Universidad Nacional Federico VillarrealLaboratorio de Microbiología I – Medios de Cultivo: Preparación y Esterilización

LA EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Ing. Vanessa García Díaz

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Un medio de cultivo es una mezcla de diversos nutrientes que en concentraciones adecuadas permite el crecimiento de microorganismos, bajo determinadas condiciones físico-químicas. La composición química de los medios de cultivo es variada pero, de manera general, todos ellos contienen una fuente de energía (compuesto orgánico o inorgánico), una fuente carbonada (algunas veces un mismo compuesto puede servir de fuente de energía y fuente carbonada), sales minerales, vitaminas y agua.

Tipos de medios de cultivo

Medio sintético: es un medio medio que contienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente

Medio mínimo: es un medio de cultivo que contiene una cantidad mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de microorganismos no tan altamente exigentes, desde el punto de vista nutricional Medio complejo (completo): es un medio de cultivo que contiene nutrientes de composición química el cual permite el crecimiento de diversos microorganismos (Agar soya tripticasa, etc.) Medio enriquecido: es un medio que contiene, además, de los nutrientes básicos de un medio de cultivo sustancias altamente nutritivas, como son, suero, sangre, etc. (Agar sangre, etc.) Medio selectivo: es un medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el crecimiento de otros tipos de microorganismos (Agar eosina azul de metileno o EMB), etc.) Medio diferencial: es un medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos (Agar Mac Conkey, etc.)

La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo básico que contiene agua, extracto de carne y peptona (producto soluble que resulta de la autólisis o de una hidrólisis enzimática de proteínas de origen animal o vegetal). Este medio se denomina medio nutritivo, y puede ser líquido (caldo nutritivo) o sólido (agar nutritivo).

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I.- OBJETIVOS

Familiarizar al participante con los términos de medios de cultivo.

Conocer como preparar y diferenciar los medios de cultivo.

Conocer las técnicas de esterilización de los medios de cultivo.

II.- GENERALIDADES:

LOS MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGIA

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de Microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de

cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

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En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

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2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:

i.-Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.ii.-Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.iii.-Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre.iv.-Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2.B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de

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cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

Clasificación de los medios de cultivo

SIMPLES: están formados solamente por compuestos químicos simples de fórmula química bien conocida.

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COMPLEJOS: están formados por líquidos animales, jugos vegetales, extractos de carne, etc. También podemos clasificarlos en: electivos, selectivos, diferenciales y enriquecidos.

Medios electivos

En algunos casos, especialmente en el aislamiento de organismos del suelo, un medio que satisfaga los requerimientos nutricionales mínimos de los organismos que interesan, pueden ser más útiles. Por ejemplo, se pueden obtener cultivos de enriquecimiento conteniendo un gran número de bacterias del género Azotobacter, usando un medio libre de nitrógeno y que contenga una fuente orgánica de carbono e incubando aeróbicamente.

Medios selectivos

Otro importante método de separación de cultivos mixtos, es por medio del uso de un medio selectivo. Este es un medio que ha sido modificado para incluir uno o más agentes inhibitorios. La elección de un medio selectivo debe ser apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimático de algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta el cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una concentración de 5,50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram- Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azida sódica, etc. que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-.

Medios diferenciales

Es aquel que tiene adicionado un reactivo que luego de la inoculación e incubación nos permite observar diferencias entre los distintos tipos de microorganismos que se han desarrollado.

Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio cuando se encuentre frente a un microorganismo.

Medios enriquecidos

Cuando se agrega una sustancia para enriquecerlo, aportando algún factor de crecimiento necesario para el microorganismo que el medio no lo posea. Ej.: agar sangre. Procedimiento de enriquecimiento

Cuando se necesita obtener un cultivo de un organismo determinado es necesaria una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie. Los métodos se basan en

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cualquier característica fisiológica del organismo deseado, por ejemplo, pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores. En algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones de suelo para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguidos por un plaqueo en medio sólido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubación, de manera que el organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido es inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la obtención de colonias separadas en medio sólido.

COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Peptonas

Las características de una peptona dependen de la pureza y calidad del material proteico empleado y del método de hidrólisis. La hidrólisis ácida y alcalina tienden a destruir el contenido de vitaminas de la proteína, y parte del contenido de aminoácidos también pueden perderse. La hidrólisis enzimática tiende a preservar las vitaminas y a mantener intacto el contenido de aminoácidos. Por Ej., la caseína pura no contiene hidratos de carbono y tiene gran contenido de triptofano y vitaminas. Una peptona de caseína preparada por hidrólisis ácida no tiene triptofano ni carbohidratos y puede usarse como ingrediente en medios para analizar el contenido vitamínico de sueros o de preparaciones farmacéuticas. Casi todos los extractos de levadura microbiológicos son en realidad peptona de levadura, debiéndose la digestión de las células de levaduras a sus propias enzimas autolíticas.

Infusiones y extractos

Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de conocerse las peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida.

Examen de peptonas, infusiones y extractos por su contenido microbiano

La excesiva contaminación microbiana de peptona, infusiones y extractos u otros ingredientes los hace poco seguros para propósitos científicos, aunque generalmente favorecen el crecimiento de otros microorganismos. Si se preparan estos materiales en un laboratorio siempre deben hacerse las pruebas de contaminación antes de usarlos. Esto se hace de la siguiente manera: Disolver 1gr. del material a examinar en 10,0 ml de agua purificada. Extender 0,01 ml sobre un área de 1 cm2 de una lámina portaobjetos de vidrio, secada al aire, y colorear por el método de Gram. Examinar 10 campos con una lente de inmersión en aceite. No debe haber más de 50 microorganismos o grupos visibles en 10 campos.

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Los medios pueden ser: líquidos o agarizados.

Agentes solidificantes

El agar es un polímero de la galactosa que es esterificado con ácido sulfúrico y se extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae, debe estar limpio y libre de desechos. Se agrega a la solución acuosa del 1,5 al 2%. El medio agarizado comienza a fundir a los 100°C, si bien se mantiene líquido hasta los 45°C, en donde se comienza a solidificar.

Ventajas

Prácticamente no es atacado o asimilado por los microorganismos, hay pocos organismos que lo digieren.

Desventajas

No es útil en medios ácidos

La gelatina es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiología de suelos. La agarosa es un polisacárido neutro que junto con la agaropectina es un producto de disociación del agar. Se usa en pruebas de difusión inmunoelectroforética, donde la claridad es especialmente importante.

Otros componentes

Indicadores colorimétricos

Los indicadores pueden incluirse entre los medios. Los indicadores de pH más usados son rojo fenol, azul bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo neutro. Estos indicadores se usan para demostrar la producción de ácido por un hidrato de carbono contenido en el medio. El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh (carga iónica) más usados actualmente. Algunos lotes de pH y Eh pueden ser tóxicos para algunos microorganismos y deben probarse antes de usarlos.

Agentes selectivos

Agentes selectivos que permiten el crecimiento de algunos microorganismos e inhiben el de otros pueden incorporarse a los medios. Son muy útiles para los trabajos de identificación. Se han ensayados muchos agentes selectivos y algunos son muy valiosos y usados. Los colorantes fueron probablemente los primeros agentes

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selectivos que se emplearon. Son ejemplos el cristal violeta y el verde brillante, que se usan par inhibir microorganismos Gram- . El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe el crecimiento de casi todas las bacterias, pero es bien tolerado por los estafilococos. La azida de sodio, el citrato y el telurito de sodio, el laurisulfato y el selenito de sodio, el iodo y el feniletanol se usan para dar selectividad. Un medio puede hacerse selectivo ajustando la reacción a un pH muy alto o muy bajo para permitir el crecimiento de algunos microorganismos e inhibir el de otros. Un ejemplo bien conocido es el uso de un pH 5,6 en medio de Sabouraud para el crecimiento de levaduras y mohos.

Agentes reductores

Agentes reductores puede agregarse para promover la anaerobiosis. Uno o más compuestos como los siguientes pueden usarse: ácido ascórbico, tiogilcolato de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido tiomálico, hidrosulfito de sodio y cisteína. Muchos medios que no contienen agentes reductores y se usan normalmente para cultivar aerobios pueden emplearse para cultivar microorganismos de requerimientos especiales incubándolos en propano, hidrógeno, metano u otros gases.

Preparación

La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse de acuerdo a las instrucciones. Sólo debe usarse equipos y cristalería química limpios. El agua debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicación en contra. La pesada exacta de los materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en baño de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitación. El calentamiento excesivo debe evitarse. La homogeneidad también es esencial, especialmente para medios que contienen agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni burbujas. La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtración. Casi todos los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos para volúmenes de hasta 500 ml. Para volúmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario. Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25°C ó 30-35°C durante varios días o semanas. Los medios deben guardarse en un refrigerador.

Medios de cultivos más usados en microbiología industrial

Caldo nutriente

Es un medio empírico de uso general para el cultivo de la mayoría de las bacterias. Los ingredientes son:

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Peptona 10 gr. Extracto de levadura 10 gr. Cloruro de sodio 5 gr. Agua destilada 1000 ml

Se pesan los ingredientes y se calientan hasta que se disuelven. Una vez que se ha enfriado, se ajusta el pH a 7-6. Se autoclava a 1 atmósfera durante 15 minutos para precipitar los fosfatos. Se filtra y se reparte en tubos tapados con algodón o con tapones a rosca (en esta último caso no se ajusta completamente las tapas). Se esteriliza a 1 atmósfera durante 20 minutos. Ajustar las tapas a roscar antes de retirar del autoclave.

III. MATERIAL PARA LA PRÁCTICA

5 Tubos de ensayo esterilizados. 2 Botella de vidrio de 300 ml. Con tapa rosca esterilizado Agua destilada. Luna de reloj

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Varilla de vidrio Espátula Balanza analítica Vaso de precipitado Probeta Graduada Gradilla Pabilo Jarra Eléctrica

IV. EXPERIMENTO

Siga cada uno de los pasos como lo indica su Profesor, Técnico o Instructor.

Pese exactamente la cantidad de medio que se indique dependiendo del tipo de medio de cultivo.

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Disolver en 100 ml. De agua destilada en vaso precipitado.

Esterilizar el medio de cultivo disolviendo completamente en autoclave (121 °C /15”), en horno eléctrico (100°C/ 30”).

Deje enfriar antes de su uso para cultivo de microorganismos.

V.- RESULTADO

Con esta tercera práctica hemos podido aprender y conocer:

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Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.

Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente.

Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

VI.- CONCLUSIONES

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Hay que ser minuciosos en la composición de los caldos nutritivos porque el

incorrecto uso de ellos puede llevar al fracaso de nuestra experiencia de manipular

microorganismos.

Hemos aprendido a reconocer un caldo a diferencia de un agar. El caldo es para

muestras liquidas y el agar para muestras sólidas.

Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada

cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados.

Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de

microbiología pues sirven para identificar las bacterias causantes de las

enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo básico que

contiene agua extracto de carne y pepsina.

Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio

líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.

Hemos aprendido a reconocer y clasificar medios de cultivo por su origen animal,

vegetal y mineral.

Medio de Cultivo de Levadura

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VII.- RECOMENDACIONES

No se puede meter las botellas en la jarra con las manos porque eso puede llevar

a que se contamine el caldo nutritivo.

Es obligatorio el uso del mandil en el laboratorio.

Se requiere que la puerta del laboratorio este cerrada y que el ingreso al

laboratorio sea restringido.

Esta prohibido fumar y comer en el laboratorio.

Lavarse las manos antes y después de realizar una experiencia en el laboratorio,

pues se requiere la mayor limpieza posible al manipular los materiales y caldos de

cultivos.

Limpiar con alcohol la mesa en que se va a trabajar.

Rotular los tubos de ensayo indicando las sustancias que contienen estos.

La mesa del laboratorio debe estar libre para poder llevar acabo la practica.

A la hora de vaciar el cultivo en los tubos de ensayo hay que hacerlo de una

manera rápida, minuciosa y la tapa enroscada de dicho tubo debe estar la boca

arriba sin contacto con el área de trabajo.

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No debemos acercar nuestra boca con los tubos de ensayo, ya que hay que

recordar que hay que evitar todo contacto de contaminación.

VIII.- CUESTIONARIO

1.- Definir: Microorganismos inorgánicos simples, caldo, micro aerofilas, medios selectivos, inhibir, vacunas.

Microorganismos inorgánicos simples:

En la actualidad, se conocen conjuntamente con este nombre varios grupos de seres microscópicos, de nivel celular -bacterias, hongos, algas microscópicas, protozoos- o subcelular -los virus-, distintos en su forma, en su estructura y en sus sistemas biológicos. El estudiarlos todos en una disciplina única, la Microbiología, está condicionado por la carencia de una ordenación celular de tejidos, por sus relaciones ecológicas, por una metódica investigadora bastante semejante y, por lo que se refiere a los virus, por su carácter microscópico.

Caldo de cultivo:

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

Micro aerofilas:

Son aquellas que necesitan oxigeno para desarrollarse.

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Medios selectivos:

Favorecen el aislamiento de un determinado grupo de microorganismos mediante la obtención de colonias (cepas puras).

Inhibir:Detener o restringir el curso de algo o un proceso.

Vacunas:Las vacunas son productos biológicos obtenidos a partir de gérmenes que pueden producir enfermedades (bacterias o virus). Están compuestas por esos mismos gérmenes vivos pero atenuados (debilitados), muertos o por algunas partes de ellos. Además pueden contener otros componentes químicos o biológicos que faciliten su conservación o aumenten su eficacia. En niños sanos no producen enfermedad, sino que estimulan sus defensas naturales para protegerles de la infección.

2.- ¿Cómo deben almacenarse los medios de cultivo?

En medios de cultivos deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15º C hasta los 30ºC y envases siempre bien cerrados.

3.- ¿Cuáles son las condiciones físicas que se deben tener en cuenta para la preparación de medio de cultivo con la finalidad del crecimiento de microorganismos?

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos.

1.- Aporte de nutrientes

La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo.

2.- pH

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:

Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

Catabolismo de proteínas ----> Producción de materiales nitrogenados ----> Alcalinización

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Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.

3.- Necesidades de gases

Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:

i.- Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.Ii.- Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.Iii.- Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre.Iv.- Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2.

B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.

C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

4.- Suministro de luz

Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.

5.- Control de la temperatura

El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que se efectúan estas reacciones está influída por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los siguientes grupos:

i.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los 15° C.ii.- Mesó filas: crecen mejor entre 25 y 40° C.iii.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.

Ing. Vanessa García Díaz

Universidad Nacional Federico VillarrealLaboratorio de Microbiología I – Medios de Cultivo: Preparación y Esterilización

6.- Otros requerimientos

Halófilas: bacterias que para su crecimiento requieren altas concentraciones de sal (10 - 15%). Son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos.

Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales.

4.- ¿Para que, como se interpreta y de que esta compuesto los medios de mínimos de Falkow y de Davis?

DESCARBOXILASA SEGÚN FALKOW, CALDO BASE

DATOS GENERALESNombre completo Caldo Base Descarboxilasa según FalkowConsistencia líquidoTipo de medio diferencialCampos de aplicación*

1,3

Especificaciones

Medio para determinar la capacidad de descarboxilación en las enterobacterias. Debe complementarse por separado con L-Lisina clorhidrato, L-Ornitina clorhidrato y L-Arginina HCl, dejando una cuarta porción del medio base como control.

* 

1 Clínica y Hospitalaria 2 Industria farmaceutica3 Veterinaria 4 Microbiología Alimentaria5 Microbiología Láctea 6 Industria cosmética7 Educación, I+D y Control de calidad

COMPOSICIÓN EN g/lPeptona 5.0Extracto de levadura 3.0Dextrosa 1.0Púrpura de bromocresol 0.02Aditivos L-Aminoácidos 0,5%Cantidad a disolver en g/l de medio 9

INDICACIONES POR GÉNEROS DE MICROORGANISMOSAislamiento No indicadoCultivo/Mantenimiento No indicadoIdentificación E.coli, coliformes & Proteus

INDICACIONES POR GRUPOS DE MICROORGANISMOSEnterobacterias 2Pseudomonas y otros no fermentadores 2

Ing. Vanessa García Díaz

Universidad Nacional Federico VillarrealLaboratorio de Microbiología I – Medios de Cultivo: Preparación y Esterilización

Bacterias del ácido láctico y otras 0. No indicadoAnaerobios 1. EnriquecimientoHongos (Mohos y Levaduras) 2. Cultivo/MantenimientoMicroorganismos Lipolíticos 3. Aislamiento

Algas y protozoos

Microorganismos proteolíticos

5.- ¿Qué son, para que sirven y como se interpretan los medios de cultivo de enriquecimiento y en que caso se usa?

Medios de Cultivo por enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas, bases nitrogenadas, carbohidratos y sales minerales.

Se usa en los casos de que los requerimientos nutricionales de bacterias sean muy exigentes.

Ing. Vanessa García Díaz

Universidad Nacional Federico VillarrealLaboratorio de Microbiología I – Medios de Cultivo: Preparación y Esterilización

Biblioteca de consulta Encarta 2004.

Ing. Vanessa García Díaz