Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular I

Segundo Laboratorio Agua, pH y Acción Amortiguadora de los Aminoácidos

I. Introducción

Las biomoléculas polares orgánicas e inorgánicas de las células vivientes existen y

reaccionan de manera primaria en un ambiente acuoso. El agua, una molécula notablemente escencial para la vida, solubiliza y modifica las características de biomoléculas como ácidos nucleicos, proteínas y carbohidratos al formar puentes de hidrógeno con sus grupos funcionales, interacciones que modifican las propiedades de dichas biomoléculas y sus conformaciones en una solución.

La comprensión de los mecanismos homeostáticos utilizados por los organismos

para conservar un entorno intracelular relativamente constante debe considerar el pH, el amortiguamiento del mismo a nivel de los líquidos corporales y compartimientos subcelulares.

Por otro lado tenemos que una de las múltiples funciones de los aminoácidos es que, tanto aminoácidos libres, así como, algunos que aún formando parte de las proteínas, pueden potencialmente funcionar como buffers. Esto se debe gracias a que los aminoácidos en un medio acuoso contienen un grupo carboxilo que funciona como ácido débil, y un grupo amino que funciona como base débil.

II. Objetivos 1. Definir el concepto de amortiguador (buffer) y estudiar sus funciones y modo de

acción. 2. Conocer los componentes de un buffer. 3. Demostrar la acción de los amortiguadores en el pH. 4. Demostrar la acción amortiguadora de los aminoácidos.

III. Procedimiento

III a) Sustancia buffer 1. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera:

a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de anaranjado de metilo. b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de ácido acético + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo. c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de ácido acético + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo.

Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de ácido clorhídrico 0.1N hasta observar un cambio de color en comparación con el beaker 3. Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso.

2. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera:

a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de fenolftaleína. b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de ácido acético + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de fenolftaleína. c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de ácido acético + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de fenolftaleína.

Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de hidróxido de sodio 0.1N hasta observar un cambio de color en comparación con el beaker 3. Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso.

III b) Acción buffer de los amonoácidos

1. Se toman 2 beakers y se agrega 10ml de glicina 0.1N a cada uno y se procede a medir

el pH de la misma (pH basal) 2. Se toma uno de los beakers y con el electrodo del pHmeter dentro de la solución, se

procede a titular con HCl 0.1N de la siguiente manera:

5 veces 0.1ml (2 gotas) 5 veces 0.2ml (4 gotas)

14 veces 0.5ml (10 gotas) 5 veces 0.2ml (4 gotas) 5 veces 0.1ml (2 gotas)

En cada adición de HCl, esperar y anotar la medida de pH

3. Se toma el otro beaker con glicina y con el electrodo del pHmeter dentro de la solución, se procede a titular con NaOH 0.1N de la misma forma descrita en el paso anterior.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO 1. AGUA, pH y BUFFER 2. GENERALIDADES, PROPIEDADES Y TITULACION DE LOS

AMINOACIDOS

Acción Buffer de los Aminoácidos

pH Basal de Glicina

Volúmen HCl

pH Volúmen NaOH

pH

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Tercer Laboratorio Actividad de la Anhidrasa Carbónica y Acidez Titulable

I. Introducción

El mantenimiento estable de la concentración de hidrogeniones a nivel del

organismo es escencial para la vida. Generalmente el pH tanto a nivel intra como extracelular es mantenido a niveles muy constantes. El pH del organismo es estabilizado gracias a la capacidad amortiguadora que poseen los líquidos corporales.

Uno de los buffers en el organismo es el ácido carbónico; este ácido en solución se encuentra parcialmente disociado en hidrogenión y bicarbonato: H2CO3 H+ y HCO3¯. Si a una solución de ácido carbónico le añadimos H+, el equilibrio de la ecuación anterior tiende a desviarse a la izquierda, y por el contrario si agregamos grupos OH¯ a la solución el equilibrio tiende a ir a la derecha de la ecuación. Como ejemplo de otros buffers a nivel del organismo tenemos a las proteínas tanto intra como extracelulares.

Uno de los órganos que contribuye con el mantenimiento del pH a nivel sistémico

son los riñones durante la formación de la orina. En el laboratorio podemos determinar la cantidad de H+ añadidos al líquido tubular (orina) que se han combinado con el amortiguador de fosfato y otros amortiguadores orgánicos. El procedimiento consiste en titular la orina con una base fuerte como NaOH hasta un pH de 7.4, que es el pH normal del plasma. El número de miliequivalentes de NaOH necesarios para hacer que el pH de la orina vuelva a 7.4 es igual al número de miliequivalentes de H+ añadidos a la orina que se han combinado con el amortiguador de fosfato y otros amortiguadores orgánicos. El ácido titulable medido no incluye a los H+ unidos a NH4+ porque el pK de la reacción del amoníaco/amonio es de 9.2 y sólo llevamos con NaOH hasta un pH de 7.4.

II. Objetivos

1. Conocer los principales sistemas amortiguadores del organismo y su localización. 2. Estudiar la función, localización y modo de acción de la anhidrasa carbónica. 3. Definir la importancia y determinar la acidez titulable de la orina

III. Procedimiento III a) Acción de la Anhidrasa Carbónica

1. A un estudiante voluntario se le extraen 3 ml de sangre y se procede a desfibrinarla

en un beaker pequeño con perlas de cristal. 2. Se toman tres tubos de ensayo rotulados como A, B y C respectivamente y se

preparan de la siguiente manera:

a) Tubo A: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.5 ml de bicarbonato al 5%. b) Tubo B: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1 ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5%. c) Tubo C: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1 ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5% + 1 ml de acetazolamida al 1 %.

NOTA: Todos los tubos se preparan y se mantienen en hielo para lograr y mantener una temperatura de 4 grados centígrados.

3. Usando el pHmeter se procede a tomar el pH a cada tubo. 4. Luego se colocan los tubos en una corriente de CO2 y se tomará el tiempo necesario

para que el contenido de cada tubo de ensayo cambie de color.

5. Finalmente se procede a tomar nuevamente el pH de cada tubo.

Anote y analice los resultados obtenidos:

Tubo

pH antes del

CO2

pH luego del

CO2

Tiempo

A

B

C

III b) Acidez Titulable

1. Un estudiante voluntario procede a depositar orina en un beaker.

2. En otro beaker se toman 25 ml de la orina y se mide el pH.

3. Con el electrodo del pHmeter dentro del beaker se titulan los 25 ml de orina

con NaOH 0.1N hasta llegar a un pH de 7.4.

4. Se calculan los miliequivalentes de ácidos excretados en la orina utilizando la siguiente equivalencia:

1 ml de NaOH 0.1N ≈ 0.1 mEq de ácidos urinarios

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO PRINCIPALES SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL ORGANISMO Y SU LOCALIZACION

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular I

Cuarto Laboratorio Reconocimiento de los Aminoácidos y las Proteínas

I. Introducción

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes después del agua y desempeñan

un gran número de funciones, que las caracterizan como componentes escenciales e indispensables para la vida. Virtualmente todos los procesos en los organismos vivos dependen de este tipo de moléculas. Por ejemplo, las enzimas y las hormonas polipeptidicas dirigen y regulan el metabolismo en el cuerpo, mientras que las proteínas contractiles del músculo permiten el movimiento. En el hueso, forman el esqueleto necesario para el depósito de cristales de calcio y fosfato, actuando como lo hacen las varillas en el concreto armado. En el torrente sanguíneo, las proteínas como la hemoglobina y la albúmina plasmática son moléculas escenciales para la vida, igualmente las inmunoglobulinas participan en la destrucción de bacterias y virus. En resumen, las proteínas realizan una increible diversidad de funciones.

Las proteínas no son más que polímeros de 20 L alfa aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y van a mostrar una amplia variación en sus tamaños, formas y propiedades. Sus propiedades químicas y fisiológicas dependen no sólo de su tamaño y forma, sino tambien de las propiedades de los aminoácidos que las componen.

II. Objetivos

1. Estudiar la estructura, propiedades, clasificación y función de de los aminoácidos,

péptidos y proteínas. 2. Identificar aminoácidos y proteínas utilizando pruebas de laboratorio específicas.

3. Desmostrar el efecto de la desnaturalización de las proteínas por acción del pH,

metales pesados y la temperatura.

III. Procedimiento

III a) Pruebas utilizadas para la identificación de aminoácidos y proteínas:

1. Reacción de la Ninhidrina: Los aminoácidos en general reaccionan con la nihidrina (hidrato de hicelohidrindeno) en presencia de calor dando dióxido de carbono, amoniáco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. La reacción da lugar a la formación de un producto de color azul o púrpura, que es útil para la estimación cualitativa y cuantitativa de los aminoácidos. No obstante, el color azul no es específico para aminoácidos debido a que el amoníaco y la mayoría de los polipéptidos y proteínas desarrollan el color con la ninhidrina.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 5 gotas de la solución de ninhidrina. Se calienta en un baño de maría por 1 a 2 minutos y si la prueba es positiva se desarrollará un color azul.

2. Reacción de Biuret: La reacción de Biuret está dada por aquellas sustancias cuyas

moléculas contienen 2 grupos carbamino (-CO.NH) ligados directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. Sustancias similares que contienen en lugar del grupo carbamino, grupos CS.NH, también responden a la prueba. Esto implica que compuestos no proteicos que contienen los grupos necesarios responderán a la prueba. Las proteínas disuelven el hidróxido cúprico del reactivo y forman compuestos coloreados violeta o violeta-rosado que depende de la naturaleza de las proteínas.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret, mezcle bien y si la prueba es positiva se desarrollará un color violeta.

3. Reacción de Millón: Esta reacción se debe a la presencia de grupos hidroxifenilos

(C6H5OH) en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté sustituido en la posición 3, 5, como la tirosina, fenol y timol, dan lugar a la reacción. De estos compuestos, solamente la tirosina o tirosina halogenada se encuentran presentes en las proteínas, de manera que la reacción de Millón tiene lugar únicamente con las proteínas que tienen tirosina.

La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo de Millón es precipitado y se vuelve inactivo, razón por la que este reactivo no se usa para medir albúmina en la orina. Si la solución a examinarse es muy alcalina debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipita también el mercurio en forma de óxidos amarillos. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 3 a 4 gotas del reactivo de Millón. Se mezcla y se calienta en un baño de maría por 1 a 2 minutos. Las proteínas se precipitan por acción de los ácidos minerales fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar. Si no se desarrolla color añada 2 o 3 gotas más del reactivo y caliente otra vez. Se debe evitar un exceso de reactivo ya que puede producir un color amarillo, el cual no indica reacción positiva.

4. Reacción Xantoproteica: Esta reacción se debe a la presencia en la molécula proteica de grupos fenilos (-C6H5), con el cual el ácido nítrico forma compuestos nitrados amarillos. Los complejos de la molécula proteica de importancia en esta reacción son los de tirosina y triptófano. La fenilalanina no responde a este ensayo en las condiciones en que se ha desarrollado. La reacción no es satisfactoria para el examen de orina debido al color amarillo de la reacción final.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agrega 1 ml de ácido nítrico concentrado. Se calienta en un baño de maría y se observa la formación de un precipitado amarillento que se vuelve gradualmente amarillo y se disuelve impartiendo el color a la solución. Deje enfriar y añada cuidadosamente un exceso de hidróxido de amonio o de sodio y observe que el color amarillo se intensifica y pasa a anaranjado.

III b) Identificación de aminoácidos y proteínas: 1. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de agua destilada y proceda a

realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Millón y Xantoproteica. 2. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solución de glicina y proceda a

realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Millón y Xantoproteica.

3. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solución de albúmina de huevo diluida y proceda a realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Millón y Xantoproteica.

Anote y analice los resultados obtenidos.

Prueba Realizada Sustancia

Analizada Ninhidrina Biuret Millón Xantoproteica

Agua Destilada

Glicina

Albúmina

III c) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH: Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo a cada uno de ellos. Al tubo número 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado y observe, al número 2 agregue 10 gotas de ácido acético glacial y observe, al tubo número 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina+HCl

2 Albúmina+CH3COOH

3 Albúmina+Agua destilada

III d) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados: Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo a cada uno de ellos. Al tubo número 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata y observe, al número 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y observe, al tubo número 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina+Nitrato de plata

2 Albúmina+Nitrato de potasio

3 Albúmina+Agua destilada

III e) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura: Se toman 1 tubo de ensayo y se le agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo. Lleve el tubo al calor y observe. Luego realice la prueba de Biuret. Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina+Calor

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: ESTRUCTURA Y FUNCION DE AMINOACIDOS, PEPTIDOS Y PROTEINAS.

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Quinto Laboratorio Obtención e Identificación de la Caseína de la Leche

I. Introducción

La leche es un alimento muy nutritivo, ya que contiene proteínas, lípidos, lactosa, sales

inorgánicas y vitaminas. La caseína es la proteína principal, siendo esta una proteína conjugada que posee fósforo como grupo prostético.

Como muchas otras proteínas de origen animal, esta es de un alto valor biológico, ya que

posee todos los aminoácidos escenciales para el desarrollo y crecimiento normal del hombre. La separación de la caseína se realiza mediante la precipitación con ácido y junto a ésta,

cierta cantidad de grasa que será extraída con solventes orgánicos en los que la caseína es insoluble.

II. Objetivos

1. Conocer los fundamentos bioquímicos del aislamiento de la caseína.

2. Conocer la importancia de las reacciones de Biuret, Millón y Xantoproteica en la

identificación de la caseína y algunos de los aminoácidos que la componen. 3. Determinar la presencia en la leche de fosfatos utilizando la prueba de Molibdato de

Amonio y la presencia de cloruros mediante la prueba de Nitrato de Plata.

III. Procedimiento III a) Aislamiento de la caseína: 1) Caliente 100 ml de leche hasta 40 grados centígrados y luego agregue 1 ml de ácido

acético glacial hasta que precipite toda la proteína. Filtre con una gaza o al vacío hasta sacar el máximo de líquido. Guarde el filtrado para la determinación de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado acuoso.

2) Suspenda el precipitado del paso anterior en 50 ml de etanol al 95% y agite. Filtre con

una gaza o al vacío hasta sacar el máximo de líquido. Guarde el filtrado para la determinación de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado alcohólico. Repita el proceso añadiendo 50 ml de una solución alcohol-éter 1:1 y filtre al vacío. Guarde el filtrado para la determinación de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado alcohol-éter.

3) El resíduo obtenido es la caseína que procederemos a identificar.

III b) Identificación de la caseína y aminoácidos de la misma:

En 3 tubos de ensayo diferentes añada 0.5 gramos de la caseína obtenida y realice las pruebas de Biuret, Millón y Xantoproteica. Observe y anote los resultados.

Prueba Biuret Millón Xantoproteica Resultados

III c) Determinación de fosfatos y cloruros: 1) Tome los filtrados obtenidos durante el aislamiento de la caseína; si tienen turbidez

llevelos a centrifugar y tome el sobrenadante.

2) Determinación de fosfatos con la prueba de Molibdato de Amonio: En 3 tubos de ensayo por separados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidos en el paso A. Acidifique el medio añadiendo ácido nítrico y luego añada 2 ml de molibdato de amonio. Observe el cambio de color.

3) Determinación de cloruros con la prueba de Nitrato de Plata: En 3 tubos de ensayo por

separados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidos en el paso A y añada a cada uno nitrato de plata al 1% gota a gota. Observe la formación de un precipitado blanco.

Tabla de resultados

Filtrado Nitrato de plata Molibdato amonio Acuoso

Alcohólico Alcohol-éter

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Sexto Laboratorio Digestión de Carbohidratos por la Amilasa Salival

I. Introducción

Virtualmente todas las reacciones que ocurren en el organismo están mediadas por

enzimas, proteínas catalíticas que incrementan la velocidad de las reacciones sin que ellas se consuman durante el proceso que ellas catalizan. Sin enzimas la vida no sería posible ya que las mismas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfermedad.

La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzimas responde a las variaciones

sutiles del pH intracelular que caracterizan la acidosis o alcalosis metabólica. Además, dado que esta velocidad se eleva o disminuye en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban la homeostasia al modificar numerosas reacciones catalizadas por enzimas. Sin embargo estos cambios mínimos pueden convertirse en ventaja para el médico si éste manipula controladamente dichos cambios.

Otros factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas son

los cambios en la concentración, ya sea, de los sustratos sobre los cuales actúa la enzima, así como, cambios en la concentración de la propia enzima. También la cinética enzimática puede verse afectada debido a la presencia de sustancias inductoras o inhibidoras de la actividad enzimática.

II. Objetivos

1. Estudiar el concepto de enzima.

2. Analizar los diferentes factores que afectan la cinética enzimática.

3. Estudiar el papel de la amilasa salival en la digestión de los carbohidratos.

4. Introducir otras enzimas que participan en la digestión de los carbohidratos.

III. Procedimiento

III a) Efecto de la temperatura sobre la acción de la amilasa salival:

1. Tome 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solución saliva 1:9 y luego, lleve cada tubo a la temperatura indicada para cada uno de ellos en el cuadro que aparece más adelante y deje incubar durante 5 minutos.

2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solución almidón al 1%.

3. Dejando los tubos en su temperatura correspondiente, proceda a realizar la prueba

de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6 y 9 minutos luego de agregado el almidón.

4. Al cabo de los 9 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de

ensayo.

5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

Prueba de Yodo Tubo #

Temperatura 0 Min 3 Min 6 Min 9 Min

Prueba de Benedict

1 0 Grados

2 Temp. Ambiente

3 38 Grados

4 100 Grados

III b) Efecto del pH sobre la acción de la amilasa salival:

1. Tome 7 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1.5 ml de solución saliva 1:9 y luego, agregue 3 ml de la solución buffer correspondiente a cada tubo (indicado en el cuadro que aparece más adelante). Deje en incubación durante cinco minutos.

2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solución almidón al 1%.

3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6, 9 y 12 minutos luego

de agregado el almidón.

4. Al cabo de los 12 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo.

5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

Prueba de Yodo Tubo

#

Solución Buffer 0 Min 3 Min 6 Min 9 Min 12 Min

Prueba de Benedict

1 pH 2.5

2 pH 5.4

3 pH 6.0

4 pH 6.8

5 pH 7.4

6 pH 8.0

7 pH 10.0

III c) Efecto de la presencia de inductores e inhibidores enzimáticos:

1. Tome 6 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solución saliva 2:8, añada luego, a cada tubo, 1 ml de la sustancia indicada en el cuadro que aparece más adelante, deje en incubación durante cinco minutos.

2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solución almidón al 1%.

3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 5, 10, y 15 minutos luego de

agregado el almidón.

4. Al cabo de los 15 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo.

5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

Prueba de Yodo

Tubo #

Sustancia 0 Min 5 Min 10 Min 15 Min

Prueba de Benedict

1 Agua destilada

2 Cloroformo

3 NaF

4 NaCl 0.9%

5 Fenol puro

6 HgCl2 1%

Leer de su libro de texto: Propiedades generales de las enzimas Cinética enzimática Factores que afectan cinética enzimática

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Séptimo Laboratorio Caracterización de Carbohidratos

I. Introducción

Los carbohidratos se presentan en forma de azúcares, almidones y fibras, y son uno de los tres principales macronutrientes que aportan energía al cuerpo humano (los otros son los lípidos y las proteínas). Actualmente está comprobado que al menos el 55% de las calorías diarias que ingerimos deberían provenir de los carbohidratos. Los carbohidratos o hidratos de carbono ó glúcidos constituyen compuestos químicos formados principalmente por carbono, hidrógeno y oxígeno, elementos que se conjugan para formar diversos tipos, en una proporción generalmente de 1:2:1, respectivamente. Estas biomoléculas ejercen funciones fundamentales en los seres vivos, como: soporte (celulosa), reserva de alimento (almidón), reserva energética (glucógeno), energía inmediata (glucosa). Pueden clasificarse atendiendo a varios criterios: de acuerdo al número de monómeros que constituyen al carbohidrato, al número de carbonos de sus monómeros o según el grupo funcional que posee ese monómero. Entre los polisacáridos que son fisiológicamente importantes tenemos al almidón y el glucógeno. El primero está formado por una cadena α-glucosídica. Compuesto que solo produce glucose en la hidrólisis, es un homopolímero denominado glucosano o glucano. Constituye la fuente más importante de carbohidratos de los alimentos. Los dos constituyentes principales del mismo son: la amilosa (15-29%) que tiene estructura helicoidal no ramificada y la amilopectina (80-85%), que consiste en cadenas muy ramificadas. Por su parte, el glucógeno es el polisacárido que se almacena en el organismo animal y contiene una estructura mucho más ramificada que la amilopectina.

II. Objetivos 1. Estudiar las propiedades, diferencias y clasificación de los carbohidratos.

2. Utilizar distintas pruebas de laboratorio para caracterizar y clasificar los

carbohidratos.

III. Procedimiento

III a) Pruebas utilizadas para la identificación de carbohidratos: 1. Reacción de Molish: La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la reacción de Molish, que a cierto punto es la reacción universal para cualquier carbohidrato. Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o

hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) dando un producto coloreado. Realización de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue dos gotas de reactivo de Molisch y mezcle bien. Luego incline el tubo y deposite 1 ml de H2SO4 concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo. No mezcle. Sólo coloque el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta que aparece en la zona de contacto de los dos líquidos. 2. Reacción de Benedict: Una de las reacciones más comunes en la identificación de carbohidratos es la reacción de Benedict. Esta reacción es específica para azúcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Los disacáridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando ésta es formada. Esta prueba se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloración positiva de la reacción. La coloración dependerá de la concentración de óxido de cobre y ésta a su vez de la reducción del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloración. Realización de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 2 ml del reactivo de Benedict y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 100° C durante dos minutos. 3. Reacción de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una función cetona, que en presencia de un ácido fuerte producen rápidamente derivados furfúricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que está contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacárido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacárido de la fructosa) dan positiva la reacción, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrólisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reacción positiva). Realización de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 2 ml del reactivo de Seliwanoff y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 100° C durante dos minutos. 4. Reacción de Bial: Consiste en la formación de un producto de color azul-verdoso entre el furfural de los carbohidratos y el orcinol del reactivo de bial en medio clorhídrico. Es específica de pentosas. Realización de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 1 ml del reactivo de Bial + 2.5 ml de ácido clorhídrico concentrado y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 100° C durante 5-10 minutos. 5. Identificación de polisacáridos mediante la prueba de yodo: Los polisacáridos dan un color específico en presencia de yodo. El almidón que está compuesto de amilosa (estructura lineal) y amilopectina (estructura ramificada) cuando se le agrega yodo se obtiene un color azul ya que a pesar de que la amilosa es el componente menos abundante, está en la parte externa del gránulo de almidón, sin embargo, si realizaramos la prueba a la amilopectina únicamente obtuvieramos una coloración rojo-violeta en presencia de yodo. La prueba es igualmente satisfactoria para el glucógeno.

III b) Identificación de carbohidratos:

1. Utilizando 4 tubos de ensayo para cada uno de los carbohidratos indicados en la tabla que aparece más adelante, deposite 2 ml de cada uno de ellos en cada uno de los tubos y proceda a realizar las pruebas de Benedict, Molish, Seliwanoff y Bial a los tubos respectivamente.

RESULTADOS Carbohidrato Molish Benedict Seliwanoff Bial Glucosa 1% Maltosa 1% Manosa 1% Ribosa 1%

Galactosa 1% Fructosa 1% Lactosa 1% Sacarosa 1%

Agua destilada

2. En un plato de petri o en un vidrio de reloj coloque un poco de solución de almidón y agregue gotas de una solución de yodo. Repita el mismo procedimiento con un poco de yuca y papa.

Sustancia Resultados prueba de yodo Solución almidón

Yuca Papa

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICA CLASIFICACION, NOMENCLATURA Y ESTRUCTURA DE LOS CARBOHIDRATOS

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Octavo Laboratorio Caracterización de Lípidos

I. Introducción

Los lípidos son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono e hidrógeno y generalmente también oxígeno; pero en porcentajes mucho más bajos. Además pueden contener también fósforo, nitrógeno y azufre. Es un grupo de sustancias muy heterogéneas que tienen en común estas dos características: 1. Son insolubles en agua 2. Son solubles en disolventes orgánicos, como éter, cloroformo, benceno, etc. Son compuestos de gran importancia bioquímica, ya que desempeña grandes funciones como la liberación y reserva de energía química, proven de una barera hidrofóbica que permite la compartimentalización del contenido acuoso de las células y estructuras subcelulares. En adicción a esto, los lípidos llevan a cabo varias funciones en el organismo, por ejemplo, algunas vitaminas liposolubles tienen funciones regulatorias o funciones como coenzimas, y las prostaglandinas y hormonas esteroideas juegan papeles mayores en el control de la homeostasis del organismo. Hay ciertos ácidos grasos poliinsaturados esenciales que deben ser suministrados en la dieta como lo es el ácido linoleico dándole esto mayor valor nutricional. Los lípidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a que posean en su composición ácidos grasos (Lípidos saponificables) o no lo posean (Lípidos insaponificables), dividiendose así en dos grupos: 1. Lípidos saponificables A. Simples 1. Acilglicéridos 2. Céridos B. Complejos 1. Fosfolípidos 2. Glucolípidos 2. Lípidos insaponificables A. Terpenos B. Esteroides C. Prostaglandinas Los triglicéridos son los más abundantes en los vegetales y �uperio �uperiors. Se acumulan en los depósitos grasos y en las semillas como forma de reserva alimenticia.

II. Objetivos

1. Estudiar los lípidos; su importancia, estructura, clasificación, función y características físico-químicas.

2. Estudiar la importancia de las diferentes pruebas usadas en la identificación de los

lípidos y reacciones de importancia biológica para la identificación de las caracteristicas de los lípidos.

III. Procedimiento

III a) Solubilidad de los lípidos: Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc. Su solubilidad en alcoholes dependerá del tamaño del mismo así como de su ramificación (a mayor número de carbonos más soluble será el lípido no así con la ramificación). Procedimiento: Tome 10 tubos de ensayo y añada a cada tubo 2 mL de cada una de las siguientes sustancias o disolventes: Agua destilada, ácido clorhídrico concentrado, benceno, cloroformo, tetracloruro de carbono, éter, alcohol metílico, alcohol etílico, alcohol isopropílico, alcohol butílico . A todos los tubos añada 1 mL de aceite. Observe los resultados. III b) Número de yodo: Es una medida del grado de insaturación de los componentes de una grasa. Será tanto mayor cuanto mayor sea el número de dobles enlaces (C=C) por unidad de grasa, utilizándose por ello para comprobar la pureza y la identidad de las grasas. Es la cantidad (gramos) de yodo absorbidos por 100 gramos de grasa. El número de yodo oscila entre 0 (ácidos grasos saturados) a 350. Fundamento teórico del método: La grasa disuelta se hace reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. El yodo por sí mismo no reacciona con los dobles enlaces. En su lugar se utilizan bromo o halogenados mixtos como yoduro de cloro ICl o el bromuro de yodo IBr. La cantidad de monobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una solución de yoduro (I-) a yodo (I2), y éste se determina por valoración con una disolución de tiosulfato sódico (2Na2S2O3). La reacción de adición se lleva a cabo en oscuridad para evitar que se produzcan reacciones laterales de radicales inducidos por la luz y ello provocaría un gasto aparente mayor de halógeno, falseando los resultados. A continuación se muestran las tres reacciones involucradas:

1) IBr + R1-CH=CH-R2 → R1-CHBr-CHI-R2 2) IBr + KI → KBr + I2 3) I2 + 2Na2S2O3 → 2NaI + Na2S4O6 Procedimiento: 1) Tomar dos matraces de 500 ml cada uno. Uno de ellos será nuestro matraz blanco o control y el otro, nuestro matraz experimento o problema. Agrega las siguientes sustancias en sus debidos matraces. • Control: - 10 ml de Cloroformo. - 12 ml de yodo Hanus. • Experimento: - 10 ml de Cloroformo. - 12 ml de yodo Hanus. - 1.0 ml de aceite. 2) Lleve estos dos matraces, debidamente tapados, a la oscuridad por un período de 30 mins. Agitar ambos matraces cada 5 minutos. 3) Pasado este tiempo, retírelos de la oscuridad y agregue a cada matraz lo siguiente: • 7 ml de KI (solución de yoduro de potasio). Agitar. • 100 ml de agua destilada (lavar el tapón del matraz con esta agua para no perder yodo libre en él) quien añadirá volumen a la mezcla. 4) Titular el exceso de yodo de cada matraz con tiosulfato de sodio 0.1N hasta que la mezcla contenida en cada matraz tome una coloración amarillenta. Una vez que esto suceda, tape cada matraz y agítelo para conseguir que cualquier cantidad de yodo libre quede atrapado en la capa de cloroformo y se ponga en contacto con la solución de yoduro de potasio. 5) Agregue 1 ml de una solución de almidón al 1% como indicador para asegurarnos de que no quede yodo libre en la solución. 6) Calcule el número de yodo para la muestra dada. Cálculos: Calcule los gramos de yodo absorbidos por cada 100 grs. de grasa. 1) Para esto primero necesitamos saber qué cantidad de yodo se consumió en el matraz problema. Esto lo conseguimos restando la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridos por el blanco menos la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridos por el problema ya que esto representa el tiosulfato equivalente al yodo absorbido por la materia grasa. Ej. Suponiendo que el matraz control consumió 50 ml de tiosulfato mientras que el experimento sólo consumió 20 ml : 50-20 = 30ml que representan los ml de yodo consumidos ya que 1 ml de tiosulfato equivale a 1 ml de yodo. 2) Con una regla de tres busque los mililitros de yodo consumidos por 100 gramos de grasa. Ej. 10 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 ml de yodos consumidos 100 gramos de grasa -----x

3) Por ultimo ajuste estos ml de yodos a gramos que es lo que nos interesa. Esto lo puedes lograr por la siguiente regla de tres: Ej. 1ml de yodo ----- 0.0127 gramos de yodo. ml de yodos consumidos* ---- x * = resultado del cálculo anterior. 4) Por ultimo debes calcular el número de yodo en base al peso de la grasa, calculando la misma utilizando la formula de la densidad. D=m/V donde D = densidad, m = masa, V= volumen. D= 0.916 para la grasas. III c) Número de saponificación: La saponificación consiste en una hidrólisis alcalina de la preparación lipídica (conKOH o NaOH). Los lípidos derivados de ácidos grasos (ácidos monocarboxílicos decadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y alcohol, que son fácilmente extraíbles en medio acuoso.

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El número de saponificación no es más que los miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 gramo de materia grasa. Esta prueba es otra prueba cualitativa que podemos aplicar a los lípidos. Esta nos permite ver si el tipo de lípido es saponificable (contiene ácidos grasos) o no (no contiene ácidos grasos). En los lípidos saponificables nos orienta hacia cuál sería el peso molecular de la molécula expresando una relación inversa entre esta molécula y el número de saponificación. Se describe una relación inversa ya que a menor peso de la molécula mayor cantidad de moléculas existirán en cierta cantidad grasa dada, así que mayor cantidad de ácidos grasos habrán. Debido a esto último también habrán muchos grupos carboxílicos con los cuales reacciona el KOH. Por lo tanto, mayor cantidad de KOH consumida dará un número mayor de saponificación. Tomemos los dos ejemplos siguientes de Tripalmitina (PM=819)y Tributirinina(PM=412). En 1 gramo de tributirina hay mayor número de moléculas de tnglicéridos que en 1 gramo de tripalimtina, éste último por tener mayor peso molecular, completa el gramo de grasa con menor número de moléculas de triglicéridos.

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Efectivamente, teniendo en cuenta que el peso molecular de la tripalmitina es 819 y de la tributirina es 302, habrá 819/302 6 2.7 veces más moléculas de tributirina que de tripalmitina en un mismo peso de cada una de las grasas indicadas. En conclusión, el número de saponificación de la tributirina será también 2.7 veces mayor que el de la tripalnitina. Procedimiento: 1) Tomar dos matraces de 250 mL cada uno. Agrega las siguientes en sus debidos matraces: • Control: - 50 mL de KOH • Experimento: - 50 mL de KOH. - 5mL de aceite. 2) Conecte cada matraz a un condensador de reflujo enfriado por aire y lleve a baño de maría por 30 minutos. Agite con frecuencia. 3) Añada 1mL de fenolftaleína (indicador de medio básico) a cada matraz y luego titule con HCl 0.5N para corregir cualquier consumo de álcali del control. Anote los mL consumidos por cada matraz. 4) Calcule el número de saponificación. Cálculos: Calcule los miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 gramo de materia grasa. 1) Para esto primero necesitamos saber qué cantidad de KOH que se consumió en el matraz problema que lo conseguimos restando la cantidad HCl 0.5N consumidos por el blanco menos la cantidad de HCl 0.5N requeridos por el problema. Ej. Suponiendo que el matraz control consumió 50 mL de HCl mientras que el experimento sólo consumió 20 mL : 50-20 = 30mL. 2) Como lo deseado es saber los gramos de grasa y no los ml de ella, convierta los mL consumidos a gramos con la fórmula de la densidad de la grasa: D=m/V donde D = densidad, m = masa, V= volumen. D= 0.916 para la grasas. Ej. 10 mL de aceite; m=D*V= 0.916*10mL=9.16gr. 3) Con una regla de tres busque los mililitros de HCl consumidos por 1 gramo de grasa. Ej. 9.16 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 mL de HCl consumidos

1 gramos de grasa ---- -x 4) Por ultimo ajuste estos mL de HCl a su equivalente en KOH que es lo que nos interesa. Esto lo puedes lograr por la siguiente regla de tres: Ej. 1mL de HCl ----- 28.05 mg de KOH. mL de HCl * ---- x *= resultado del cálculo anterior.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: LIPIDOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICA, FUNCIONES, CLASIFICACION, CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS.

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular I

Noveno Laboratorio Ácidos Nucleicos

I. Introducción

Estructura Primaria. En todas las células vivas hay ácidos nucleicos; en su mayoría están constituyendo las nucleoproteínas, complejos formados por proteínas básicas (protaminase histonas) y ácidos nucleicos. Desde que Miescher aislara por vez primera una nucleoproteína, en 1869, se han puesto a prueba numerosas técnicas para separar los ácidos nucleicos de las proteínas a las que están unidas. Se sabe que no todos los ácidos nucleicos son iguales; en los tejidos constituidos por células provistas de grandes núcleos, como el Timo, predomina un tipo de ácido nucleico, llamado antes ácido timonucleico; en otras células, que tienen núcleos diminutos, como las levaduras, predomina un tipo distinto: ácido nucleico de levadura. Estos dos tipos de ácidos nucleicos se denominan hoy, atendiendo a su composición química, ácido desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) respectivamente. El ADN está fundamentalmente compuesto de fosfato, las bases púricas: adenina y guanina, las bases pirimídicas: timina y citosina, y el azúcar 2-desoxi-d-ribosa. El ARN difiere del ADN por contener la base pirimídicas uracilo en lugar de la timina y el azúcar d-ribosa en lugar de la 2-desoxi-d-ribosa. Los datos que hoy poseemos ponen de manifiesto la existencia de una fórmula química básica, común a ambos tipos de ácidos nucleicos y consistente en una cadena o esqueleto constituido por grupos alternados de fosfato de azúcar furanosa unidos por enlaces regulares 3’5’fosfodiester. Las bases púricas o pirimídicas se unen a este esqueleto o cadena de azúcar–fosfato a través de enlaces Beta–N–glicósilo en la posición 1’de la ribosa o de la desoxirribosa. A cada sub-unidad estructural, formada por una base nitrogenada y un azúcar, se le denomina nucleósido. A estos que contienen un fosfato en las posiciones 2’, 3’ ó 5’ se les llama nucleótidos (el número seguido del signo (‘) indica la posición en la base. A los compuestos formados por asociación de dos o más nucleótidos, constituyendo pequeñas moléculas, se les denomina oligonucleótidos. Estructura Secundaria. Los diversos estudios fisioquímicos del ADN en solución acuosa han demostrado que se trata de un polímero del elevado peso molecular (5x10 elevado a la sexta potencia) y que ofrece una configuración mas bien rígida y distendida. Entre las consecuencias de su elevado peso molecular y de la rigidez de sus moléculas se destaca la elevada viscosidad de las soluciones acuosas de ADN. Solución con 10–4 g/ml de ADN, es dos veces más viscosa que el agua. Otra consecuencia de las citadas propiedades de la molécula de ADN es la gran

facilidad con que las fuerzas de fricción (agitación a gran velocidad, paso a través de una pipeta o jeringa) reducen su peso molecular por rotura de su cadena. Es prácticamente imposible obtener a partir de material biológico ADN sin que tenga cierto grado de fricción, por lo que es muy probable que los pesos moleculares del ADN aislado (5x10 a la sexta potencia) tengan poco que ver con el tamaño de la molécula del ADN en vitro. El ADN fibroso aislado tiene un modelo de difracción de rayos X muy neto, indicio experimental directo de una estructura secundaria muy regular. Watson y Crick propusieron en 1953 una estructura secundaria del ADN, que dedujeron de éstos modelos de difracción de rayos X, y que estaban de acuerdo con las observaciones de Chargaff (4), mostrando que ciertos pares de base de ADN, se presentan en cantidades equimoleculares. Esta estructura de Watson y Crick está constituida por dos cadenas de ADN que se enrollan helicoidalmente en torno a un eje central común, originando una molécula de cadena doble y de unos 20 Amgstron de diámetro. Las cadenas de azúcar-fosfato están situadas en la parte externa de estas hélices orientadas con dirección de enrollamiento a la derecha; las bases púricas y pirimídicas se encuentran enlazadas por puentes de hidrógeno, en la parte interna de las citadas hélices, con los planos de sus anillos orientados perpendicularmente al eje central. Sólo se tolera el apareamiento de bases entre la adenina y la timina o uracilo, en el caso del RNA, y entre la guanina y citosina. Nucleoproteínas. Como se dijo anteriormente, los ácidos nucleicos se encuentran conjugados con proteínas. Las nucleoproteínas el ADN y ARN pueden degradarse en sus components y ser identificados por separados.

II. Objetivos

1. Estudiar los ácidos nucleicos: clasificación, diferencias estructurales y funcionales, localización y sus componentes. 2. Analizar la importancia de la homogenización de las levaduras, pruebas de Bial, Biuret y de identificación de fosfatos y bases nitrogenadas en el reconocimiento de los componentes que formas los ácidos nucleicos.

III. Procedimiento

1. Suspenda 15 grs de levadura en 125 ml de NaOH 0.04 M y homogenice con licuador por 5 minutos. Transfiera el contenido a un matraz Erlemeyer y caliente en un baño de María por 20 minutos. Luego debe centrifugar por 3 minutos y tomar el sobrenadante el cual llevará a un beaker (250ml) donde le agregarán gotas de ácido acético glacial hasta que el medio este ácido. 2. Tome la muestra y agregue 100mL de una solución de HCl/Etanol 95% (1:99). Proceda a centrifugar por 3 minutos. Tome precipitado y lave con Etanol 95%. Centrifugue nuevamente, tomando luego el precipitado.

- Tome una muestra del precipitado y haga la prueba de Biuret.

3. A cada tubo de ensayo con el precipitado restante de la muestra agregue 3mL de H2SO4 3N y lleve a baño de maría durante 3 minutos. Hecho esto realice las siguientes pruebas: A. Identificación de la Ribosa. Tome 4 tubos de ensayo y agregue lo siguiente en cada uno:

Tubo Sustrato Reactivo de Bial HCL concentrado 1 1 ml Agua destilada 1 ml 2.5 ml 2 1 ml de ribosa 1% 1 ml 2.5 ml 3 1 ml de ribosa 0.5% 1 ml 2.5 ml 4 1 ml del precipitado 1 ml 2.5 ml

Lleve al calor por 5 minutos o hasta que observe un cambio de color. El reactivo de Bial está compuesto por iones férricos, etanol y orcinol. Consiste en la formación de un producto de color azul-verdoso entre el furfural y el orcinol en medio clorhídrico. Es específico de pentosas. B. Identificación Base Nitrogenada. Agregue gotas de Hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio básico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una pequeña cantidad del precipitado obtenido que ha sido colocado en un tubo de ensayo. Observe. C. Identificación de Fosfatos. Agregue un poco del precipitado en un tubo de ensayo y añada Hidróxido de Amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio básico, acidifique con algunas gotas de HNO3 y agregue Molibdato de Amonio (1mL). Observe. LEER DE SU LIBRO DE TEXTO LA ESTRUCTURA Y FUNCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS