5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

36
ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 1 La espectroscopia de absorción se comenzó a utilizar para la determinación de alcaloides. Las primeras referencias acerca del estudio del espectro de ultravioleta se remontan a 1833, en el que Brewster trabajó con la descomposición y dispersión de la luz en sólidos y fluidos. En la revista Philosophical Transactions of the Royal Society de 1852, está documentado el primer trabajo serio, realizado por Stokes. En 1885, William N. Hartley utilizó el espectrógrafo de cuarzo original de Miller y reportó el primer espectro ultravioleta en compuestos narcóticos en la misma revista que publicó a Stokes, y describió los espectros de 32 alcaloides, entre los que se encontraban la morfina, codeína, tebaína, papaverina, diacetilmorfina, entre otros. Hartley determinó que todos esos alcaloides contenían un núcleo condensado, derivado del benceno o de la piridina por la extensión de la banda de 2600 a 3000 Angstroms (fig. 1). Mostró también el efecto de las sustituciones de alquilo y acetilo sobre la curva de absorción. Posteriormente en 1903, en el Journal of the Chemical Society, Dobbie publicó los espectros de otros alcaloides como la cotarnina, berberina, coridalina, laudanina, quinina, neopina y otros alcaloides de isoquinolina y discutió acerca de la constitución molecular de esos compuestos basándose en los espectros obtenidos. Según Lothian, quien en 1949 hizo un análisis crítico de los primeros trabajos en espectroscopia de absorción, en su libro Absorption Spectrophotometry menciona: “Unfortunately, much of the work done prior to about 1910 was valueless, since the methods employed were entirely qualitative, or at best semi- quantitative, compared with those available today. Some uniformity was introduced however, by Hartley and other workers after him who developed a method in which the wavelenghts at which various thicknesses of a given solution ceased to transmit were recorded photographically”.

description

espectroscopia

Transcript of 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

Page 1: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 1

La espectroscopia de absorción se comenzó a utilizar para la determinación de alcaloides. Las

primeras referencias acerca del estudio del espectro de ultravioleta se remontan a 1833, en el que Brewster

trabajó con la descomposición y dispersión de la luz en sólidos y fluidos. En la revista Philosophical

Transactions of the Royal Society de 1852, está documentado el primer trabajo serio, realizado por Stokes.

En 1885, William N. Hartley utilizó el espectrógrafo de cuarzo original de Miller y reportó el primer espectro

ultravioleta en compuestos narcóticos en la misma revista que publicó a Stokes, y describió los espectros

de 32 alcaloides, entre los que se encontraban la morfina, codeína, tebaína, papaverina, diacetilmorfina,

entre otros. Hartley determinó que todos esos alcaloides contenían un núcleo condensado, derivado del

benceno o de la piridina por la extensión de la banda de 2600 a 3000 Angstroms (fig. 1). Mostró también

el efecto de las sustituciones de alquilo y acetilo sobre la curva de absorción. Posteriormente en 1903, en

el Journal of the Chemical Society, Dobbie publicó los espectros de otros alcaloides como la cotarnina,

berberina, coridalina, laudanina, quinina, neopina y otros alcaloides de isoquinolina y discutió acerca de la

constitución molecular de esos compuestos basándose en los espectros obtenidos.

Según Lothian, quien en 1949 hizo un análisis crítico de los primeros trabajos en espectroscopia de

absorción, en su libro Absorption Spectrophotometry menciona: “Unfortunately, much of the work done

prior to about 1910 was valueless, since the methods employed were entirely qualitative, or at best semi-

quantitative, compared with those available today. Some uniformity was introduced however, by Hartley

and other workers after him who developed a method in which the wavelenghts at which various

thicknesses of a given solution ceased to transmit were recorded photographically”.

Page 2: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 2

Henri, en 1913, fue el primero en graficar el logaritmo del coeficiente de extinción molar contra la

longitud de onda (fig. 2), de acuerdo a la ecuación: . Nótese que el espectro para la codeína

muestra un máximo a 2830 Angstroms.

En Physikalische Zeitschrift en 1913, Henri amplió el concepto de cromóforo establecido por Hartley,

es decir, que el espectro de absorción no resulta de la acción de la radiación incidente sobre la molécula

total, sino sobre partes específicas de la molécula. Mostró que la cetonas simples exhiben una banda de

absorción con un índice de absorbencia de casi 15 entre 270 y 300 nm con un máximo a 280 nm.

Hans Fischer en 1925, creyó que las impurezas juegan un papel mínimo en el análisis

espectrofotométrico y estableció que la espectrofotometría no modifica la molécula al mismo tiempo que

es identificada. En la figura 3 se muestran tres espectros obtenidos por Fischer, en donde grafica el

logaritmo del coeficiente de extinción molar contra A, el número de onda. La similaridad de las curvas de

absorción del ácido benzoico, benzoilecgonina y cocaína se muestran en la figura 3.

Page 3: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 3

Eisebrand en 1926, publicó que la morfina puede ser determinada en cantidades tan bajas como 0.2

mg, utilizando el espectro de absorción.

En 1927 Acta Phytochimica publicó que Kitasato fotografió el espectro de absorción de 42 alcaloides

y clasificó los alcaloides en cuatro clases principales con las siguientes estructuras básicas:

La espectrofotometría es una técnica que mide la interacción de moléculas con la radiación

electromagnética. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz ultravioleta de los espectros

electromagnéticos presenta una energía de 150- 400 kJmol-1. La energía de la luz es usada para promover

electrones de un estado de excitación a otro. Un espectro es obtenido cuando la absorción de luz es

medida en función de una frecuencia o longitud. Moléculas con electrones deslocalizados en sistemas

aromáticos a menudo absorben la luz a 150-400 nm (ultravioleta) o en la región visible de 400-800 nm.

Page 4: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 4

La espectrofotometría de absorción es usualmente usada con moléculas disueltas en un solvente

transparente. La absorbancia de un soluto depende linealmente de la concentración y por consiguiente la

espectrofotometría de absorción es ideal para hacer mediciones cuantitativas. La longitud de absorción y

la fuerza de absorbancia de una molécula no sólo depende de la naturaleza química, si no del ambiente

molecular en donde se encuentre el cromóforo. La espectrofotometría de absorción es por lo tanto una

excelente técnica para seguir reacciones de unión a ligando, catálisis enzimáticas y transiciones

conformacionales en proteínas y ácidos nucleicos. Las mediciones espectroscópicas son muy sensibles y

se requieren pequeñas muestras de material para el análisis.

El espectrofotómetro es el nombre genérico de todos los aparatos basados en esta técnica. El

espectrofotómetro puede estar equipado con un sólo detector o un detector multicanal, configurados por

medidas con un solo rayo (SB) o doble rayo (DB) y designados para la medición de una longitud fija o para

adquirir una espectro de absorción completo.

El espectrofotómetro de un solo detector es el más común y en este caso particular la banda de

longitud de la fuente de radiación es trasmitida por el selector de longitud a la muestra y finalmente al

detector como se muestra en la figura 5a y 5b. Con el equipo SB un rayo pasa a través de la muestra y este

coincide con el detector. En los equipos DB (figura 5b), el rayo es desviado a una longitudes seleccionada

con un espejo rotatorio obteniendo dos rayos, pasando alternativamente por la celda que contiene la

muestra y la celda de referencia. El rayo que viene de la muestra y de la referencia se mezcla, y éste es

llega hasta el detector.

Componentes del espectrofotómetro

En la actualidad son muchos los tipos y modelos de espectrofotómetros que existen, esto complica

la descripción de sus partes o por lo menos el orden de estas. No obstante aquí seguiremos la clasificación

más general.

El espectrofotómetro consta de 5 partes:

Fuente de radiación

Selector de longitud de onda o analizador

Recipiente para contener la muestra

Detector de energía radiante.

Sistema de registro de datos.

A continuación se enumeran las características de varios componentes del espectrofotómetro UV-

visible.

Page 5: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 5

1.- Fuentes de radiación: Las fuentes de radiación son generalmente lámparas de tungsteno o tungsteno-

halógeno para proveer de una radiación continua adecuada del espectro visible al infrarrojo cercano. Para

la capacidad de radiar con los UV se necesita una lámpara de H2 o D2. Una lámpara de D2 es generalmente

preferida que una lámpara de H2 por que emite una radiación tres veces mayor. Por simplicidad, una

lámpara de D2 y H2 puede servir como una sola fuente para emitir en la región UV-visible aunque la

radiación en el espectro visible es más pequeña que la emitida por una lámpara de tungsteno y al mismo

tiempo poco estable. En algunos instrumentos la fuente de radiación es modulada con un dispositivo

mecánico.

Fuentes continuas: Emiten radiación en un amplio rango de longitud de onda cuya intensidad varía de

manera gradual en función de dicha ג. Esta radiación es constante respecto al tiempo. Se utiliza sobre todo

en absorción molecular. En UV-Vis e IR. Las más comunes son:

Lámpara de filamento de tungsteno, para visible y UV próximo.

Lámpara de filamento de haluros de tungsteno, emiten con mayor intensidad y

la más común es la de yoduro de tungsteno.

Lámpara de hidrógeno y deuterio, para la región ultravioleta.

Estas fuentes continuas se encuentran en la siguiente tabla. Una lámpara

ordinaria de filamento de tungsteno da una distribución de ג de 320 a 2500 nm (Figura

25.4). Estas lámparas funcionan generalmente a temperatura cercanas a 2900 °K,

produciendo una radiación útil entre 350 y 2200 nm aproximadamente.

Page 6: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 6

Las lámparas de tungsteno/halógeno, también llamadas

cuarzo/halógeno, contienen pequeñas cantidades de yodo

dentro de la cubierta de cuarzo donde está alojado el

filamento. El cuarzo permite que el filamento funcione a 3500

°K aproximadamente, lo que produce mayores intensidades

y amplia el rango de ג, tienen una vida útil de más del

doble que una de tungsteno. En presencia de yodo, el

tungsteno sublimado reacciona y cede moléculas de WI2 gaseoso que

luego difunden de nuevo hacia el filamento caliente y allí se

descompone y vuelve a depositarse como átomos de W.

Las lámparas de deuterio (y de hidrógeno) se usan

para proporcionar radiación continua en la región UV.

Una lámpara de deuterio consta de un tubo cilíndrico

con deuterio a baja presión, con una ventana de cuarzo

por la que sale la radiación

Fuentes discontinuas o de líneas: Emiten un número limitado de líneas espectrales, cada una de

las cuales abarca un intervalo determinado de longitudes de onda. También se le conoce

como fuentes pulsantes, ya que emiten radiación en forma interrumpida a modo de ráfagas.

Se emplean en absorción atómica, espectroscopia de fluorescencia y espectroscopia Raman.

La más común es la lámpara de vapores de mercurio.

2.- Selector de longitud: Una porción de la radiación emitida por la fuente es colectada y dirigida al

selector de longitud o a la muestra con algunos lentes o espejos. En instrumentos con un solo detector, el

selector de longitud es normalmente puesto antes del compartimento en donde se encuentra la muestra

para minimizar el calentamiento o fotodescomposición de la muestra por radiación a longitudes no

monitoreadas. Si este efecto no es significante, el selector de longitud puede ser pasado después de la

celda del compartimento de la muestra. Con espectrofotómetros multicanales, el detector multicanal debe

ser colocado en el plano focal del espectrógrafo; la celda con la muestra tiene que ser puesta antes que el

selector de longitud e iluminado con radiación blanca.

Los fotómetros emplean la interferencia con filtros para seleccionar la longitud deseada, únicamente

se necesita tener los filtros correspondientes.

Page 7: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 7

2.1. Filtros

Los filtros están compuestos por un material que trasmite selectivamente una longitud de onda,

absorbiendo todas las demás. Existen dos tipos de filtros:

Filtros de interferencia: Se basan en las interferencias ópticas, para así proporcionar bandas de

radiación estrechas. Constan de un dieléctrico trasparente (fluoruro de calcio o magnesio) que está

delimitado por dos películas metálicas semitransparentes. Al incidirle la radiación parte de esta se refleja

en las películas metálicas produciéndose interferencias constructivas o destructivas, reforzando o

disminuyendo la radiación.

Filtros de absorción: Absorben una amplia gama de longitudes de onda y deja trasmitir el resto.

Normalmente se componen de una gelatina coloreada o un vidrio coloreado. Tienen un ancho de banda

mayor que los de interferencia. Dentro de estos se encuentran los filtros de corte, que trasmiten casi el

100% en una zona de espectro, pero a partir de un determinado valor la trasmitancia es igual a cero.

2.2. MONOCROMADORES

Son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas que los filtros y además pueden

ajustarse fácilmente dentro de la zona del espectro. La calidad de un monocromador depende de la pureza

Page 8: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 8

de la radiación de salida, de su capacidad para resolver longitudes de onda adyacentes, de su poder de

captación de luz y de su ancgura espectral. Tienen diferentes partes:

Rendija de entrada: Reducen al máximo la luz difusa y evita que la luz dispersa entre en el sistema.

Lente colimadora: Produce un haz paralelo de radiación electromagnética.

Prisma o red de difracción: dispersan la radiación en sus longitudes de onda individuales.

Lente: para enfocar la radiación electromagnética.

Rendija de salida: impide que la luz difusa atraviese la cubeta.

Tipos:

Monocromador de red

Monocromador de prisma

Monocromador de red: Consiste en una superficie dura, pulida y ópticamente plana, en la que se ha

gravado un número de surcos paralelos próximos y a distancias iguales entre sí. Al incidir la radiación

electromagnética sobre estos se descompone en distintas longitudes de onda, que se reforzarán o no,

dependiendo del ángulo de refracción con el que salgan.

Para las regiones ultravioleta y visible tiene de 300 a 2000 surcos /mm y para el infrarrojo de 10 a

200 surcos/ mm.

Red de escalerilla: Como su nombre indica tiene forma de escalera. Esta geometría proporciona

una difracción muy eficiente de la radiación.

Red en escalera: Similar a la anterior pero con menos surcos.

Red cóncava: Similar a la anterior pero formada en una superficie cóncava. Este diseño permite un

monocromador sin espejo o lentes colimadores.

Red holográfica: El gravado de los surcos se hace con tecnología láser. (Red littrow).

Page 9: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 9

Monocromador de prisma: Fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico u otro

material que permita el paso de la radiación. La radiación que penetra en el prisma se dispersa en mayor

o menor medida debido al índice de refracción que este tiene.

Hay dos tipos de diseño:

Cornu: Compuesto por 2prismas físicamente unidos, uno

es dextrógiro (desvía la radiación hacia la derecha) y el otro es

levógiro (desvía la radiación hacia la izquierda). Debido a esto,

el haz paralelo se desdobla en distintas longitudes de onda.

Littrow: Prsma en el que una cara es un espejo. Cuando llega la radiación electromagnética hay un

cambio de dirección y una reflexión debido al espejo por lo que la radiación se desdobla

en distintas longitudes de onda. Es más pequeño y compacto que el de cornu.

En un espectrofotómetro con un detector, una imagen de la fuente es enfocada en la entrada de una

abertura del monocromador que hace que el rayo se disperse. En espectrofotómetros de un solo rayo es

usado un monocromador de baja dispersión con una abertura fija (típicamente de 2 a 20 nm) y un ajustador

manual de longitud como se muestra en la figura 6. Los espectrofotómetros SB y DB de alta calidad están

basados en monocromadores como medios de dispersión. Dependiendo del instrumento, el espectro de

puede ser variado, de 10 nm a 0.5 nm.

Page 10: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 10

Los espectrofotómetros de barrido (scanning) usualmente proporcionan amplios rangos de

longitudes de onda para analizar (de 1 a 2000 nm min-1), algunos espectrofotómetros típicos comerciales

de doble rayo son mostrados en la figura 7. Los espectrofotómetros rápidos basados en un componente

óptico de oscilación en el monocromador son capaces de adquirir espectros en un segundo o menos.

Muchos espectrofotómetros de longitud fija o de barrido de varias longitudes ya sean automáticos o

manuales, permiten la colocación de filtros en el tren óptico para reducir la pérdida de radiación de

diferencias significativas en la longitud. En espectrofotómetros multicanales la resolución de la longitud es

determinada por el tamaño del pixel en el diodo. Por lo tanto, la entrada a la abertura del espectrógrafo

es fijada a la misma anchura de abertura que la anchura de un diodo; la resolución es del orden de 1 a 2

nm.

Page 11: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 11

Page 12: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 12

3.- Compartimiento de la muestra y celdas para la muestra. El compartimiento de la muestra es un

compartimiento ajustado a la luz con una tapa que da seguridad sosteniendo una o más celdas con la

muestra. La radiación trasmitida por el selector de longitud (o de una fuente en un espectrofotómetro

multicanal) es dirigida a la celda que contiene la muestra. En la mayoría de los espectrofotómetros existen

otros accesorios ópticos usados para colimar el rayo de luz y enfocarla hacia el centro de la celda que

contiene la muestra y la referencia. El cambio en la amplitud de la luz al pasar por la muestra puede ser

mínima, así que todos los rayos viajan aproximadamente al mismo lugar. A menudo, diferentes lentes o

espejos trasmiten la luz a la muestra y después al detector.

Es crítico que en el compartimiento de la muestra se permita insertar la celda de la muestra

fácilmente y así mismo removerse para que la muestra pueda localizarse de la misma manera y por lo tanto

ser reproducible. Una base para múltiples muestras puede ser de movimiento rotatorio o de movimiento

lineal para que puedan ser cargadas varias muestras y colocadas en el mismo compartimiento en donde

pasa el rayo de luz, esto puede ser de manera manual o automatizada.

Algunos espectrofotómetros pueden regular la temperatura de las muestras mediante la circulación

constante de agua en el compartimiento de la muestra, el agua debe de tener la temperatura que se

necesita para la muestra. Alternativamente, existen dispositivos termoeléctricos que son utilizados para el

control de la temperatura. En este mismo compartimiento existe un agitador electromagnético que

funciona para mezclar algunas soluciones que se le agregan a la muestra.

Existe una amplia variedad de celdas (diferentes materiales, tamaños y formas). Los materiales más

comunes de los que están constituidos son vidrio, cuarzo, sílice o varios plásticos. Las más utilizadas son

las celdas de cuarzo y sílice para medir la absorbancia a longitudes de 300 nm, donde las celdas de vidrio

y otros plásticos absorben significantemente. La mayoría de las celdas tiene la forma y las dimensiones

que se muestran en la figura 8. La celda estándar de un espectrofotómetro se muestra en la figura 8a, ésta

presenta 1 cm de longitud interna y tiene un volumen interno de 2.5 mL. Para muestras pequeñas existen

semimicro y micro celdas (figura 8b) de 1 cm de longitud interna pero con un pequeño volumen interno.

Algunas celdas pueden ser compradas con 1 mm a 5 cm de longitud interna. Las celdas con una pequeña

longitud interna (micro celdas) son utilizadas para soluciones de alta absorción. Celdas con longitud de 10

cm presentan una forma cilíndrica (figura 8c) y son apropiadas para medir la absorción de soluciones o

gases. En algunos espectrofotómetros simples o fotómetros son utilizadas unas celdas en forma de tubo

que son de bajo costo (figura 8d).

Page 13: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 13

En las celdas estándar, las soluciones se agregan manualmente o en algunos casos automáticamente

con un dispensador electrónico. Diferentes celdas pueden ser utilizadas para diferentes soluciones. La

celda de la muestra se vacía después de ser ocupada y posteriormente se enjuaga para seguirse utilizando.

La muestra también puede ser aumentada con el uso de varios tipos de celdas de flujo (figura 8e)

que rellenan la celda de manera automatizada. Las soluciones de prueba y enjuagado se bombean a la

celda y son detenidas para medir la absorbancia; es como un sistema de retroalimentación, en donde

primero se bombea la muestra, se mide la absorción y después se enjuaga. El tiempo de bombeo es

ajustado para asegurar que las soluciones previas son completamente remplazadas por la siguiente

solución o muestra. Este sistema es utilizado con dispensadores automatizados para proveer un alto

análisis secuencial de un lote o varias muestras. Las celdas de flujo pueden ser utilizadas para medir la

absorción de un flujo, con análisis basados en flujos continuos o discontinuos. Los buffers pueden

mezclarse con los reactivos y bombeados al flujo de la celda. La proporción del flujo y los datos adquiridos

con el tiempo son controlados para medir la absorbancia debido a que la absorbancia se mide a tiempos

apropiados. Existen celdas diseñadas especialmente para detectores de absorción en HPLC (figura 8f), en

estas celdas regularmente se utilizan volúmenes de 0.5 a 2 μL y la proporción del flujo es crítico para

obtener una buena elusión.

Page 14: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 14

4.- Detectores. Los primeros detectores fueron el ojo humano y las películas o placas fotográficas,

posteriormente se han sustituido por trasductores que convierten la energía radiante en una señal

eléctrica.

El detector ideal debe de responder a un amplio rango de longitudes de onda, tener alta sensibilidad,

una elevada relación entre señal/ruido, una respuesta constante. Además la señal producida debe de ser

proporcional a la potencia y amplificable.

Se utilizan dos tipos de detectores, los que responden a los fotones y los que responden al calor.

4.1. Detectores de fotones: Cuando la radiación incide sobre el detector puede producir un

desprendimiento de electrones (efecto fotoeléctrico) o promover electrones a otros niveles energéticos

(fotoconducción).

Existen diferentes tipos de detectores de fotones:

Células fotovoltaicas: Al incidirle la radiación

electromagnética al cátodo promueve electrones a niveles

energéticos más altos, provocando huecos que favorecen el paso

de corriente eléctrica. Se utilizan en la zona visible.

Detectores semiconductores: Al igual que el anterior se basan en la fotoconducción.

sensibles al infrarrojo cercano.

Fototubos: Constan de un cátodo semicilíndrico y un ánodo. Cuando le llega la radiación al

cátodo se desprenden los electrones. Aplicando una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo se

crea una corriente eléctrica. Se utilizan en la región ultravioleta-visible.

Fotomultiplicador: Como los anteriores se basa en el efecto fotoeléctrico. Llevan

cátodos adicionales llamados dínodos que vuelven a emitir más electrones amplificadondo la señal.

Page 15: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 15

4.2. Detectores de calor: Son detectores de térmicos compuestos por un cuerpo negro que absorbe

toda la radiación que le llega aumentando su temperatura que es lo que medimos. Se utiliza sobre todo

en el infrarrojo. Existen varios tipos de detectores de calor:

Termopar: Consiste en dos metales unidos por dos puntos, uno protegido de la radiación

electromagnética y otro expuesto a ella por lo que aumenta la temperatura. Entre las dos uniones se genera

un potencial que varía dependiendo de la diferencia de temperatura.

Bolómetro o termómetro de resistencia: Compuesto por materiales que forman un

puente eléctrico y presentan un cambio de resistencia relativamente grande con los cambios de

temperatura.

Células de Golay o termómetro de gas: Compuesto por un gas encerrad en un

compartimiento de pared elástica, al llegar la radiación el gas aumenta su temperatura y aumenta el

volumen provocando cambios en la pared elástica. Eso hace que se modifique el haz de radiación sobre

un espejo y eso es lo que se mide.

5.- Procesamiento de la señal y lectura. El detector da una señal que contiene información sobre el poder

de radiación trasmitido por una solución de muestras o referencia. La señal puede ser procesada por un

hardware o software para extraer la información deseada y para convertirla a una forma conveniente y

desplegarla en un dispositivo de lectura.

En todos los espectrofotómetros se requiere una señal análoga procesada. Con un

espectrofotómetro de un solo detector o con un fotómetro, un amplificador operacional (op amp), una

configuración de voltaje (I-V) es transformada por el fotodiodo en un voltaje de amplitud conveniente.

Con instrumentos no computarizados el procesamiento de la señal se logra con un circuito análogo

aunque los despliegues digitales son muy comunes. Con equipos computarizados de un solo detector, la

señal de amplitud de voltaje es digitalizada por un convertidor análogo-digital. Los datos digitales son

almacenados en la memoria para después ser procesado por el software. Los espectrofotómetros

multicanales son siempre computarizados debido a la gran cantidad de datos generados en poco tiempo.

Así la información espectral de típicamente 300 a 1000 fotodiodos puede ser leída, amplificada, digitalizada

y almacenada en algunos milisegundos.

Con espectrofotómetros no computarizados de un solo rayo pensando para medir a una longitud

de onda fija, la conversión del voltaje es desplegada directamente dentro de un dispositivo para trasmitir

la lectura. La lectura directa de la absorbancia es necesaria para convertir la foto señal a un voltaje

proporcional a la absorbancia con circuitos logarítmicos antes de desplegarla. El dispositivo de lectura en

este caso es típicamente un análogo o voltímetro digital. Si la fuente es modulada, es necesario sincronizar

la detección electrónica para extraer la información de la amplitud antes de desplegarla o hacer la

conversión aritmética.

Page 16: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 16

El procesamiento de la señal con espectrofotómetros de doble rayo no computarizados es más

complicada. La amplitud de la señal de la muestra y de la referencia se extrae primeramente de la señal

modulada, entonces la relación o el logaritmo de la relación de la señal de la muestra y la referencia es

computarizada. Para instrumentos de barrido (scanning), los datos del espectro son trazados en tiempo

real en un registrador análogo.

Con espectrofotómetros basados en microcomputadoras, los pasos discutidos anteriormente son

digitalizados, las señales de la muestra y la referencia son almacenadas por un software. El dispositivo de

lectura puede ser un medidor digital, un trazador, una impresora o una cámara de video o una combinación

de estos dispositivos.

En todos los espectrofotómetros, el ruido equivalente al ancho de banda (Δf) es controlado por

algunas constantes de tiempo limitantes o la integración de tiempo que este arriba de 1 s en instrumentos

simples o controlando un rango de .01 a 10 s con los instrumentos más sofisticados. En espectrofotómetros

multicanales, Δf es determinada por la integración del tiempo en donde el fabricante asegura que se

encuentra antes de la saturación de los diodos por la alta intensidad.

La interacción de la radiación con la materia puede dar lugar a distintos tipos de procesos que

incluyen; dispersión, reflexión, absorbancia, fluorescencia/fosforescencia o, por ejemplo, reacciones

fotoquímicas que pueden originar la ruptura de enlaces.

Las interacciones entre la materia y la energía en la región visible del espectro se manifiestan en

forma de color. Cuando una fuente de luz blanca, que emite radiación en todo el intervalo visible del

espectro de la radiación electromagnética, incide sobre una sustancia coloreada, parte de la radiación se

va a absorber y el resto pasará a través, o se reflectará si se trata de un material sólido. Nuestros ojos

detectar y perciben el color de la luz que no se absorbe, es decir de la radiación trasmitida o reflactada por

el objeto. Así por ejemplo, una hoja de una planta es verde porque la clorofila absorbe en las regiones de

azul (470 nm) y roja (650 nm) del espectro de luz visible. De forma análoga el zumo de naranja tiene este

color por que se absorbe todas las longitudes de onda del visible excepto la luz naranja (~ 600 – 650 nm)

y si vemos una pelota de color naranja es porque la radiación visible que incide sobre ella se absorbe,

excepto la luz naranja que se ve reflejada.

La región ultravioleta (UV) se subdivide en dos zonas espectrales, el UV de vacío o lejano, situado

por debajo de los 200 nm y el UV cercano que corresponde al intervalo de 200 a 400 nm. En algunos casos,

sin embargo, se considera que el límite superior del UV es 380 nm y el inferior 190 nm. El límite inferior

viene definido, fundamentalmente por factores instrumentales tales como, la falta de sensibilidad del

detector, la baja trasmitancia de los componentes ópticos a estas longitudes de onda y la absorción de

oxígeno del aire. Además, la mayoría de los disolventes usados en UV presentan trasmitancias muy

Page 17: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 17

reducidas a bajas longitudes de onda. Por todo ello, el ultravioleta de vacío es una zona de poca utilidad

analítica para el análisis de rutina debido a restricciones instrumentales y experimentales que se encuentran

al trabajar a tan bajas longitudes de onda.

Para entender las interacciones de la radiación con la materia vamos a considerar la estructura

electrónica de las moléculas. Una molécula puede presentar varios tipos de orbitales: de tipo , y del tipo

π. Los primeros presentan una densidad electrónica de simetría cilíndrica alrededor del eje internuclear y

corresponden a la formación de enlaces sencillos entre átomos o de uno de los enlaces en el caso de

enlaces dobles o triples. Estos orbitales pueden ser de dos tipos: enlazantes (), de menor energía que los

orbitales atómicos de partida, y antienlazantes (*), más energéticos que los orbitales atómicos de partida.

Los orbitales de tipo π se forman a partir de la combinación de orbitales atómicos de tipo p

perpendiculares al eje del enlace. Se caracterizan porque la densidad electrónica máxima entre los dos

núcleos está por encima y por debajo del plano nodal. Pueden ser también enlazantes (π) o antienlazantes

(π*) (Figura 6.2.). Cuando se forma un enlace doble uno de ellos será del tipo π, y dos en el caso de enlaces

triples.

Los orbitales moleculares no enlazantes (), la última categoría de orbitales moleculares, no

contribuyeron a la estabilidad o inestabilidad de la molécula. Están formados por pares de electrones no

compartidos. Su energía es equivalente a la de los electrones en los átomos individuales que forman la

molécula.

La energía de los orbitales, y por tanto de los electrones que los ocupan, están cuantizados. En

ausencia de un estímulo externo la molécula se encontrará en su estado de energía más bajo que se conoce

como estado fundamental. Cuando la radiación de la longitud de onda adecuada incide sobre ella se va a

Page 18: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 18

producir la promoción de un electrón, desde el orbital molecular ocupado de mayor energía (HOMO) al

orbital molecular de menor energía (LUMO). La molécula pasará a encontrarse en su estado de mayor

energía denominada estado de excitación.

La zona UV-visible ocupa un intervalo de frecuencias o longitudes de onda relativamente pequeños

dentro del espectro de radiación electromagnética. En este intervalo, las diferencias de energía

corresponden a transiciones entre estados electrónicos de los átomos y de las moléculas y por eso también

recibe la denominación de “espectroscopia electrónica”. Los espectros electrónicos de las moléculas se

encuentran en el intervalo de longitudes de onda entre 100 y 800 nm.

Para que una substancia sea activa en el visible debe ser colorida: el que una substancia tenga color,

es debido a que absorbe ciertas frecuencias o longitudes de onda del espectro visible y transmite otras

más. Por ejemplo: una solución es amarilla debido a que dentro de la región visible absorbe radiación en

el rango de 435 a 480 nanómetros. En este rango de longitudes de onda se encuentra el color azul del

visible, por lo que este compuesto absorbe el color azul y transmite los colores complementarios que dan

origen al color amarillo de la solución mencionada.

La absorción y transmisión de las longitudes de onda de la región visible de esta parte del espectro

no es la misma en substancias que den diferentes tonalidades de amarillo, por lo que podemos tener una

gama diferente de tonalidades como: amarillo canario, amarillo limón, amarillo pálido, etc.

La Tabla I nos da una relación entre rango de longitudes de onda en que absorbe el compuesto,

color absorbido y color observado o transmitido.

El Ultravioleta del vacío se considera aquella región comprendida de los 100 a los 190 nm. Se le llama

así debido a que el nitrógeno atmosférico absorbe este tipo de radiación, por lo que se debe efectuar el

vacío para poder excluir las absorciones de este gas de las absorciones del compuesto en estudio.

Las complicaciones técnicas asociadas al vacío necesario, además de la poca utilidad que se obtiene

en el UV del vacío, han hecho que esta técnica prácticamente no tenga uso y de hecho no hay equipos

disponibles comercialmente para aplicaciones de este tipo de espectroscopia. El espectro Visible y

Ultravioleta, por el contrario, tienen amplia aplicación y son técnicas que se emplean continuamente.

El rango visible se considera de los 380 a los 750 nanómetros. El rango del Ultravioleta cercano o del

cuarzo es de 190 a 380 nm.

Page 19: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 19

La base de la espectroscopia visible y ultravioleta consiste en medir la intensidad del color (o de la

radiación absorbida en UV) a una longitud de onda especifica comparándola con otras soluciones de

concentración conocida (soluciones estándar) que contengan la misma especie absorbente. Para tener esta

relación se emplea la ley de Beer, que establece que para una misma especie absorbente en una celda de

espesor constante, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración.

La coloración de la solución se debe a la especie absorbente y esta coloración puede ser natural o

inducida. La coloración natural puede ser la base de la cuantificación de una especie, como por ejemplo:

la clorofila en ciertas plantas, los complejos metálicos que se encuentran presentes en solución acuosa,

como son los iones Cobre (II), Manganeso (VII), Cobalto (III), etc.

Más frecuentemente, se induce a la formación de un complejo colorido que absorba en el visible, y

que sea específico para el elemento o compuesto que se desea cuantificar colorimétricamente. Ejemplo:

la formación de un complejo colorido cuando el cloro libre reacciona con la ortotolidina, o la cuantificación

de glucosa en sangre y orina por la acción del molibdato en determinadas condiciones. O la intensificación

del color del ion cobre, al formar un complejo amoniaco-cobre, el cual se forma cuando a una solución

acuosa que contiene iones cobre se le agrega hidróxido de amonio.

Page 20: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 20

Para esto se requiere de un control de ciertas condiciones, que inhiben o favorecen la formación de

compuestos coloridos:

pH: El pH es un factor determinante en la formación de ciertos complejos o compuestos coloridos.

Cuando el pH influye en la técnica analítica, se requiere de un control adecuado de este valor para

lo cual se agrega alguna solución buffer, o estabilizadora de pH.

Temperatura: La temperatura es factor importante, sobre todo en reacciones en las cuales el factor

cinético es la base del análisis.

Tiempo: En ciertas reacciones, se requiere de un tiempo determinado para que se tenga una lectura

estable de absorbancia de la solución producida. Es también factible, que los complejos o

compuestos formados sean lábiles, esto es, que después de un cierto tiempo se descompongan a

otros productos diferentes, por lo que el tiempo indicado al que debe hacerse la lectura debe

establecerse en base a la experiencia y los resultados que se tengan.

Orden de Adición de los Reactivos: Si la adición de reactivos no es la adecuada, este factor también

puede producir resultados inesperados, ya que existe la posibilidad de que substancias

interferentes reaccionen con las substancias añadidas, o que éstas reaccionen entre ellas mismas

formándose substancias diferentes a las deseadas.

Concentración de Sales Concomitantes: Si la muestra contiene gran cantidad de sales disueltas,

sería conveniente separar la muestra de la matriz, ya que es posible que se presenten interferencias

por formación de complejos iónicos asociados.

En esta sección se muestran los factores que influyen en el uso de la espectrofotometría de absorción

molecular. Usualmente la concentración de un analito en una solución analizada es evaluada de la

absorbancia de la muestra y una curva de calibración. La curva de calibración se obtiene generalmente de

la absorción medida de un estándar externo.

Las moléculas absorben radiación electromagnética

Para la mayoría de los compuestos orgánicos, formados básicamente por enlaces entre átomos de

H, C, N y O, las transiciones electrónicas que se producen en la zona UV-visible implican electrones del

tipo , π y . (no enlazantes).

Cuando una onda encuentra a una molécula, puede cambiar la dirección de propagación (dispersión)

de esa onda, o puede ser absorbida. En este último caso, una molécula absorbe un fotón y su energía

interna aumenta para entrar a un estado inestable, por lo que rápidamente vuelve a liberar esa energía

sobrante y vuelve al estado inicial que es más estable. El estado inicial se denomina estado fundamental y

el estado más energético se llama estado excitado. La absorción de radiación produce un paso del estado

fundamental al excitado (excitación) y en el proceso contrario (llamado relajación) hay una liberación de

Page 21: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 21

energía. Esta energía liberada en la relajación puede ser en forma de calor o en forma de radiación

electromagnética otra vez. Este último proceso de desprendimiento de radiación se llama de emisión. Estos

procesos se pueden representar como una reacción química y en un diagrama de energía.

El aumento del nivel energético interno de la molécula produce unos cambios en los enlaces

intramoleculares y/o movimiento de los electrones alrededor del átomo. Estos enlaces se llaman

transiciones y se clasifican en tres tipos:

El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones electrónicas entre los

diferentes niveles energéticos de ciertos grupos o átomos de la molécula y no caracterizan la molécula

como entidad. En contraste la absorción de energía en la región infrarroja estimula la molécula completa

y causa cambios vibracionales y rotacionales en ésta, lo cual caracteriza la entidad estructural de dicha

molécula.

Así las radiaciones más energéticas (VIS, UV y mayores) comunican suficiente energía como para

alterar el movimiento orbital de los electrones, tanto alrededor de un átomo solo, como de los orbitales

de enlace entre átomos. Las radiaciones menos energéticas (IR) producen cambios en los movimientos de

vibración y rotación de la molécula. Estas últimas son muy específicas de cada enlace y por lo tanto de

cada molécula por lo que se utilizan como técnicas de identificación.

Una molécula o parte de una molécula que puede ser excitada por absorción se llama cromóforo. En

sistemas biológicos los cromóforos generalmente tienen máximos de absorción en el rango del UV lejano

al visible. En la tabla 1 se enlistan los valores de λmáx y ε para algunos cromóforos importantes.

Page 22: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 22

Page 23: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 23

Cuando dos átomos forman un enlace químico, los orbitales atómicos de cada uno de ellos se

combinan para formar dos orbitales moleculares, uno de baja energía que es el orbital enlazante y otro de

energía mayor, que es el orbital antienlazante (Figura 1). Los enlaces covalentes que se originan entre los

orbitales de dos átomos que se enlazan químicamente pueden ser de dos tipos y se conocen como enlaces

y enlaces π.

Al efectuarse dicho enlace covalente se forman simultáneamente orbitales antienlazantes: * en el

caso de un orbital molecular enlazante y π * en el caso de un orbital molecular enlazante π.

Los electrones que no participan en la formación de enlaces covalentes en la molécula, se denominan

electrones n o no enlazantes. En las moléculas orgánicas los electrones n están localizados principalmente

en los orbitales atómicos de átomos como Nitrógeno, Oxigeno, Azufre y del grupo de los halógenos.

El diagrama de energía para los orbitales moleculares enlazante, antienlazante y no enlazante así

como las transiciones electrónicas posibles es el mostrado en la Figura 2.

La absorción de energía radiante en el UV o Visible por los electrones n, ó π resulta en la excitación

de estos, los cuales pasan a ocupar alguno de los orbitales antienlazantes. La absorción de radiación UV o

Visible es capaz de efectuar dichas transiciones. En la Figura 2 se representan las transiciones posibles en

una molécula. De acuerdo a este diagrama el orden energético en estas transiciones es:

Page 24: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 24

Mientras mayor sea la energía requerida para una determinada transición, menor es la longitud de

onda de la radiación que debe suministrarse para conseguir tal fin; por ejemplo: la transición para

el propano requiere de radiación de 135 nm, la cual se encuentra en la región del UV lejano por lo que es

necesario un equipo de alto vacío si se desea estudiar dicha región del espectro. La transición es

la que requiere de menor energía y mayor longitud de onda. Las cetonas y aldehídos saturados efectúan

esta transición a una longitud de onda de aproximadamente 285 nm. Es necesario hacer notar que

asociado a estas transiciones electrónicas existen cambios rotacionales y vibracionales en la molécula, lo

cual origina que el espectro obtenido sea un espectro de bandas y no un espectro de una o más líneas

agudas, como sí ocurre en un átomo.

1. Transiciones *: Estas requieren gran energía y se producen en el UV de vacío a longitudes

de onda inferiores a 150 nm. Por ejemplo los enlaces C-H absorben en torno a 125 nm y los enlaces C-C

alrededor de 135 nm.

2. Transiciones *: Estas bandas aparecen cuando la molécula orgánica contiene un

heteroátomo (O, N, S, F, Cl, Br, I) y un electrón que está en un orbital p de un heteroátomo se excita a un

orbital * de la molécula. Se producen en la zona comprendida entre 150 y 250 nm. Por ejemplo, alrededor

de 180 nm para los alcoholes, 190 nm para los éteres y derivados halogenuros y 220 nm para las aminas.

3.- Transiciones π* y ππ*

Se producen en la zona entre 200 y 780 nm y son las de mayor utilidad analítica. Se requiere la presencia

en la molécula de grupos insaturados que aporten electrones del tipo π.

Para que se produzca la transición π* la molécula debe de contener un heteroátomo formando

parte de un sistema insaturado (por ejemplo C=O, N=N, NO y NO2). En este caso, se trata de bandas menos

intensas que las de ππ* que se ven muy afectadas por la naturaleza del disolvente. Un ejemplo típico

son las bandas de absorción del grupo carbonilo entre 270 y 295 nm.

La absorción en el UV-visible está asociada a la presencia en la molécula de grupos funcionales

(cromóforos que contienen electrones de valencia con energías de excitación relativamente bajas.

Un cromóforo es la parte de la molécula (átomo o grupo de átomos) en la que se localiza la transición

electrónica responsable de la aparición de una banda de absorción molecular. El término hace referencia,

a los grupos responsables del color de las sustancias y procede del término griego chromus, que significa

color y phorus el que lo lleva. (Cuadro 6.2.)

Page 25: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 25

Puede ser un grupo funcional que da origen a transiciones del tipo . Estos son los que se

encuentran en moléculas orgánicas con enlaces saturados y que no contienen átomos con pares

electrónicos no compartidos, ejemplo: C-C y C-H.

Los cromóforos que dan origen a las transiciones son sistemas que contienen electrones en

orbitales y n. Estos se encuentran en las moléculas orgánicas saturadas que contienen uno o más átomos

con pares electrónicos no compartidos ejemplo: C-S-, C-O-, C-N, C-Cl etc.

Los cromóforos que dan origen a transiciones del tipo , son moléculas orgánicas no

saturadas, las cuales contienen electrones en los orbitales . Ejemplos de este tipo son los cromóforos C=C

y - .

Algunos átomos o grupos saturados con pares de electrones sin compartir no absorben en la región

UV-visible. Sin embargo, cuando se unen, o se introducen en, cromóforo hipercrómico (incremento de la

intensidad de la absorción), recibiéndola denominación de auxocromos. Por ejemplo, los grupos C-Br, C-

OH, C-NH2 se comportan como auxocromos.

La presencia de varios cromóforos en una misma molécula separados por un enlace sencillo da lugar

a sistemas conjugados que presentan un comportamiento característico en el UV-visible. Así, el espectro

electrónico de un compuesto que contenga dos enlaces etilénicos separados por varios grupos metílicos,

serán muy semejantes al de una molécula con un doble enlace aíslan los dobles enlaces etilínicos. Sin

embargo, si los dos enlaces etilínicos están situados entre átomos de carbonos adyacentes, caso del 1,3-

butadieno, CH2=CH-CH=CH2, se produce una disminución de la diferencia de energía entre el estado

fundamental y el excitado, debido a la conjugación, que se trata de un desplazamiento batocromico de la

banda de absorción del cromóforo.

Page 26: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 26

En los sistemas en que son posibles las transiciones , el estado excitado es más polar que el

estado basal; como resultado de esto, la transición ocurrirá a mayores longitudes de onda en

solventes polares que en solventes no polares. Este desplazamiento hacia el rojo del espectro visible se

conoce como efecto batocromico.

La conjugación de un enlace etilénico con un enlace acetilénico da lugar a la aparición de una banda

de absorción en la región 219 a 230 nm, en general, menos intensa que la del dieno correspondiente.

Cuando se conjuga un grupo carbonílico o carboxílico con un enlace etilénico tanto la banda ππ* como

la de π* sufren desplazamientos batcrómicos.

En las moléculas que contienen átomos con electrones no compartidos o electrones no enlazados,

estos interactúan con el solvente por formación de enlaces hidrogeno con las moléculas del mismo. Cuanto

mayor sea la polaridad del solvente mayor será el grado de asociación de los átomos con electrones no

compartidos y las moléculas de solvente. El efecto de esta situación es que la absorción se desplaza a

menores longitudes de onda (desplazamiento al azul), a medida que aumenta la polaridad del solvente.

Este efecto se conoce como efecto hipsocromico.

El efecto batocromico (desplazamiento al rojo o a menores longitudes de onda) también es

observado cuando la longitud del sistema conjugado de dobles enlaces en una molécula se incrementa.

Lo mismo es cierto cuando algunos grupos funcionales (principalmente átomos con electrones no

compartidos) se encuentran como sustituyentes en la molécula.

Por simplicidad los cromóforos pueden ser clasificados de acuerdo a sus grupos funcionales en:

1.- Etilenos (el enlace doble aislado)

2.- Dienos y Polienos

3.- Poliinos y Eninos

4.- Aldehidos y Cetonas

5.- Acidos a, b Insaturados, Lactonas y Esteres

6.- Aromáticos y Heterocíclicos

Page 27: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 27

Además de los cromóforos orgánicos, hay otros compuestos inorgánicos, complejos órgano-

metálicos y complejos de trasferencia de carga que absorben en la zona UV-visible. Por ejemplo, los

aniones carbonato, nitrato y nitrito presentan máximos de absorción a 217, 313 y 280, y 280 y 360 nm (dos

máximos para el nitrito), respectivamente, que tienen su origen en transiciones de tipo π*.

La mayoría de los iones de los metales de transición y sus complejos absorben en la zona ultravioleta

o visible. Esta absorción, se debe a transiciones electrónicas entre orbitales de tipo d para los elementos

del primer (3d) y segundo periodo de transición (4d) y a transiciones electrónicas entre orbitales del tipo f

para los lantánidos (4f) y actínidos (5f).

Page 28: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 28

Los espectros de absorción en el ultravioleta y el visible de los lantánidos y actínidos se caracterizan

por picos de absorción estrechos y bien definidos que no se ven afectados, prácticamente, por el tipo de

ligando coordinado al ión metálico. Este efecto puede explicarse teniendo en cuenta que las transiciones

responsables de la absorción implican a orbitales internos que se ven afectados por los efectos del

disolvente o por los ligandos que interaccionan con los orbitales externos.

Sin embargo, los iones y complejos de los elementos de la primera y segunda serie de transición

presentan bandas anchas, poco intensas, muy afectadas por factores tales como, el índice de coordinación

del metal, la naturaleza de los ligandos enlazados o la distribución espacial de los mismos. Así, el Ni(II) es

verde, el Ni(𝑁𝐻3)42+ es azul y el Ni(𝐶𝑁3)4

2− es amarillo parduzco o, por ejemplo, los complejos con Co (II)

con índice de coordinación 4, presentan mayor coeficiente de absorción molar que los complejos con

índice de coordinación 6.

Los colores de los iones de transición de sus complejos se deben a transiciones electrónicas que

involucran a orbitales d. En ausencia de un campo eléctrico o magnético hay 5 orbitales d

(𝑑𝑥𝑦, 𝑑𝑥𝑧, 𝑑𝑦𝑧, 𝑑𝑥2−𝑦2, 𝑑𝑧2) que tienen la misma energía, es decir que están degenerados. (Figura 6.5). Para

explicar la aparición de color en los compuestos de transición se ha propuesto varias teorías. La más sencilla

es la teoría del campo cristalino según la cual, la diferencia de los orbitales d se debe al campo eléctrico

originado por la disposición simétrica de los ligandos, que pueden ser aniones (Cl−) o moléculas dipolares

(NH3, H2O), entorno al ión central. En estas condiciones, además de la atracción electrostática debida a las

fuerzas de Coulomb, se produce una repulsión entre el campo y los electrones del catión. De esta forma,

los orbitales de éste experimentan un incremento de energías que depende de la intensidad y de la forma

del campo y de la naturaleza de los orbitales.

Page 29: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 29

Si la carga negativa de los ligandos está concentrada en determinados puntos, como sucede cuando

el catión se encuentra en el cristal bajo el campo de los ligandos, el efecto individual sobre cada orbital d

es diferente, aquellos que estén orientados hacia los ligandos experimentaran una acción repulsiva más

intensa, y los orientados en direcciones alejadas, menos intensa. Se produce así una pérdida parcial de la

degeneración y se originan 2 series degeneradas: una de mayor energía, 𝑒𝑔, doblememte degenerada y

otra de menor energía, 𝑡2𝑔, triplemente degenerada. La separación o diferencia de energía entre las series

de orbitales 𝑒𝑔, y 𝑡2𝑔 se denominan parámetro de desdoblamiento del campo de ligandos, ∆.

La magnitud del desdoblamiento depende de varios factores:

a) De la carga y del número atómico del catión.

b) De la fuerza del campo del ligando es decir, de la intensidad con que el ligando desdoblará la

energía de los electrones d

c) De la coordinación

Los ligandos más comunes, se pueden ordenar en orden creciente de fuerza del campo en la llamada

serie espectroquímica: 𝐼− < 𝐵𝑟− < 𝐶𝑙− < 𝐹− < 𝑂𝐻− < 𝐻2𝑂 < 𝑆𝐶𝑁− < 𝑁𝐻3 < 𝑒𝑡𝑖𝑙𝑒𝑛𝑑𝑖𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 < 𝑜 −

𝑓𝑒𝑛𝑎𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎 < 𝑁𝑂2− < 𝐶𝑁−. Este orden se aplica a casi todos los iones de los metales de transición y nos

permite predecir cualitativamente la posición de los máximos de absorción de distintos complejos de un

determinado ión metálico de transición.

Algunos iones inorgánicos de metales de transición, por ejemplo, 𝑀𝑛𝑂4− o el 𝐶𝑟2𝑂7

2−, o complejos

moleculares (por ejemplo, benceno-12) presentan bandas de absorción muy intensas en la zona UV-visible.

Así, el yodo es violeta en disolventes inertes, como el tetracloruro de carbono, sin embargo forma

disoluciones rojas a marrones en disolventes aromáticos, como el benceno.

Los complejos que se forman se caracterizan por ´presentar bandas de absorción intensas en la

región visible del espectro que se denominan de trasferencia de carga y están asociadas a la transición de

un electrón desde un orbital perteneciente al ligando hasta otro perteneciente al átomo central, o

viceversas.

Los complejos de trasferencia de carga se forman cuando uno de los componentes del complejo

(donador) absorbe radiación y se produce la trasferencia de un electrón desde uno de sus orbitales de

menor energía (transformándose en un catión radical) a un orbital de mayor energía de otro componente

del complejo, que actúa como aceptor (convirtiéndose en un anión radical). El estado excitado por tanto

será el resultado de un proceso de oxidación/reducción interno.

Estas transiciones son particularmente importantes en los complejos de los metales de la segunda y

la tercera serie de transición y las bandas asociadas son tan intensas que pueden no observarse en el

Page 30: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 30

espectro las bandas correspondientes a las transiciones d-d. En estos complejos las transiciones que

implican la transferencia de un electrón desde un orbital enlazante del metal a un orbital no ocupado del

ligando, se conocen como transiciones de transferencia de carga oxidativas, ya que el metal se oxida en el

proceso. Por ejemplo, para el complejo [ 𝑇𝑖𝐶𝑙3 (bipiridina)] el estado de menor energía es

[𝑇𝑖3+(𝐶𝑙−)3(𝑏𝑖𝑝𝑖𝑟𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎) ] y el estado excitado [𝑇𝑖4+(𝐶𝑙−)3(𝑏𝑖𝑝𝑖𝑟𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎) ].

Alternativamente si la transferencia del electrón se produce desde el ligando al metal se conocen

como transiciones de transferencia de carga reductoras, ya que el metal se reduce en el proceso. En el caso

de la banda de transferencia de carga que aparecen en el espectro del 𝑀𝑛𝑂4−. El estado fundamental se

puede escribir formalmente como [𝑀𝑛7+(𝑂2−)4] y se produce una transferencia desde un ligando 𝑂2− al

metal para dar, [𝑀𝑛6+(𝑂2−)3(𝑂−)].

La posición de la banda de absorción en el espectro depende del potencial de ionización del donador

y de la afinidad electrónica del aceptor y, como se ha indicado anteriormente, se trata de bandas anchas,

de intensidad elevada (Ɛ > 10 4 L/ mol cm), muy útiles con fines analíticos.

La región del espectro electromagnético que corresponde a las transiciones que involucran a

electrones de la capa de valencia se extiende por longitudes de onda de 100 a 1000nm (regiones

ultravioleta-visible e infrarroja cercana). No toda esta zona es de igual utilidad para la elucidación de

estructuras orgánicas.

La región por debajo de 200nm, conocida como Ultravioleta lejano, presenta características que hacen

complicada su utilización:

1. –En esta zona absorben las moléculas componentes del aire, lo que hace imprescindible trabajar con

equipos evacuados (de aquí el nombre alternativo de la región: Ultravioleta de vacío).

2. - Los materiales usuales para la construcción de componentes ópticos (celdas, lentes, elementos

dispersivos), el cuarzo y el vidrio, absorben fuertemente en esta zona. Se requiere trabajar con otros

materiales, menos versátiles y más costosos (LiF, CaF2, zafiro, utilizables hasta 115, 125 y 140 nm

respectivamente).

3. -Los solventes absorben fuertemente en esta región. Los hidrocarburos saturados pueden usarse hasta

170 nm, los hidrocarburos perfluorados hasta 150nm.

4. - La sensibilidad de los detectores es generalmente baja.

5. - La absorción en esta zona es poco selectiva. Casi todos los compuestos presentan absorción en esta

región.

Page 31: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 31

La región entre 200 y 400nm, llamada Ultravioleta cercana, es de gran utilidad en la determinación

estructural de insaturación conjugada, aromaticidad o de ciertos grupos insaturados con pares electrónicos

libres (carbonilo, nitro, etc.), sin presentar los serios inconvenientes del Ultravioleta de vacío. Se requieren

materiales ópticos de cuarzo si se quiere acceder a la zona de longitudes de onda inferiores a 350nm,

mientras que el vidrio es utilizable en el resto de la región Ultravioleta cercana y toda la región visible.

La región Visible, de 400 hasta cerca de 800nm, es la única del espectro electromagnético detectable

por el ojo humano. Las transiciones que se presentan en esta zona corresponden a transiciones electrónicas

de muy baja energía. Todos los compuestos coloreados absorben selectivamente en esta región. Los

compuestos fuertemente conjugados y ciertos complejos de metales de transición absorben

significativamente en la región.

Ciertas transiciones electrónicas pueden presentarse a longitudes de onda superiores a 800nm pero

estas no son comunes en los compuestos orgánicos. En la Figura 2.1 se muestra la región Ultravioleta

Visible del espectro electromagnético, así como sus características.

Las transiciones electrónicas en moléculas se presentan en forma de bandas, como ya se vio

anteriormente, con modificación simultanea de los niveles de energía vibracionales y rotacionales. En

moléculas pequeñas en fase gaseosa es posible observar la estructura fina vibracional de las bandas

electrónicas con subestructura rotacional no bien resuelta. En moléculas más complejas la multiplicidad de

los niveles vibracionales hace que el gran número de transiciones de similar energía produzca bandas de

absorción continuas sin estructura fina vibracional evidente. Esto es también lo usual cuando se registran

los espectros de absorción UV en fases condensadas (soluciones, sólidos).

Las principales características de una banda de absorción son: posición del máximo, intensidad y anchura.

Page 32: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 32

La posición de una banda, dada por la del máximo de absorción, depende de la energía de la transición

(relación de Bohr) y se reporta usualmente como λ max /nm o número de onda .

La intensidad de una banda de absorción puede expresarse como absortividad molar en el máximo,, o

más correctamente como intensidad integrada. Esta intensidad depende del cuadrado del momento

dipolo de la transición (cambio en la distribución de cargas eléctricas durante la transición). Se producen

absorciones intensas cuando una transición es acompañada por un gran cambio en la distribución de

cargas (maxε del orden de 104), por otra parte las transiciones con pequeño cambio en la distribución de

cargas producen débiles bandas de absorción (maxε del orden de 102 o inferiores). Dados los valores típicos

de las absortividades molares en el UV, es común trabajar con soluciones de concentraciones 10-3 a 10-5

molL-1. La anulación del momento dipolo de transición y por lo tanto la ausencia o baja intensidad de una

banda de absorción está vinculada con la simetría de las funciones de onda y se expresa a través de las

reglas de selección que estudiaremos posteriormente.

La anchura de una banda de absorción electrónica depende del número e intensidad de los

componentes vibracionales de la transición correspondiente. La distribución de intensidades entre los

componentes vibracionales de una transición electrónica depende de los cambios en la geometría de

equilibrio de los estados base y excitados y es interpretada sobre la base del Principio de Franck Condon.

Las técnicas analíticas UV-Visible han recibido gran aceptación debida, entre otras a las siguientes

razones:

1.-Amplio Campo de Aplicación: Como ya se ha mencionado, las técnicas espectroscópicas

UVVis. son ampliamente empleadas ya que son muchas las especies que son activas en el visible, y muchas

mas las que con un tratamiento adecuado son capaces de formar especies coloridas. Lo mismo puede

decirse de la espectroscopia Ultravioleta.

2:-Selectividad Adecuada: Aunque no es muy común, si es posible tener interferencias en

UV Visible. Cuando esto ocurre, es posible emplear los métodos para análisis de multicomponentes. Otra

alternativa es aislar el analito de la interferencia, o separar la interferencia misma.

3.-Buena Exactitud y Precisión: En estas técnicas espectroscópicas es normal tener errores

relativos del 1 al 3%, por lo cual se puede considerar que se tendrán resultados analíticos con un mínimo

de incertidumbre si se procede en la forma correcta.

4.-Facilidad y Conveniencia: Aunque existen instrumentos altamente sofisticados,

acoplados a computadoras y con sistemas ópticos y electrónicos de alta precisión, es posible obtener

resultados muy aceptables para análisis de rutina, con instrumentos o espectrofotómetros de los mas

sencillos en el mercado, a un costo muy accesible.

Page 33: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 33

El tratamiento de la muestra varía considerablemente dependiendo de cada aplicación. La mayoría

de las mediciones son determinadas en solución o sólidos que son disueltos. En algunas ocasiones el

análisis se puede realizar directamente de la absorbancia de la forma química original, pero comúnmente

es necesario derivatizar el compuesto por que las bandas de absorción del analito en la forma química

original poseen una inadecuada absorción o absorben a longitudes inusuales. La derivatización envuelve

la conversión del analito a una forma absorbente fuerte por una reacción analítica selectiva con los

reactivos apropiados. La absorbancia del producto de la reacción es proporcional a la concentración del

analito por la calibración externa.

Generalmente, un exceso de reactivo es agregado a la reacción analítica para llegar al equilibrio antes

de hacer la medición. Alternativamente, el rango de la reacción química puede estar relacionado con la

concentración del analito o el analito puede ser titulado con un reactivo estándar que reacciona con una

estequiometría conocida. La reacción entre la muestra analizada o la muestra estándar y el reactivo puede

llevarse a cabo directamente en la celda de la muestra o en cualquier contenedor conveniente, en el último

de los casos, una alícuota de la reacción es transferida a la celda de la muestra después de que la reacción

es completada. En algunas aplicaciones especializadas como estudios de titulación, cinéticas y

determinaciones, la medida de la absorción se realiza antes de completar la conversión del analito a una

forma absorbente.

A menudo son necesarios pasos de separación (filtración, extracción con solventes, etc.) para eliminar

interferencias y en algunas aplicaciones el espectrofotómetro es utilizado como una técnica de detección

para cromatografías.

En procedimientos analíticos primero se debe determinar la forma absorbente del analito que se va

a utilizar. La naturaleza de las especies absorbidas influye en gran medida en la determinación de la

concentración, la sensibilidad de la calibración, el límite de detección, la precisión, la exactitud y la

linealidad. En el análisis, la absorbancia de algunas especies puede ser muy grande para obtener una buena

detección y precisión. Por otro lado, la naturaleza química de algunas especies puede afectar la interacción

con algunos interferentes o tomar parte en un equilibrio que puede afectar la linealidad, simplemente las

características espectrales de cada especie determina el potencial para sobrelapar el espectro con otras

especies.

El solvente y algunas condiciones de la solución como el pH, la fuerza iónica y la temperatura deben

ser optimizados y controlados para minimizar las interferencias y mantener la linealidad (para prevenir la

descomposición por oxidación, fotodescomposición u otros mecanismos). Por otro lado se debe de

mantener el equilibrio y maximizar el tiempo de estabilidad de la forma absorbente.

Page 34: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 34

Cuando una reacción analítica es usada para formar un derivado capaz de absorber, la concentración

del reactivo puede ser optimizada para lograr el objetivo que se sigue. Adicionalmente, el tiempo y la

temperatura requerida para formar el producto, el orden de adición de los reactivos y la reacción

concomitante pueden ser considerados. Los reactivos “enmascarados”, son algunas veces agregados para

bloquear la reacción concomitante con el reactivo analítico, idealmente, la conversión del analito a una

forma cuantificable por absorbancia. Por otro lado, la eficiencia de conversión podría ser constante a la

concentración del analito o los concomitantes. Cuando se emplea un solvente para la extracción se puede

evaluar: el efecto del tipo de solvente en la eficiencia de la extracción del analito y concomitantes, la

absorbancia molar, y las posiciones espectrales de las bandas de absorción.

.

La calidad de una técnica espectrofotométrica expresada en términos de incertidumbre, se basa

esencialmente en tres parámetros: sensibilidad, límite de detección y rango de linealidad.

a) Sensibilidad: Es la concentración requerida para dar un 1% de absorbancia (99% de transmitancia o lo

que es lo mismo 0,0044 unidades de absorbancia. A medida que esta concentración es menor, la

sensibilidad de la técnica es mayor porque es necesaria menos concentración para producir para producir

una señal en el detector.

b) Límite de detección: Es la mínima concentración que se puede medir con la técnica y con un elevado

nivel de certidumbre. Está relacionado con el ruido de fondo del aparato, es decir, la señal que mide el

aparato cuando se introduce un blanco. Una manera de calcularlo es multiplicar por tres la señal

correspondiente al ruido de fondo.

c) Rango de linealidad: Es el intervalo de concentraciones dentro del cual podemos medir una muestra

problema con un elevado nivel de certidumbre. Generalmente a partir del valor máximo de este rango, la

señal (absorbancia) deja de tener una relación lineal con la concentración y la curva se hacer horizontal,

tendiendo a un valor máximo de absorbancia. Las muestras o patrones que están fuera de ese rango no

se pueden medir con seguridad con la técnica empleada.

El espectro Ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente en forma adicional al espectro

Infrarrojo de la misma especie. Este espectro UV frecuentemente sirve como dato confirmativo de la

ausencia o presencia de ciertos grupos funcionales.

Si se desea ampliar el tema sobre cómo se aplica la espectroscopia UV al análisis estructural para

identificación de grupos funcionales en una molécula, recomendamos que se consulten otras referencias,

que tratan este aspecto en mayor profundidad.

Page 35: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 35

En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el estudio de ciertos problemas

específicos. Por ejemplo en la industria de los cosméticos, tintes, colorantes y pinturas. El estudio de los

grupos cromóforos y de su influencia en el desplazamiento de ciertos compuestos químicos hacia la región

visible hacen de esta técnica una de las de mayor interés en esta área.

Desde el punto de vista del estudio estereoquímico y de grupos funcionales en una molécula

orgánica, la espectroscopia UV no rivaliza con otras técnicas que tienen el mismo propósito, especialmente

con la espectroscopia IR por las razones mencionadas anteriormente, sin embargo, su aplicación en la

cuantificación de sustancias que absorben radiación UV la hacen una técnica insustituible.

Existe un gran número de técnicas para determinar substancias que no tienen un número suficiente

de grupos cromóforos para que la banda de absorción esté dentro del espectro Visible; por ejemplo ácidos

orgánicos, alcoholes, fenoles, aldehídos, cetonas, etc. Muchos de este tipo de compuestos muestran al

menos una banda de absorción en el UV cercano y tomando como dato su longitud de onda de máxima

absorbancia se pueden cuantificar en la misma forma en que se determinan compuestos en espectroscopia

Visible.

Resulta conveniente definir algunos términos usuales en espectroscopia UV-Vis que tienen en parte origen

en antiguas teorías sobre el origen del color de las sustancias.

Grupo cromóforo: grupo covalente insaturado que origina bandas de absorción electrónicas (ππ*).

Ejemplos típicos son los grupos vinilo, carbonilo, fenilo, nitro.

Grupo auxócromo: grupo saturado(generalmente conteniendo pares electrónicos libres) que unido a un

cromóforo altera tanto la posición como la intensidad de la banda de absorción de éste. Auxócromos

típicos son los grupos –OH, -NH2, -Cl, -Br, -CH3.

Efectos batocrómico e hipsocrómico: desplazamientos del máximo de absorción de una banda a

mayores o menores longitudes de onda respectivamente, debido a la introducción de un sustituyente,

cambio de solvente o pH o cualquier otra causa.

Efectos hipercrómico e hipocrómico: incremento o decremento de la intensidad de una banda de

absorción debido a la introducción de un sustituyente, cambio de solvente o pH o cualquier otra causa.

Brown, Ch. 2000. Utraviolet, visible, and near-infrared spectrophotometers. Applied Spectroscopy Reviews, 35 (3),

151-173.

Christian, G. D. 1981. Química Analítica. 2a ed. Ed. Limusa.

Page 36: 5. Unidad IV. Espectroscopia Uv Visible 2015

ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

MCQ. JANETT CECILIA SÁNCHEZ ARANA 36

Cross, D. G. and Fisher, H.F. 1970. The mechanism of glutamate dehydrogenase reaction. J. Biol. Chem. 245(10) 2612-

2621.

Crowder, A. L., Barker, R. and Swenson, C. A. 1973. Ultraviolet difference spectroscopic studies of the binding of ligands

to rabbit muscle aldolase. Biochemistry. 12(11), 2078-2083.

Freifelder, D. 1982. Physical Biochemistry. Chapter 14. Second Edition. Ed. W. H.

Freeman and Company, New York. p. 494-536.

Harris D. C. 2001. Análisis Químico Cuantitativo 2a ed. Ed. Reverté.

Horng, M.L. and Quitevis, E. L. 2000. Visible absorption spectroscopy and structure of cyanine dimmers in aqueous

solution. Journal of Chemical Education. 77. 637- 639

Komath, S. S., Kenoth, R. Giribau, L., Maiya, B. G. and Swamy, M. J. 2000.

Florescence and absorption spectroscopic studies on the interaction of porphyrins with snake gourd (Trichosanthes

anguina) seed lectin. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 55. 49- 55

Pauly, H. E. and Pfleiderer, G. 1977. Conformational and functional aspects of the reversible dissociation and

denaturation of glucose dehydrogenase. Biochemistry. 16(21). 4599-4604.

Paz, I. and Pinto, G. 2002. Spectroscopic study about the kinetics of the anthocyanin pigments extraction during the

maceration of cherries in liquor. Spectroscopy Letters. 35(3). 357-368.

Peace, N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. and Gray, T.1995. How to measure and predict the molar absorption

coefficient of a protein?. Protein Science 4, 2411-2423.

Proshlyakov, D. A. 2004. UV optical absorption by protein radicals in cytochrome c oxidase. Biochimica el Biophysica

Acta. 1655. 282-289

Ríos Castro Ángel, “Técnicas espectroscópicas en química analítica” Volumen I, Aspectos básicos y espectrometría

molecular, Editorial Síntesis, (2014) España.

Schmidt, F. 2001. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry.

Silverstein Robert M. Identificación Espectrofotométrica de Compuestos Orgánicos. Ed. Diana

Encyclopedia of life sciences. Macmillan Publishers Ltd. Nature Publishing Group, 1-4.

Skoog, D. A. 1996. Fundamentos de Química Analítica 4a ed. Ed. Reverté.

Van Holde K. E., Jhonson, W. C. and Ho, P. S. 1998. Principles of physical biochemistry. Ed. Prentice Hall. New Jersey.

pp. 394-407.

Walz, F. G. 1977. Spectrophotometric titration of a single carboxyl group at the active site of ribonuclease T1.

Biochemistry. 16(21). 4568-4571

www.unodc.org/unodc/bulletin_1954-01-01_3_page005.html#s500