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4.-ENZIMOLOGIACLINICAI2012
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26-10-2012 1 ENZIMOLOGÍA CLÍNICA BIOQ 142 2012 T.M. Mg. Cs (c) Carlos Oyarzún Instituto de Bioquímica y Microbiología Universidad Austral de Chile Introducción Casi todas las funciones biológicas se realizan gracias a reacciones químicas catalizadas por las enzimas. Prácticamente todas las enzimas son proteínas. Las moléculas de RNA desempeñan en ocasiones papeles catalíticos) Ej: La conversión de sacarosa en CO 2 yH 2 O en presencia de oxígeno es un proceso altamente exergónico, sin la catálisis, reacciones como la de la oxidación de la sacarosa no podrían darse en una escala de tiempo conveniente.
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ENZIMOLOGÍA CLÍNICABIOQ 142 2012
T.M. Mg. Cs (c) Carlos Oyarzún
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Universidad Austral de Chile
Introducción
Casi todas las funciones biológicas se realizan gracias a
reacciones químicas catalizadas por las enzimas.
Prácticamente todas las enzimas son proteínas. Las moléculas de RNA desempeñan en ocasiones papeles catalíticos)
Ej: La conversión de sacarosa en CO2 y H2O en
presencia de oxígeno es un proceso altamente
exergónico, sin la catálisis, reacciones como la de la
oxidación de la sacarosa no podrían darse en una escala
de tiempo conveniente.
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Las enzimas aceleran las reacciones químicas, pero no
alteran el equilibrio de una reacción, sino que tan solo
son capaces de disminuir la energía de activación y
acelerar así su velocidad.
Descripción de una reacción enzimática:
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
E = enzima
S= sustrato
P=producto
Las enzimas alteran la energía de
activación pero no el equilibrio
Las enzimas disminuyen la energía de
activación
Cuando ocurre una reacción química,
el sustrato debe adquirir una energía
de activación hasta un punto
denominado “estado de transición
de la reacción”, que posee un nivel
de energía máximo.
Dado que el estado de transición de
la reacción catalizada por la enzima
tiene una energía menor que en la
reacción no catalizada, aquella puede
ocurrir más rápidamente.
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La formación de un complejo enzima
sustrato
En una reacción catalizada por enzimas, éstas se unen al
sustrato para formar un complejo.
La formación del complejo da pie a la formación de
la especie de estado de transición, que a su vez forma
el producto.
Modelo de ajuste inducido
La formación de un complejo enzima
sustrato
D-glucosa -> Glucosa 6-fosfato
Hexoquinasa
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Ejemplo: estado de transición…
Factores que afectan a las reacciones
enzimáticas
Concentración de sustrato.
Efecto de la temperatura.
Efecto del pH y composición del tampón.
Cofactores.
Concentración de inhibidores y activadores.
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Concentración de sustrato
Uno de los factores clave que afecta a la velocidad de una
reacción catalizada por una enzima es la concentración de
sustrato presente.
S > E ↑ actividad hasta obtener Vmax
Los métodos se realizan en exceso de
sustrato, de esta forma existe una propor-
cionalidad directa entre los resultados
obtenidos y la concentración de la
enzima a determinar.
Efecto de la temperatura
Alrededor de lo 65 °C se inactivan la mayoría de las
enzimas.
La congelación habitualmente no destruye las enzimas
Por cada elevación de 10 °C en la T° algunas enzimas
duplican su actividad.
Un aumento de un °C produce un aumento aprox. 10%
en la actividad.
Pero a medida que la T° aumenta, ↑ la degradación de la
enzima.
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Efecto de la temperatura
En la determinación de enzimas en diagnóstico clínico, la
T° de reacción más utilizada es de 37°C a pesar que a 25-
30°C las reacciones son más estables.
Entonces ¿por qué se utiliza habitualmente 37°C?
Efecto del pH y composición del tampón
La pepsina hidroliza ciertos enlaces
peptídicos de proteínas durante la
digestión en el estómago, tiene un pH
óptimo alrededor de 1,6. El pH del jugo
gástrico se encuentra entre 1 y 2.
La glucosa 6-fosfatasa de los hepatocitos,
con un pH óptimo alrededor de 7,8, es
responsable de la liberación de glucosa a la
sangre. El pH normal del citosol de los
hepatocitos es alrededor de 7,2.
Las enzima tiene un pH optimo o un intervalo de pH en
el que su actividad es máxima
1,6 7,8
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Efecto del pH y composición del tampón
A valores superiores o inferiores del pH óptimo
(o rango de pH) la actividad enzimática disminuye ¿Por
qué?
Algunas cadenas laterales de lo aminoácidos pueden actuar como ácidos o
bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio activo de la enzima
que dependen del mantenimiento de un cierto grado de ionización.
cambios en la estructura de la enzima:
- Sitio activo
- Conformación tridimensional
cambios en la carga: - de la enzima
- del sustrato
- ambos
Efecto del pH y composición del tampón
Los tampones elegidos deben tener un pKa de ± 1
unidad de pH respecto del pH óptimo de la enzima.
Muchas veces los productos de una reacción enzimática
son ácidos o básicos y al acumularse alteran el pH
óptimo de la enzima.
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Efecto del pH y composición del tampón
Como en el caso de la fosfatasa alcalina, algunos
tampones no solo sirven para regular el pH sino que
también participan en la reacción…
La etapa limitante de la reacción es la velocidad de
hidrólisis de la unión enzima-PO-2 para generar
nuevamente la enzima libre
…..EP ↔ E + P
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Efecto del pH y composición del tampón
Fosfatasa alcalina…
Tampón Glicina pH 10,2 ↑ actividad
Tampón Dietanolamina pH 10,2 ↑ ↑ ↑ actividad
¿Cuál es la diferencia?
La dietanolamina regula el pH de la reacción y actúa
como aceptor del fosfato liberado por la fosfatasa
(transfosforilación), lo que produce una ↑ ↑ ↑ actividad
de la enzima.
Cofactores
Iones inorgánicos ó moléculas orgánicas más complejas.
Algunas enzimas requieren para su máxima actividad de
uno o varios componentes químicos, estos son iones
inorgánicos tales como el Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+
Amilasa requiere Cl-
Fosfatasa alcalina requiere Mg2+
Piruvato quinasa requiere K+ además de Mg2+
En cada caso se debe determinar la concentración óptima
del cofactor.
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Diferentes enzimas requieren diferentes cofactores
Por ejemplo:
Deshidrogenasas → requieren NAD+ o NADP+
Transaminasas → requieren piridoxal-5-fosfato
En general el cofactor se adiciona a una concentración
≥ 10 veces el Km
Cofactores
Cofactores
Espectro de absorción de cofactores NAD+ y NADH
Det. Láctico deshidrogenasa (LDH)
Piruvato + NADH +H+ ↔ L-lactato + NAD +
LDH
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Determinación de Aspartato Amino Transferasa (AST/GOT)
¿Que compuesto se lee y a que longitud de onda????
Factores que afectan a las reacciones
enzimáticas
Concentración de sustrato.
Efecto de la temperatura.
Efecto del pH y composición del tampón.
Cofactores.
Concentración de inhibidores.
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Enzimas, su valor dignóstico
Clasificación general de enzimas plasmáticas
Las enzimas en el plasma pueden clasificarse como:
Funcionales: Se encuentran en circulación, cumpliendo una
función específica .
Generalmente sintetizadas en el hígado y liberadas al torrente
sanguíneo.
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Clasificación general de enzimas plasmáticas
No funcionales: NO se encuentran plasma, o sus niveles son
muy inferiores a los que existen en los tejidos.
Su aumento en circulación generalmente se asocia a daño tisular.
Pueden dar especificidad tisular para aquellos tejidos más ricos en
ellas.
→ secreciones exocrinas (Amilasa, lipasa)
→ constituyentes intracelulares (CK, LDH)
En condiciones fisiológicas…
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Alteración de la Concentración Enzimática en
Circulación Sanguínea
Aumentos de la actividad enzimática
1. Incremento patológico de la permeabilidad de
membrana.
2. Muerte y destrucción celular.
3. Inducción de la expresión.
4. Proliferación celular.
Alteración de la Concentración Enzimática en
Circulación Sanguínea
Disminuciones de la actividad enzimática.
1. Intoxicaciones (apoptosis, necrosis, disfunción celular…*)
2. Enfermedades crónicas (idem anterior)
3. Alteraciones del estado nutritivo (principalmente
disfunción celular…*)
* En algunos casos también se observan aumentos de actividad enzimática.
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El Valor Diagnóstico de las Enzimas
El Valor Diagnóstico de las Enzimas
Depende de:
Localización: a nivel de tejidos e intracelular (citosólica u
organelo)
Vida media en sangre (tamaño, inhibidores o
desestabilizadores)
Factores de circulatorios (vascularización del área,
presencia o ausencia de barrera inflamatoria, velocidad
de circulación del líquido extracelular)
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Características de las enzimas utilizadas como
marcadores:
• Intracelulares de concentración muy baja en plasma.
• Su relación concentración plasma/tejidos es < 1:1000.
• La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha
habido lesión (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulación de
enzimas normalmente confinados en el interior de las células.
• La cantidad de actividad enzimática medible depende de su liberación al
medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminación.
• Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en
un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular específico.
Laboratorio
Determinaciones con el uso de enzimas
Determinaciones:
Actividad enzimática
Cuantificación de enzimas
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Tipos de Ensayo enzimáticos
Punto final / tiempo fijo:
Cinético / dos puntos:
Punto final / cinético
ACOPLADO:
Laboratorio
Determinaciones con el uso de enzimas
Determinaciones:
Actividad enzimática
Cuantificación de enzimas
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Glucosa GOD/PAP
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
Peroxidasa
2H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato
quinonimina roja
FACTORES QUE AFECTAN A LAS REACCIONES ….
Concentración de sustrato:
pH y composición del tampón: PREPARACIÓN REACTIVOS/KITS
Cofactores:
Efecto T°: Programación / control de equipos
Concentración de inhibidores: Tipos de muestras, plasma, suero, orina, LCR
Laboratorio
Determinaciones con el uso de enzimas
Determinaciones:
Actividad enzimática
Cuantificación de enzimas
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Unidad de Actividad Enzimática (UI)
Definición:
Una unidad Internacional de actividad enzimática (UI) es la
cantidad de enzima necesaria para transformar un micromol
(µmol) de sustrato en un minuto bajo condiciones óptimas de
temperatura y pH
En las determinaciones clínicas, la concentración de enzimas de
una muestra generalmente se expresa en U/L (Actividad
enzimática)
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA…
Actividad enzimática (U/L)
- Generalmente cinéticas/2 Puntos
- generación de un producto
- disminución de sustrato
- determinación de Abs min
- coeficiente de Ԑ Molar
