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Esporangiogénesis/Zoosporogénesis:
Los hongos crecieron en todos medios de cultivo evaluados; sin embargo, se encontraron
marcadas diferencias en cuanto al desarrollo de esporangios y liberación de zoosporas.
De los cinco aislamientos evaluados, 93B3 y 81 B2 no presentaron formación de
esporangios ni zoosporas en ninguno de los medios analizados; a pesar de que los
fragmentos miceliares mostraron buena capacidad proliferativa principalmente en
Glucosa, Celobiosa y la mezcla Glucosa/Celobiosa (Figura 2).
Por el contrario, los aislamientos 62CV y 91 D2 realizaron esporangiogénesis después del
tercer día de cultivo en los medios suplementados con Glucosa, Paja de Arroz y mezcla
de Glucosa/Celobiosa, cuando fueron preincubados en medio de mantenimiento Paja de
Arroz durante 5 y 4 días, respectivamente. Un resultado similar se encontró cuando los
hongos se preincubaron en Glucosa durante el mismo tiempo, excepto en el caso de
62CV quien no realizó esporangiogénesis en el medio de Paja de Arroz. (Tabla 1)
En contraste, el aislamiento 5V2 desarrolló esporangios al segundo día de cultivo en los
medios suplementados con Glucosa y Paja de arroz. También se observaron esporangios
al segundo día de cultivo en Celobiosa, cuando se preincubó en Glucosa (Tabla 1). Al
tercer día, el aislamiento 5V2 realizó esporangiogénesis en todos los medios de cultivo
evaluados, y además hizo zoosporogénesis cuando fueron cambiados a medios frescos
de Paja de Arroz al segundo y al tercer día y a Bagazo de Caña al tercer día,
independientemente del medio y el tiempo de preincubación utilizado.
No se detectaron cambios de forma o tamaño de los esporangios en los diferentes medios
de cultivo utilizados, cuando se cultivaron los tres aislamientos que exhibieron la
capacidad de hacer esporangiogénesis bajo las condiciones evaluadas. Los aislamientos
62CV y 5V2 presentaron esporangios esféricos, de forma globosa, contenido granular
café, esporangióforo definido y diámetro aproximado de 50-150 IJm (Figura 4) .
A diferencia de los anteriores, el aislamiento 91 D2, desarrolló pocos esporangios
esféricos y gran cantidad de esporangios ovalados con un diámetro aproximado
de 25 a 30 IJm por 40 a 45 IJm, esporangióforo definido y contenido granular muy
hialino (Figura 3) .
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41
El único aislamiento que presentó zoosporogénesis fue 5V2 en los medios suplementados
con Paja y Bagazo; cuyas zoosporas fueron ovaladas, poliflageladas y de igual aspecto
en ambos medios.
TABLA 1: Esporangiogénesis de tres hongos anaerobios ruminales después de repiques de Paja de arroz o Glucosa a diferentes medios de cultivo. Negativo (O) , Cantidad escasa (1), Cantidad media (2), Cantidad abundante (3). No se evaluó (").
Medio preincubación Medio Repique Días de incubación en el medio de repique
PAJA DE ARROZ
Glucosa
Celobiosa
Paja de arroz
Bagazo de caña
Glucosa! Celobiosa
1
O
O
O
O
O
62CV
2 3 4
O 3 2
O O O
O 1 2
O O O
O 1 O
5
O
2
O
O
1
O
*
O
O
O
9102
2 3 4
O 1 2
* * *
O 1 2
O O O
O 1 1
5
2
*
3
O
2
1
O
O
O
O
O
5V2
2 3 4
2 3 3
O 2 2
2 3 3
O 3 3
O 2 2
5
3
1
3
3
2
GLUCOSA
Glucosa
Celobiosa
Paja de arroz
Bagazo de caña
Glucosa! Celobiosa
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
1
O
O
1
3
1
O
O
2
1
O
O
O
O
*
O
O
O
O
*
O
O
O
1
*
1
O
1
2
*
2
O
1
3
*
O
3
O
O
O
O
O
2
2
3
O
O
3
3
3
3
1
3
3
3
3
1
3
1
3
3
1
Figura 2. Morfología macroscópica de los aislamientos 81 82 (2a) Y 9383 (2b) cultivados en medios
suplementados con glucosa
Figura 3. Esporangios del aislamiento 9102. 3a: Esporangios maduros en glucosa 3b: sporangios de 3
colonias diferentes. 3c: Esporangio periforme en glucosa. 3d: Esporangio ovalado en Paja
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Figura 4. Esporangios del aislamiento 5V2 en medios de cultivo suplementados con glucosa (4a ,b) , paja de
arroz (4c-e) y bagazo de caña (4f).
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Aislamiento de ONA, diseño y evaluación de cebadores.
Ninguno de los protocolos ensayados resultó efectivo para el aislamiento reproducible del
DNA de los hongos bajo estudio, solo en un caso se logró la obtención no reproducible de
DNA.
8e encontraron pocas secuencias de DNAr 188 (de 1 a 2) para los géneros fúngicos
seleccionados en el presente estudio, por tal razón, el análisis se realizó principalmente
con secuencias IT8-1, 5.88 e IT8-2, de las cuales se tiene un mayor número de accesos.
Para aumentar la confiabilidad de las secuencias reportadas en la base de datos, se
utilizaron para el análisis principalmente aquellas que habían sido publicadas en artículos
científicos. De los géneros analizados, solo Orpinomyces presentó una región diagnóstica
en la secuencia bajo estudio, las demás se alinearon con otros géneros de hongos
ruminales lo cual indica que no resultan útiles para la identificación taxonómica.
Para el caso específico de Orpinomyces sp. se evaluaron en total seis (6) secuencias, las
cuales corresponden una fragmento del ADNr 188 seguido del IT81, DNAr 5.88 y un
porción del IT82. Mediante el análisis de alineamiento múltiple se pudo determinar que
estas secuencias mantienen 7 regiones conservadas, estas fueron analizadas mediante el
procedimiento Blast para determinar su especificidad. De este análisis se pudieron
diseñar los siguientes cebadores específicos: un cebador forward 5'- TGT GAT TTT AAT
AAT CAT CCT ACC C -3', con una temperatura de fusión (TM) de 50.goC y un cebador
reverso que alinea de manera específica con todos los géneros de hongos anaerobios
ruminales 5'- AGA TCC ATT GTC AAA AGT TG -3', cuya TM =48.3°C (Anexo 3).
Evaluación de proteínas en el filtrado fúngico
En cuanto a la evaluación de las proteínas presentes en el filtrado fúngico, el análisis de
electroforesis en gel de poliacrilamida-SD8, reveló que el extracto del hongo presenta en
promedio 14 bandas proteicas diferentes (figura 5). 8in embargo, el número de bandas
varía de acuerdo al sustrato en el cual crece el hongo (figura 6), lo cual evidencia que
algunos de estos polipéptidos están sujetos a la regulación de la expresión génica.
Figura 5. SDS-PAGE del extracto crudo del HAR 5V2 incubado en diferentes medios de cultivo sin periodo de adaptación.
1 2 3 4
1 Bagazo de caña lavado; 2 Carboximetil CeJulosa CMC; 3 Paja de arroz; 4 Bagazo de caña
45
~ t \l "t ' , .. l o
I" r-PT() . DE R18 1. " • o , o o o
Figura 6. SDS-PAGE del extracto crudo del HAR 5V2 preadaptado e incubado en diferentes medios de cultivo.
1 2 3 4
1 Bagazo de caña lavado; 2 Carboximetil Celulosa CMC; 3 Paja de arroz; 4 Bagazo de caña
-
Cinética de crecimiento de E1.
Escogencia del método de evaluación de la cinética de crecimiento
Con los tres métodos utilizados se observó una tendencia similar en la cinética de
crecimiento; sin embargo, debido al poco crecimiento de los hongos en los volúmenes
analizados, fue necesario colectar el contenido de dos tubos para realizar la cuantificación
de la masa . De otro lado, debido a que no se contaba con equipo para la cuantificación
precisa de hidrógeno por GLC, el desplazamiento del émbolo medido por una jeringa
hipodérmica de tuberculina probablemente genera imprecisiones dependiendo del
operador. El método del formiato fue de fácil implementación y no presenta las deventajas
de los dos métodos anteriores.
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Cinética proliferativa en los residuos de cosecha.
El hongo E1 mostró habilidad para crecer en todos los sustratos ensayados; sin embargo
el crecimiento en Cascarilla de café fue tan lento que podía evidenciarse por la inspección
visual de los cultivos. El mayor crecimiento se observó en celulosa cristalina en donde el
hongo alcanzó su fase estacionaria alrededor del día cinco, le siguió bagazo de caña y
luego paja de arroz en donde la fase estacionaria se alcanzó desde el tercer día de
cultivo.
~ 0,1 . ..------
~ 0.08 .~ 0,06
.2 0.04
:ll 0,02 ~ o +--.,------,----,-----,---1
o 2 4 6 8 10 10
Dias
o 2 4 6 8
Dias
4
E. 3 e QI
E 2 ;:, "O 1 :>
O
O 2 4 6 8 10
Dias
Figura 7. Curva de crecimiento de E1 en medio con los azucares solubles glucosa- celobiosa.
47
Crecimiento de E1 en sustratos complejos 18
15
5EE 12
~ 9
~ 6 o !!:.
3
O ~~~---,--~----.--,--,--,---
O 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo - Da
---+- Celulosa - Bagazo
Paja Cascarilla
Figura 8 _ Curva de crecimiento de E1 en celulosa, bagazo, paja y cascarilla_
Actividad Enzimática
Actividad de celulasa - exoglucanasa
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En todos los niveles de pH y temperatura se observó actividad exoglucanasa cuyos
valores presentaron una distribución normaL La máxima actividad enzimática, se encontró
a una temperatura de 40 oC y pH =6.0 en todos los sustratos evaluados (fig) . En relación >r con el medio de cultivo en el cual fue cultivado el hongo E1 , la mayor actividad celulolítica
se presentó en Paja de arroz; aún cuando, el análisis estadístico de las actividades
máximas refleja que estos valores no son significativamente diferentes de las actividades
encontradas para Bagazo de caña y Celulosa cristalina. En contraste, los extractos de E1
cultivado en cascarilla de Café presentaron actividades exoglucanasas significativamente
menores, lo cual fue corroborado por el análisis estadístico (fig) .
-1 30
25
E 20 -- 15 :J E 10
5
O
-
4 5 6 7 8 9 10
pH
F Celulosa ~Bagazo--Paja
Figura 9. Efecto del pH sobre la actividad exoglucanasa en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha
30~------------------------------------------------------'
20
n"--------,----------~r_----------._----------._------~
Figura 10. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.
49
E
::J 15
:E E 10
5
O
20 30 40 50 60 70
Temperatura - oC
[-+- Celulosa -- Bagazo Paja Cascarilla I ~===--===========~
Figura 11. Efecto de la temperatura sobre la actividad exoglucanasa detectada en filtrados del hongo E 1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha
lO
~"---------~----------~----------~-----------r--------~
Figura 12. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 Y 40°C en los diferentes sustratos evaluados
50
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Actividad de CMC-asa - Endoglucanasa
En todos los niveles de pH y temperatura se observó actividad endoglucanasa cuyos
valores presentaron una distribución normal para pH pero no para la temperatura . En
todos los sustratos evaluados, la máxima actividad enzimática , se encontró a una
temperatura de 50 oC y pH = 6.5 (fig). En este caso, la mayor actividad celulolítica se ~
presentó en Celulosa cristalina seguida de Bagazo de caña y Paja de arroz ; sin embargo,
el análisis estadistico mostró que no existen diferencias significativas entre ellas. Los
extractos de E1 cultivado en cascarilla de Café presentaron actividades endoglucanasas
significativamente menores, lo cual fue corroborado por el análisis estadístico (fig). ( )
0,15
0,1 E-::J
0,05
° 4 5 6 7 8 9
pH
¡--+- Celulosa - Bagazo Paja ~ Cascarilla
Figura 13. Efecto del pH sobre la actividad endoglucanasa en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha
021)
O. 1r.)
f-
o.m t
~ " l
0.21 t
O. \l)
~ n~"-______-.__________~________-.__________,-______~
-¡
8'9" 0 Cs._ ~ 1'1;
St .."
Figura 14. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.
0 ,15
E 0,1
....:
=' 0 .05 ·
o 20 30 40 50 60 70
Temperatura - oc I -+-- Celulosa --=- Bagazo p-ja ~-~--a----
Figura 15. Efecto de la temperatura sobre la actividad endoglucanasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha.
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