Presentacin de PowerPoint

UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDESESCUELA ACADMICA PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA LABORATORIO CLNICO Y ANATOMA PATOLGICAVI CICLO 2014 - II LIC. T.M. KATTIAN GAVINO FERNNDEZ

TEMA: DIAGNSTICO VIROLGICO

DIAGNSTICO VIROLGICOCONCEPTO.- El diagnstico virolgico comprende la deteccin e identificacin del agente etiolgico de una infeccin viral, clnica o inaparente.

La 1ra etapa lo constituye el DX. VIRAL CLNICO, que en ocasiones es suficiente, como en el sarampin, la varicela, el herpes zster, etc.

Pero en la actualidad se observa: La asociacin de virus con diversos cuadros clnicos. El manejo de casos graves asociados a inmunodepresin.La aparicin de sndromes clnicos causados por ms de un agente.

En todas estas situaciones tanto clnicas como epidemiolgicas se hace indispensable el estudio especfico de laboratorio virolgico

I.DIAGNOSTICO VIROLOGICOAntiguamente el Dx. de las enfermedades virales estuvo relegado por:

La mayora de las infecciones eran benignas y autolimitadas.

No haba disponibilidad de drogas para el tratamiento especfico de la mayora de infecciones.

- El Dx. de laboratorio era costoso, lento y requera de equipos sofisticados que no estaban disponibles para la mayora de laboratorios clnicos de rutina.

DIAGNSTICO VIROLGICOSe remonta a los aos 1940 cuando se comienza con el uso de los CULTIVOS CELULARES.

Se complementa con el uso de los ANTICUERPOS MONOCLONALES en el ao 1980.

Posteriormente con el desarrollo de la BIOLOGIA MOLECULAR y en particular de la tcnica de PCR (1985) se facilit la caracterizacin de las cepas virales.

DIAGNSTICO VIROLGICOBENEFICIOS ALCANZADOS:

Mejora en la SENSIBILIDAD de las tcnicas.

RAPIDEZ en la obtencin de resultados.

BENEFICIADOS:

La creciente poblacin de pacientes con depresin inmunolgica, quienes necesitan ser diagnosticados, monitorizados y tratados ya que estn expuestos a mltiples eventos infecciosos virales.CONTRIBUCIONES DEL DIAGNSTICO VIROLGICOCONTRIBUCION EJEMPLOSDiagnstico oportuno de una enfermedad que tiene tratamiento antiviralENCEFALITIS HERPTICA y uso precoz del aciclovir mejora el pronstico. Deteccin de CMV en sangre en un paciente transplantado y sintomtico marca el inicio de una terapia con ganciclovir.Confirmacin de una sospecha de HIV en una embarazada, que obliga a iniciar tratamiento profilctico.Dx. Oportuno de una enfermedad sin tratamiento especficoEn diarreas y cuadros respiratorios virales se evita el mal uso de antimicrobianos y se establece un pronstico.Informacin til para la vigilancia epidemiolgica de algunos virus de importancia mdica y de salud pblicaIdentificacin de circulacin de virus influenza en la comunidad, confirmacin de diagnstico de infeccin por virus dengue, hantavirus, rabia.Educacin al mdico paciente y comunidadMeningoencefalitis por enterovirus , contagio por va oral, prevencin de transmisin con lavado de manos, pronstico benigno en general.Piedra angular para la investigacin de nuevos virus y enfermedades; definicin de sero y genotipos circulantesHantavirus, coronavirus del SARS; el anlisis gentico del virus influenza A H1N1 pandmico dio la pista de que era un virus totalmente nuevo.TOMA DE MUESTRATOMA DE MUESTRAS BIOLGICAS:

La calidad de la muestra es crucial para un buen rendimiento del examen virolgico.

Es fundamental conocer donde est el virus sospechado al evaluar al paciente y solicitar el fluido, secrecin o tejido representativo y si ya no es detectable evaluar en que etapa est su respuesta inmuneINTEGRACIN DE ETAPAS DEL DIAGNSTICO VIROLGICOPACIENTECON PRESUNTA INFECCION VIRALTOMA DE MUESTRAMATERIALES

TRANSPORTE MUESTRAVERIFICACION DE CONDICIONES DE TRANSPORTE

MUESTRA DE BUENA CALIDADLABORATORIO VIROLOGIASITIO DE LESION VIRUS SOSPECHADOINFORME DE RESULTADOBIOSEGURIDAD AL PERSONAL TODAS LAS MUESTRAS SON POTENCIALMENTE INFECCIOSASTECNICAS DE DIAGNOSTICO VIROLOGICORPIDAS:Inmunodiagnstico:- Inmunoflorescencia- ELISA- Inmunocromatografa- Wester Blot Acidos Nucleicos:- ADN-ARN- PCR tiempo realCLSICASCultivos viralesMicroscopa ElectrnicaSerologa: ELISA, inhibicin de la hemaglutinacinNeutralizacin

SINDROME CLINICOTIPOS DE MUESTRASMATERIALESPRECAUCIONES PARA EL OPERADORINFECCIONES RESPIRATORIACELULAS DE NASOFARINGETrula flexible con punta de dracn o sonda de aspiracin. Tubos con medio de transporte.Unidad refrigerantePrecauciones estndar ms mascarilla, antiparras , guantes y pecheraINFECCIONES GASTROINTESTINALESDEPOSICIONES, BIOPSIA INTESTINALFrasco estrilCon medio de transporte viral para biopsiaUnidad refrigerantePrecauciones estndar ms guantes y pecheraINFECCIONES SISTEMICASSANGRE(SUERO, PLASMA CLULAS)Tubo sin anticoagulante para sueroTubo con EDTA para plasma o leucocitosPrecauciones estndar ms guantes y antiparras

HEPATITISSANGRE, DEPOSICIONESTubo sin anticoagulanteTubo con EDTAFrasco limpioUnidad refrigerante para transporte de deposicionesPrecauciones estndar mas guantes y pechera, antiparras para la puncin venosaEXANTEMASCLULAS BASALES DE LESIONES O HISOPADO NASOFARINGEOBIOPSIA, SANGREDEPOSICIONESTrula flexible con punta de dracn .Medio de transporteTubo sin y con anticoagulanteFrasco limpioUnidad refrigerantePrecauciones estndar ms mascarilla(si son vesculas),antiparras, guantes y pechera

A ) DIAGNSTICO RPIDOINMUNOANLISIS: Consiste en la deteccin de Ag. Ac.MTODO DIRECTO: Para detectar Antgenos.MTODO INDIRECTO: Para detectar Antgenos y/o Anticuerpos.La forma ms simple de inmunodiagnstico es la aglutinacin.

MTODOS DE DIAGNSTICODIAGNSTICO RPIDODIAGNSTICO CLSICODIAGNSTICO INMUNOSEROLGICOLos MTODOS DIRECTOS utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como una enzima biotina o molcula fluorescente.Los MTODOS INDIRECTOS utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo.DIAGNSTICO INMUNOSEROLGICOSe basa en la deteccin de anticuerpos especficos frente a diferentes protenas antignicas.

Tiene 2 finalidades prcticas:

Hacer un diagnstico de Infeccin aguda o reciente mediante la medicin de Ig M.

Conocer la condicin de inmunidad a un virus particular determinando IgG especfica.CURVA SEROLOGICA DESPUS DE UNA INFECCIN AGUDA

CONCEPTOS DE TITULO DE AC Y SEROCONVERSIN

A)DIAGNSTICO RPIDO - TCNICASINMUNOFLUORESCENCIA (IF)Tcnica de inmunomarcacin que hace uso de anticuerpos conjugados con una molcula que emite fluorescena bajo estimulacin con luz de long. de onda determinada. Ejm de stas molculas: Rodamina, isotiocianato de fluorescena, ficoeritrina.

A)DIAGNSTICO RPIDO - TCNICASENSAYO INMUNOENZIMATICO(ELISA)El Ac. va acoplado a una enzima(fosfatasa alcalina o peroxidasa) que reacciona con un sustrato cromgeno, dando origen a un producto coloreado.

A)DIAGNSTICO RPIDO - TCNICASRADIOINMUNOANLISIS (RIA)El Ac. est marcado con un istopo radioactivo y el complejo Ag Ac se detecta en un contador gamma.

A)DIAGNSTICO RPIDO - TCNICASINMUNOCROMATOGRAFA(ICr)Esta tcnica usa una fase slida que tiene Ac especficos marcados y controles fijados donde el Ag presente en la muestra migra por capilaridad y el complejo Ag Ac, se manifiesta por una banda oscura visible.

WESTERN BLOTTcnica que se utiliza para identificar y localizar protenas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos especficos.tambin llamado inmunoblotting( debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el o los antgenos especficos de inters) fue descrita por primera vez por Towbin et al. en 1979 y en la actualidad es una tcnica de rutina en todos los laboratorios que realizan anlisis de protenas.

WESTERN BLOT A) PREPARACION DE LA MUESTRA:Extraccin de las protenas de las muestras biolgicas mediante disrupcin mecnica o qumica.

WESTERN BLOTCon la rotura celular se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la protena de inters. Por tanto es importante evitar, durante la preparacin de la muestra cualquier actividad protesica.Evitar excesivos ciclos de congelacin /descongelacin.Trabajar rpido y mantener las muestras en fro durante todo el proceso.WESTERN BLOT B)ELECTROFORESIS EN GEL DE ACRILAMIDA: Las protenas en el extracto se separan de acuerdo a su tamao mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida.

WESTERN BLOT C) TRANSFERENCIA ELECTROFORETICA A UNA MEMBRANA : Las protenas son transferidas electroforticamente a un soporte rgido o membrana donde quedan inmovilizadas.

WESTERN BLOT D) HIBRIDACION DEL ANTICUERPO:BLOQUEO DE LOS SITIOS DE UNION INESPECFICOS La membrana con las protenas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de protenas y as evitar la unin no especfica de los anticuerpos.Despus del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el Ac primario lavados Ac. secundario conjugado con HRP

WESTERN BLOT E) DETECCION DE BANDAS: Despus de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localizacin de la banda en la membrana.

WESTERN BLOT

Western Blot1: Control Positivo 2: Control NegativoMuestra A: NegativoMuestra B:IndeterminadoMuestra C: PositivoDIAGNSTICO MOLECULAREl diagnstico moleculares un trmino general que engloba un conjunto de tcnicas de biologa molecular empleadas para la deteccin de enfermedades infecciosas.

MTODOS DE DIAGNSTICO CELULARHibridacin in situReaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)HIBRIDACIN IN SITUEsta tcnica est basada en la capacidad que poseen los Ac. Nucleicos para hibridarse entre s, es decir , en la complementariedad de las bases que componen los cidos nucleicos: G con C y A con T en el caso del ADN y G con C y A con U en el caso del ARN.Consiste en disear una sonda marcada con un fluorocromo que hibride con la secuencia a detectar. Este sistema nos permite estudiar la distribucin in situ de una determinada secuencia de inters. SECUENCIA DE INTERS: Asociadas a enfermedades de origen gentico.Las que revelan la presencia de algn patgeno.Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores .FISH (Fluorescent in situ hybridization)HIBRIDACION IN SITU CON FLUORESCENCIATcnica que se utiliza para identificar en una muestra la presencia de CROMOSOMAS determinados o regiones especficas de cromosomas cuya secuencia es conocida, (sondas de Acidos nucleicos), y que marcamos con fluorescencia. El fin principal es conseguir la mxima interaccin entre la sonda y la molcula de Acido nucleico que se quiere detectarTIPOS DE FISHCARACTERSTICASHIBRIDACION IN SITU TISULAR

HIBRIDACION IN SITU CROMOSMICASE REALIZA SOBRECORTES DE TEJIDOS

CELULAS INTACTASCROMOSOMAS METAFASICOS (TRATADAS CON FIJADORES PARA PRESERVAR SU MORFOLOGIA)USOSIRVE PARA DETECTAR: VIRUS PATOGENOSCLULAS CANCEROSASCAMBIOS EN LA EXPRESION GENICASIRVE PARA DETECTAR:Dx. DE CROMOSOPATASGENES TUMORALESVIRUS PATOGENOS (deteccin y tipificacin de virus Epstein Bar y CMV, PVH)TRANSPLANTESDETECCINAUTORADIOGRAFA Y MICROSCOPA DE FLUORESCENCIAMICROSCOPA DE FLUORESCENCIAFISHPRIMERA FASEREGION CROMOSOMICA DE INTERSPreparacin de la sonda. Una sonda es un segmento de ADN marcado con fluorescencia.

FISHSEGUNDA FASE HIBRIDIZACIONLos cromosomas desnaturalizados, fijos en el portaobjetos del microscopio, son expuestos a la sonda marcada con fluorescencia.la hibridizacin (fusin tiene lugar entre la sonda y el ADN cromosmico complementario ( es decir, se acopla).

FISHTERCERA FASE - VISUALIZACIONTras la hibridacin, se examina el portaobjetos al microscopio con luz fluorescente. Las seales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosmico complementario, la ausencia de tales seales implica que no hay ADN cromosmico complementario

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASAPCRPCR (POLIMERASA CHAIN REACTION)REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASAEs una tcnica de diagnstico molecular cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una nica copia.Sirve para amplificar un fragmento de ADN o ARN.

UTILIDAD:Tras la amplificacin resulta ms fcil identificar con muy alta probabilidad virus u otro microorganismo causantes de enfermedad.Identificar personas ( cadveres) Investigacin cientfica sobre el ADN amplificadoAPLICACIONES

PCREsta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar la hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y a continuacin dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.Todo el proceso esta automatizado mediante un aparato llamado TERMOCICLADOR que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin

PCR - ETAPAS1.-DESNATURALIZACIN2.-ALINEAMIENTO/ UNION DEL CEBADOR3.-EXTENSIN / ELONGACIN DE LA CADENA4.-ELONGACIN FINAL Y CONSERVACION1.-DESNATURALIZACIN

2.-ALINEAMIENTO/ UNION DEL CEBADOR

A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-72C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento.Enzima Taq polimerasa(Termus aquaticus) Resiste altas temperatura

3.-EXTENSIN / ELONGACIN DE LA CADENA

Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN.

4.-ELONGACIN FINAL Y CONSERVACION

. Con sta etapa se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.La conservacin se da entre 4 y 15C durante tiempo no definido.

45VENTAJAS DEL PCRTcnica especfica y sensible .Se puede prescindir del uso de radioistopos, los cuales eran indispensables antes de su invencin.Proporciona alternativas ms rpidas y menos costosas para muchas aplicaciones de clonacin. Puede producirse enteramente in vitro.Se puede seleccionar una secuencia especfica de nucletidos para replicarse en forma selectiva y rpida en grandes cantidades a partir de cualquier muestra.

DESVENTAJAS DEL PCRDebido a que los cebadores tienen que sintetizarse qumicamente, la PCR solo puede utilizarse para clonar ADN con secuencias de comienzo y de terminacin conocidas.DIFERENCIA ENTRE UNA PCR CONVENCIONAL Y UNA EN TIEMPO REAL

La PCR en Tiempo Real es la tecnologa ms actual, precisa y rpida. Previene la contaminacin de la muestra. Prescinde de la posterior electroforesis, habitual en una PCR convencional Los resultados van apareciendo en un monitor a medida que se realiza la reaccin. DIAGNSTICO MOLECULAR - CONCLUSIONESLos mtodos moleculares consisten en la deteccin del genoma viral y actualmente su aplicacin es de mucho inters.

Mientras su uso se incrementa, el rol que juega actualmente en el Dx. de laboratorio de los virus es pequeo comparado con los mtodos convencionales.

Este mtodo incrementar su aplicacin en el Dx. en un futuro cercano.

B) TCNICAS CLSICAS DE DIAGNSTICOCultivos viralesMicroscopa electrnicaSerologa: - ELISA- Hemaglutinacin - Inhibicin de la Hemaglutinacin- Fijacin de complemento- Neutralizacin

AISLAMIENTO VIRAL EN CULTIVOS

El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral, pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa Molecular ya no es la ms sensible.VENTAJAS:Buena sensibilidadObtencin de uno o ms virus a partir de una misma muestra.Se puede obtener el virus completo para estudios de caracterizacin y de estructura antignica y genmica.DESVENTAJAS:. El proceso suele ser lento (demanda das a semanas para la identificacin) y puede no estar disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente.No todos los virus crecen en cultivos.Costo elevadoInfraestructura adecuada y personal entrenadoSusceptible a contaminacin bacteriana.

51AISLAMIENTO VIRAL EN CULTIVOS

LNEAS CELULARES:No existe un tipo celular donde se puedan replicar todos los virus.La mayora de clulas usadas en la actualidad son de origen comercial y se clasifican en 3:PRIMARIAS: Preparadas desde un tejido animal o embrionario. Ejm: Clulas de rin de mono y fibroblastos de placenta.

LINEAS CELULARESDIPLOIDES O SEMICONTINUAS: Clulas de origen fetal humano o animal . Pueden usarse en la produccin de vacunas. Ejm: la vacuna trivrica (sarampin, parotiditis, rubeola).Tienen entre 50 y 100 pasajes o propagaciones. Ejm: Fibroblastos humanos de origen prepucial fetal (FS).

53LINEAS CELULARESCONTINUAS:Son de origen tumoral o cl. que han perdido su cariotipo diploide y su inhibicin por contacto y pueden multiplicarse indefinidamente. Ejm: Lneas Hep-2 para virus respiratorios, rin de perro(MDCK) para virus influenza.

TIPOS DE CULTIVO CELULAR

A)DIAGNSTICO CLSICO - TCNICASMICROSCOPA ELECTRNICANos ayuda a visualizar la forma del virus para clasificarlo dentro de una familia de virus.VENTAJA: til para el Dx. De virus nuevos.DESVENTAJA: Alto costo , necesidad de personal entrenado, 106 partculas virales por mL son requeridos para la visualizacin.

EFECTO CITOPTICO - LISIS O DESTRUCCION CELULAR CELULARDebido a la detencin o inhibicin de la sntesis de macromolculas celulares, inducida por algunas protenas virales. Ejm: herpes simplex.

EFECTO CITOPTICO - FORMACION DE SINCICIOSSINCICIOS: Grupos de clulas fusionadas apreciadas como una masa celular multinucleada. Ejm: Virus Sincitial Respiratorio

EFECTO CITOPTICO - CUERPOS DE INCLUSIONEn muchos virus se ha comprobado que estas zonas son ricas en protenas virales, siendo centros de replicacin viral. Ejm: Rabia

EFECTOS CITOPTICOS - COILOCITOSISEs patognomnica de la accin citoptica del HPV.

PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (TITULACIN DE Ag)Esta prueba se basa en la capacidad de algunos patgenos para causar aglutinacin de eritrocitos. Se usan para detectar el agente patgeno

INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN

Se basa en la deteccin de anticuerpos dirigidos contra las hemaglutininas del Agente patgeno. Son especficas de serotipo y sensibles

FIJACION DE COMPLEMENTOSe basa en la capacidad del complemento de unirse a los complejos Ag Ac. La prueba incluye la adicin de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee Ac. Especficos se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos

PRUEBA DE NEUTRALIZACIONVan dirigidas a la deteccin de Ac capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno. Para medir los niveles de inmunidad protectiva contra un patgeno.DESVENTAJA: No es til para diferenciar entre animales infectados y vacunados, ya que la mayora de vacunas induce la formacin de Ac neutralizantes.El tiempo y Dificultad para trabajar con animales de experimentacin y cultivos celulares

UTILIDAD DE LOS RESULTADOS SEROLGICOSLa utilidad de cada resultado serolgico depende del tipo de virus. Por ejemplo: virus como rubola y hepatitis A, el inicio de sntomas coinciden con el desarrollo de anticuerpos. La deteccin de IgM o incremento de IgG en suero indica enfermedad. Sin embargo, muchos virus producen la enfermedad antes de la aparicin de anticuerpos: Virus respiratorios En este caso, no es til en el mismo momento de la enfermedad. Existen virus que producen enfermedades por meses o aos despus de la seroconversin: HIV y rabia . En este caso la presencia de anticuerpos es suficiente para hacer un diagnstico definitivo.

DESVENTAJAS DE LA SEROLOGALargos perodos de tiempo son requeridos para obtener la muestra de suero aguda y convaleciente.Reacciones cruzadas entre virus relacionados.Ejm: Encefalitis japonesa y Dengue . Puede producirse falsos positivos.Pacientes inmunosuprimidos presentan una reduccin o ausencia de respuesta humoral.Pacientes receptores de productos sanguneos pueden dar falsos positivos.

CONCLUSIONESEl diagnstico viral clnico es de orientacin y puede confirmarse con una amplia variedad de tcnicas de laboratorio.

En la fase aguda de la enfermedad una toma de muestra adecuada y un transporte adecuado son fundamentales para el buen Dx. Virolgico.

Los efectos citopticos nos facilitan el diagnstico especfico.