PRACTICA Nº 6. PERMEABILIDAD DE MEMBRANA Y ACTIVIDAD ENZIMATICA INTRODUCCION MEMBRANA CELULAR Toda célula posee un sistema complejo de membranas cuya función es el intercambio de materiales, entre la célula y el medio acuoso externo o fluido extracelular y entre los organelos y la célula, sirve como medio de compartición entre el interior celular y sus metabolitos. Las membranas celulares son selectivamente permeables. Algunos solutos cruzan la membrana libremente, algunos cruzan con asistencia y otros no pueden cruzar. Unas pocas sustancias lipofílicas se mueven libremente a través de la membrana celular por difusión pasiva. La mayoría de pequeñas moléculas u iones, requieren la asistencia de acarreadores proteícos específicos, para transportarlos a través de la membrana. Las moléculas grandes no cruzan intactas las membranas celulares, excepto en casos especiales. La difusión es el movimiento neto de sustancia de un área de alta concentración a una de baja concentración. Dado que las moléculas de cualquier sustancia se encuentran en movimiento cuando su temperatura está por encima de cero absoluto (0 grados Kelvin o -273 grados C), existe una disponibilidad de energía para que las mismas se muevan desde un estado de potencial alto a uno de potencial bajo. La mayoría de las moléculas se mueven desde una concentración alta a una baja, es decir el movimiento neto es desde altas concentraciones a bajas concentraciones. Eventualmente, si no se agrega energía al sistema las moléculas llegan a un estado de equilibrio en el cual se encuentran distribuidas homogéneamente en el sistema.

Factores que aumentan la fluidez de las membranas: - Ácidos grasos insaturados - Baja concentración de colesterol - Altas temperaturas - Colas hidrocarbonadas cortas (dificultan el empaquetamiento)

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Factores que favorecen la viscosidad Factores que favorecen la fluidez

Alto grado de saturación y mayor longitud de las colas hidrocarbonadas.

Menor temperatura del medio

Alto de grado de insaturación y menor longitud de las colas hidrocarbonadas.

Mayor temperatura del medio

Efecto de la temperatura sobre la fluidez: El ascenso de la temperatura aumenta la energía cinética entre las moléculas y, por lo tanto, el movimiento de las colas hidrocarbonadas. Esto lleva a una disminución de las interacciones atractivas entre las mismas y a un aumento de los movimientos de rotación y de difusión lateral. Por el contrario, una disminución de la temperatura vuelve más rígida a la membrana y a “empaquetar” las colas hidrofóbicas de los fosfolípidos e impedir sus movimientos. Si la temperatura desciende significativamente, la membrana puede llegar a “cristalizarse”, con la pérdida consiguiente de muchas funciones vitales de la membrana. Los organismos que habitan regiones donde hay grandes amplitudes térmicas estacionales varían la composición de los fosfolípidosde en sus membranas en forma periódica, asegurando así una fluidez más o menos constante durante todo el año. Por otra parte, organismos que habitan ambientes extremos poseen composiciones fosfolipídicas muy particulares en sus membranas, por ejemplo, los que viven a temperaturas inferiores a los 0ºC tienen membranas muy ricas en lípidos poliinsaturados. Estos fenómenos son de gran importancia biológica, porque mediante ellos se logra en parte llevar a cabo procesos de trasporte e intercambio de sustancias. Explique por qué las heladas afectan los cultivos. ENZIMAS En las reacciones químicas ordinarias se requieren o producen cantidades altas de energía, el proceso se lleva a cabo con alta utilización de temperatura y calor, a veces con la participación de catalizadores de carácter inorgánico que faciliten la reacción. Dentro de las células se llevan a cabo reacciones similares, pero en este

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caso la producción de temperatura y energía se realiza en forma controlada por gran variedad de entidades químicas que actúan cada una en diferentes pasos o reacciones intermedias, permitiendo así una máxima utilización energética. Tales substancias reciben el nombre de enzimas (catalizadores bioquímicas) y son de naturaleza proteica. Las enzimas se caracterizan por ejercer su acción sobre sustratos específicos, dentro de un rango de temperatura y pH característicos , fuera de los cuales pierde su capacidad de acción y en este caso se dice que la enzima esta desnaturalizada, lo cual implica un cambio en su estructura. Es posible extraer algunas enzimas de tejidos vivos con métodos sencillos, como es el caso del grupo de enzimas hidrosolubles extraídos de semillas, las cuales durante el proceso de germinación desdoblan polisacáridos como los almidones, para proveer la energía en forma de moléculas más sencillas como las hexosas (ejemplo glucosa) utilizada para actividades metabólicas. OBJETIVOS Estudiar el efecto de la temperatura sobre el transporte a través de la membrana

celular. Extraer enzimas de vegetales y estudiar algunos factores que afectan la actividad

enzimática. MATERIALES Y REACTIVOS (*deben ser traídos por el estudiante) *Raíz de remolacha, *semillas germinadas de cebada, tubos de ensayo, mortero, gasa, mecheros Bunsen, pinzas para tubo, termómetro, placa térmica, vasos de precitados de 400 cc, capsulas de porcelana, centrifuga con sus respectivos tubos, agua destilada, solución de almidón al 0,5% y 1%, lugol, *lápiz de cera, *cuchillo de cocina, *tabla de cocina para picar, *rollo de papel absorbente. PROCEDIMIENTO PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR. Ante todo debe pelar la remolacha, y sobre la tabla para picar cortela en bloques de aproximadamente 1cc y lávelos todos al tiempo con agua de grifo para remover el pigmento de las células dañadas en el corte. Realice varios lavados, sin presionar, hasta que deje de salir el pigmento. Distribuya los bloques de remolacha en dos porciones equitativas y deposite cada una en un vaso de precipitados de 400cc. Adicione agua (según criterio del docente) a volúmenes iguales en cada vaso. Caliente luego uno de los vasos de precipitados, controlando la temperatura del agua

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con un termómetro (no mayor a 80 °C). Realice el mismo montaje pero sin someterlo a calentamiento con el otro vaso, este le servirá de control. Registre los cambios observados en cada vaso en cuanto a textura, color, olor, sabor, apariencia y otras características que usted pueda identificar. Explique dichos resultados. ENZIMAS 1. Tome 150 gramos de cebada entera (4 o 5 puñados), colóquela a germinar en

cámara húmeda por 36 horas (la germinación debe llevarse a cabo en un recipiente NO hermético (plato hondo) con agua que cubra las semillas y tapado con un plástico oscuro durante 36 horas a temperatura ambiente).

2. Para transportar la cebada germinada, hágalo en un frasco hermetico en un lapso de tiempo no mayor a 2 horas, después de dicho tiempo destape el frasco con el fin de que las semillas se aireen.

3. Ya en el laboratorio, lleve la cebada germinada a un mortero (aproximadamente un puñado), cúbrala con 5 ml de agua destilada (o según criterio del docente) y macere hasta obtener un extracto lechoso.

4. Filtre a través de un pedazo de gasa y colecte el liquido filtrado en un tubo de ensayo y proceda a centrifugarlo (2500rpm aproximadamente durante 5 minutos).

5. Utilice un tubo de ensayo (tubo madre) para recoger todo el sobrenadante (parte liquida) producto de la centrifugación

6. Posteriormente tome dos tubos de ensayo marcados uno como A y otro como B, a cada uno agregue dos mililitros de sobrenadante producto de la centrifugación (contiene diastasa y otras enzimas). Caliente el tubo B en el mechero por un lapso de 5 minutos hasta ligera ebullición (tenga cuidado de calentar el tubo por las paredes cercanas al extracto y no desde el fondo, evite que haya burbujeo inmediato) y déjelo enfriar. A continuación a cada tubo (A y B) agregue medio mililitro de solución de almidón al 0,5% o al 1% (unos grupos de trabajo usarán una concentración y otros grupos la otra concentración, el docente realizara dicha distribucion).

7. Deje en reposo durante 10 minutos y transcurrido este tiempo coloque 3-4 gotas de la mezcla de cada tubo (A y B) en dos porcelanas o vidrios de reloj y adicione a cada uno, una o dos gotas de lugol.

8. Observe las diferencias, los resultados de coloración, compare dichos resultados con otros grupos de estudiantes (0,5% o 1% de solución de almidón, según el caso), analice los resultados y resuma los datos en una tabla. Explique el efecto de cambio de temperatura sobre las enzimas.

CUESTIONARIO 1.- Explique cuáles son los principales factores que afectan a la actividad enzimática. 2.- Diferencie entre cofactor y coenzima. 3.- ¿Cómo se define la velocidad de un proceso enzimático? ¿Qué efecto tiene sobre ella la cantidad de sustrato presente en el medio de reacción?

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4.- ¿Dónde actúan las enzimas alostéricas? 5.- Defina centro activo y complejo enzima-sustrato. 6.- En las enzimas alostéricas, ¿es lo mismo el centro activo que el centro alostérico? 7.- Cite tres propiedades por las que podamos considerar a las enzimas como catalizadores. 8.- Qué diferencias hay entre inhibición competitiva y no competitiva. 9.- Cuáles son los principales tipos de coenzimas. 10.- Explique qué es un catalizador y por qué es necesaria su existencia para que las células desarrollen su actividad. 11.- ¿Qué características poseen las enzimas alostéricas? RESOLUCION AL CUESTIONARIO http://www.iesdionisioaguado.org/joomla/index.php?option=com_content&view=article&id=

1141:preguntas-resueltas-los-enzimas&catid=146:2o-bachillerato&Itemid=125 MAS PREGUNTAS SOBRE ENZIMAS http://www.genomasur.com/ani%203/introduccionalmetabolismoact.htm http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/mt/mt6.htm BIBLIOGRAFÍA HUMPHRY, D. G, DYKE, H. Van & WILLIS, D. 1969. Life in the laboratory. Hercourt, Brace & World. N.Y. JAMES, O.W. 1967. Introducción a la fisiología vegetal. Ediciones Omega. Barcelona KIMBALL, J.W. 1982. Biología 4a edición. Fondo Educativo Interamericano S.A. México. MOORE, T. 1974. Research experiences in plant Phisiology. A laboratory manual. Springer – Verlag. Heidelberg. SALOM, F. & CANTARINO, M.H. 1979. Curso de prácticas de biología general. H. Blume. Ediciones Madrid.