el numero de laminas a tratar y el tiempo de procesamiento; la potencia ideal del horno ser aquella que haga ebullir la solucin despus de 2 a 3 minutos y que a final del ciclo retenga al menos al 70%.CONTINUACION RECUPERACIONANTIGENICA (NoEnzimtica)Vaporera.Tambin representa una buena alternativa y sepuede combinar conuso de microondas.elBao de Mara.tiene varias ventajas general es accesibleenencualquier laboratorio, fcilde utilizar y produce buenos resultados.SOLUCIONES AMORTIGUADORAS OTAMPON Estassoluciones cumplenuna funcinmuy importante en las tcnicas de IHQ yaquesonelmedioenelcualse desarrollaelreconocimientodelantigenoporlosanticuerposasquedebe deparecersemuchoa lascondicionesnormalesquetiene en el organismo vivo (ph.7.3 a 7.4).RECUPERACION ANTIGENICASOLUCIONES AMORTIGUADORAS O (ph. 7.6)ENTAMPON Se calienta el Bao de Mara a 98-99 gradoscentgrados con la solucin recuperadora (Citrato de sodio con ph. 6.0 o recuperador antignico.) Se colocan las laminas de 45 minutos a una hora y se dejan enfriar por 20 minutos. Colocar en PBSBLOQUEO DE LA PEROXIDASAENDOGENA Colocar las laminas en solucin deperoxidedurantedeunahidrogenoal3%parahora(sirvesangre)eliminarel exceso de LavarrpidamenteconaguadestiladaMarcadoresEPITELIALES: Citoqueratina Ag de membrana epitelial Ag carcinoembrionarioLINFOCITOS: CD CD CD45 (Ag comn leucocitario)20 (L26 Linfocitos B)68MarcadoresMESENQUIMALES: Vimentina Desmina ActinaNota: Leerinstructivo.Preparacin de AnticuerposPrimarios Colocar en PBS Prepararanticuerpos primariosDILUCIONES1:20------1 parte de anticuerpo y 19 partesde diluyente1:100----1 parte de anticuerpo y 99 partes de diluyente1:500----1 parte de anticuerpo y 499 partes de diluyente1:1000---1 parte de anticuerpo y 999 partes de diluyenteINCUBACION Limpiaralrededordel tejido el excesode PBSINCUBACION Colocar el anticuerpoprimarioINCUBACION Incubar con el anticuerpo primario en una cmara hmeda cuidando de que el nivel de agua sea adecuado y que este no se derrame tapar bien y evitar corriente de aire y luz mantener 45 minutos o durante toda la noche.AutostainerplusINCUBACION Lavar con PBS Incubar con elanticuerpo secundario durante45 minutosINCUBACION Lavar con PBS Incubar con el complejoAB durante 45 minutos Lavar con PBS Revelar con DABRevelado Incubar el tiempo necesario para que el color marrn aparezca, detener la accin reveladora con agua del chorroRevelado Revisar en el microscopiola reaccinContraste Lavar con agua Contrastar con hematoxilina de Mayer los citoplasmticos con verde brillante los nucleares Secar en la estufa y montarFinalizacindelProceso