3.Electroforesis Taller
-
Upload
melivette05 -
Category
Documents
-
view
134 -
download
0
Transcript of 3.Electroforesis Taller
Electroforesis Dr. Héctor L. Ayala del Río AMGEN Bruce Wallace Program UPR-Humacao
Primera tarea Derretir Agarosa
Combinar en un matraz: Agarosa Solución amortiguadora 1X SB
Derretir empleando protocolo alterno Verter gelatina
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Electroforesis Método utilizado para separar y
purificar macromoléculas: Proteínas DNA RNA
Principio: Separar moléculas a base de su tamaño. Diferencias en fricción en un medio
poroso
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Agarosa
Polímero lineal de galactosa Agente solidificante de
alimentos y medios de cultivo Extraído de algas marinas Puede poseer impurezas El tamaño del poro depende
de la cantidad de agarosa y el tipo de agarosa
D-galactose 3,6-anhydro L-galactose
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Matriz porosa
• Agarosa polimerizada (1×1 µm)
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
¿Cómo vamos a obligar al DNA a pasar a través de los poros?
Ácido deoxyribonucleico (DNA)
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Nucleótidos
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
¿Quién llegará primero?
¿El elefante o el ratón?
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
¿Quién llegará primero?
¿Porqué?
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Migración del DNA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=hmg&part=A1236
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Animación
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa
AMGEN Bruce Wallace
Efectos de la conformación
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Migración de los fragmentos en una gel
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/gel/
Virtual Gel Electrophoresis Additional Information on Gel Electrophoresis:
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Aspectos Prácticos
Casting tray
Gel combs
Power supply
Gel tank Cover
Electrical leads
Electrophoresis Equipment
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
La agarosa se preparará mezclando el polvo con la solución amortiguadora
Se utilizará un matraz que sea 5 volúmenes o más respecto al volumen a derretir
Agarose
Amortiguador
Matraz
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Derritiendo la agarosa
Agarosa a temperatura de salón es insoluble
Luego de hervir el matraz la Agarosa se disuelve y la solución se torna cristalina
1. Mezclar la solución periódicamente durante el calentamiento para facilitar que los agarosa se disuelva
2. CUIDADO: La solución de agarosa se puede sobre-calentar en el microondas y puede hervir abruptamente al moverla.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Sellar los extremos de la bandeja usando cinta adhesiva y colocar la peinilla. La peinilla no debe tocar el fondo de la bandeja. Colocar la bandeja sobre una superficie nivelada.
Preparación de la bandeja de electroforesis
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Permite que la agarosa se enfrie un poco (~60ºC) y cuidadosamente vierte la solución en la bandeja. Evita que se formen burbujas al vertirla.
Virtiendo la Agarosa
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Si la cantidad de agarosa fue suficiente las peinillas estarán sumergidas en la agarosa derretida.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Una vez fria, la agarosa se polimeriza formando una gelatina flexible. Su aparencia será blancuzca y menos transparente (30-45 minutos). Remueva cuidadosamente las peinillas y la cinta adhesiva.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Colocar gel con bandeja en cámara
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
¿Cuánto amortiguador hace falta?
3-5 mm sobre la agarosa (~250 ml) Muy poco
Se seca la agarosa En exceso
> 10 mm mayor distorsión de las bandas Disminución de la migración del DNA
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
amortiguador
Cátodo (negativo)
Ánodo (positivo)
pozos
DNA
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
6X Tinte de cargado: • Bromophenol Blue (color) • Glycerol (peso)
Preparación de las muestras Para poder cargar la
muestra de DNA en los pozos es necesario: Sea más densa que la
solución Posea coloración que la
distinga del amortiguador
La muestra se mezcla con tinte de cargado que posee un tinte y glicerol para aumentar la densidad de la solución
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Cargado de la gel
Utilizando la micropipeta mezclamos el tinte con el DNA. Luego se toma la mezcla y se deposita en el pozo colocando la punta de la micropipeta sobre el pozo. Al descargar la muestra ésta debe caer en el pozo por la diferencia en peso. Tener cuidado de no perforar la gel
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Técnica A
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Técnica B
Cierra la caja de puntas!
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Técnica C Estilo taco de
billar
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
La punta de la
micropipeta debe estar SOBRE EL POZO, NO DENTRO!!!
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Pozos perforados por
la punta de micropipeta
causarán que la muestra
salga.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Coloque la tapa de caja de electroforesis conectando los cables a los polos. Conecte los polos a la fuente de energía. Asegúrese de colocar los polos correctamente. El negro (negativo) siempre tiene que estar en el lado de los pozos. Cuando encienda la corriente se deben producir burbujas en los polos dentro de la cámara de electroforesis.
Running the Gel
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
wells Bromophenol Blue
Cathode (-)
Anode (+)
Gel
After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA.
DNA (-)
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Separación
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
100 200 300
1,650
1,000
500
850 650
400
12,000 bp
5,000
2,000
-
+
DNA migration
Marcador de Pesos moleculares
Para poder determinar los tamaños de los fragmentos de la gel es necesario una referencia con valores conocidos.
Usando el marcador podemos determinar por comparaciones los tamaños de los desconocidos.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Tinción con Bromuro de Etidio
***CUIDADO! El Bromuro de Etidio es mutagénico y tóxico. Guantes deben de ser utilizados en todo momento.
• Para detectar el DNA es necesario teñirlo con Bromuro de Etidio, un tinte que fluoresce en presencia de luz ultravioleta.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Incorporación del Bromuro de Etidio
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Teñir la gelatina
• Coloca la gelatina en la bandeja de tinción con el tinte. • Tiñe la gelatina por 10-20 minutos. • Destiñe la gelatina en agua destilada por 5 minutos. • Reemplaza el agua de la bandeja de desteñir vairas veces para que la destinción sea eficiente.
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Sistema de fotodocumentación
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Electroforesis luego de tinción con bromuro de etidio
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Electroforesis
© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace
Pozos Marcador
peso molecular