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PCR en tiempo realPCR en tiempo real

Monitorización de la amplificación

Evaluación de los productos de amplificación

¿Qué se hace en la Real time PCR?

PCR en tiempo realPCR en tiempo real

¿Qué se hace en la Real time PCR?

OBJETIVO: estimar la cantidad inicial de un DNA diana

La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en cada ciclo con un mecanismo que genera un señal fluorescente proporcional a la cantidad de diana amplificada.

Principios:

• Se basa en un agente fluorescente ( reporter )

• El primer incremento significativo de la candidad de producto de PCR ( ciclo Ct) correlaciona con la cantidad inicial de diana.

PCR en tiempo real

21 32

Curvas de fusión

Aplicaciones

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PCR en tiempo real

450 500 550 600 650 700 750 800 850

Wavelength nm

Fluorescein

Hex

Red 610

Red 640

Cy5

Red 705

Ch 1530 nm

Ch 2555 nm

Ch 3610 nm

Ch 4640 nm

Ch 5670 nm

Ch 6710 nm

Marcadores inespecificos( SybrGreen)

Sondas

Tipos de marcadores

PCR en tiempo real

Fluorescencia

PCR en tiempo real

Marcadores inespecíficos

SYBRGreen®

El SYBR green es una molécula que se une específicamente al DNA de doble cadena, incrementando de manera muy importante su florescencia. Durante la fase de extensión, mas y mas DNA se unirá al producto de PCR incrementándose el señal. En cada ciclo de PCR se genera un señal mayor. .

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PCR en tiempo real

SYBRGreen®

Marcadores inespecíficos

PCR en tiempo real

SYBRGreen®

Marcadores inespecíficos

• Emite un fuerte señal al unirse al DNA

• Es una unión inespecífica

• Requiere una extensiva optimización

• Permite hacer análisis de curvas de fusión

• Amplicones largos generan señales mayores

• Es mucho mas económico que trabajar con sondas

• Una buena opción para secreening o para análisis en los que se conoce muy bien el tipo de muestra.

PCR en tiempo real

Sondas FRET, Fluorocromo-Reporter

Hyb Probes

Sondes de Quencher-Reporter:

Taqman ( hidrólisis)

Molecular Beacons

Scorpion

Eclipse

Sondas Lux

…plexor, Universal probeLib.

Marcadores específicos

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PCR en tiempo real

• Fluorochrome+Reporte = light emission• Both molecules have to be very close together for the reporter to

absorb the emitted fluorescence

F R F

NO light

LightR F R

F R F R F R

Fluorocromo & Reporter

Sondas Fluorocromo-Reporter

PCR en tiempo real

Hybridization probes

PCR en tiempo real

Sondas de Hibridación (Hyb Probes) FRET

FluoresceinLC Red

Hybridization probes

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PCR en tiempo real

• Sondas Hidrólisis: TaqMan

• Sondes de Reporter-Quencher (no hidrólisis):Molecular BeaconsScorpionEclipse

Sondas Fluorocromo-Quencher

PCR en tiempo real

• Un fluorocromo es una molécula que absorbe la luz de una longitud de onda específica y emite luz (la fluorescencia) de una longitud de onda más baja

• Un quencher es una molécula que absorbe la luz emitida por un fluorocromp

F Q F Q

light

F Q

Fluorocromo- Quencher: fundamento

Fluorocromo & Quencher

PCR en tiempo real

• Fluorochrome+quencher = no light emission• Both molecules have to be very close together for the quencher to

absorb the emitted fluorescence

F Q F Q

light

F Q

F Q F Q

light

F Q

NO light

Light

Fluorocromo & Quencher

Fluorocromo- Quencher: fundamento

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PCR en tiempo real

• A specific probe that will hybridize within the amplified product

– It requires the identification of a third signature sequence

• Probe is labeled with a F and a Q

• The 5’-exonuclease activity of the Taqpolymerase hydrolyze the probe, releasing the F from the Q

Sondas Taqman

PCR en tiempo real

Sondas de Hidrólisis (TaqMan Probes)

reporter quencher

Sondas Taqman

PCR en tiempo real

Elcipse probes

-Son similares a las sondasTaqman, pero sin hidrólisis

- Presentan bases modificadas y MGB, que mejoran el funcionamieno de la sonda e incrementan su Tm

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PCR en tiempo real

Molecular Beacons

– Contiene un F y un Q

– La hairpin structure acerdaF y el Q si estan en disolución

– En la fase de hibridizaciónla sonda se une a su diana

• No se destruye durante la reacción

• En cada cilo se une a sudiana

PCR en tiempo real

Molecular Beacons

F-Q interaction is based on FRET ‘fluorescence resonance energy transfer’

PCR en tiempo real

-Son verdaderamentebifuncionales, actuan como primer y sonda ( a diferencia de las lux). Mantienen el doble nivelde especificidad.

- Señales más estables y intensos, tiempos de reaccióncortos y discriminacionesexcelentes.

- Diseño complejo

Scorpion probes

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PCR en tiempo real

Scorpion probes

http://www.dxsgenotyping.com/0608.swf

PCR en tiempo real

Comparación de curvas de PCR usando diferentes marcadores.

PCR en tiempo real

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

Lux primers

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PCR en tiempo real

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

Lux primers

PCR en tiempo real

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

Lux primers

PCR en tiempo real

http://www.roche-applied-science.com/publications/multimedia/upl/wbt.htm

¿El futuro ?

The unique combination of online available assay design software andonly 165 prevalidated, real-time PCR probes allows to quantify virtually anytranscript in the transcriptomes of a large number of organisms.

Universal ProbeLibrary

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PCR en tiempo real

• http://biosearchtech.com/download/flash_guides/formats_explained.html

PCR en tiempo real

Detection Chemistries

2%

3%

9%

9%

15%

19%

78%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%

TaqMan probes

Molecular Beacons

FRET probes

LUX fluorogenicprimers

MGB Eclipse probes

Other

Scorpion probes

www.scienceboard.net (2003)

PCR en tiempo real

Curvas de fusión

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PCR en tiempo real

La derivada de las curvas de fusión genera picos de fusión

Temperature °C Temperature °C

Fluo

resc

ence

(F1)

Fluo

resc

ence

-d (F

1) /

dT

Curvas de fusión

PCR en tiempo real

Brucella Gram negativasGram positivas

Curvas de fusión

PCR en tiempo real

Tm depende de

Tm varía por:

— Salt concentration— MgCl2 concentration— SYBR Green I concentration

Low GC 41 °C High GC

50 bp 10 °C 10,000 bp

secuencia

tamaño

Curvas de fusión

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PCR en tiempo real

Primers

Melting peaks

Sondas fluorescentes(especificas)

Niveles de especificidad