19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 240 78751© Int. Cl.7: C12C 3/08

C12C 3/10A61K 35/78

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 02758454 .986© Fecha de presentación : 09.08.200287© Número de publicación de la solicitud: 141493787© Fecha de publicación de la solicitud: 06.05.2004

54© Título: Extractos de lúpulo, procedimiento para su preparación y su utilización.

30© Prioridad: 10.08.2001 DE 101 39 479

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:16.10.2005

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:16.10.2005

73© Titular/es: Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. KG.Willmar-Schwabe-Strasse, 476227 Karlsruhe, DE

72© Inventor/es: Erdelmeier, Clemens yKoch, Egon

74© Agente: Lehmann Novo, María Isabel

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

S2

240

787

T3

Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

DESCRIPCIÓN

Extractos de lúpulo, procedimiento para su preparación y su utilización.

El presente invento se refiere extractos de lúpulo, al procedimiento para su preparación y a la utilización de extrac-tos de lúpulo para la profilaxis y la terapia de estados patológicos provocados por una deficiencia de estrógenos o pordisregulaciones del metabolismo de las hormonas sexuales, especialmente del metabolismo de los estrógenos.

La mayor importancia del lúpulo se encuentra, tanto ahora como antes, en su utilización en la producción decerveza. En virtud de sus sustancias amargas y aromáticas, es decisivo para el sabor de la cerveza. Además de esto,debido a sus propiedades antimicrobianas, estas sustancias tienen una cierta importancia en el caso de la conservaciónde la cerveza.

El material de reconocimiento en relación al lúpulo existente a los comienzos de los años ochenta condujo a unamonografía positiva por la Comisión E del entonces Ministerio de Sanidad del estado federal alemán (Banz. del 5.diciembre 1985 y, respectivamente 13. marzo 1990). Con ello, está fundamentalmente autorizada la utilización dellúpulo en el caso de trastornos del sueño, agitación y estados de ansiedad.

Y desde hace mucho tiempo el lúpulo posee un significado medicinal como sedante suave en la medicina popular.Responsables de este efecto son probablemente los ácidos α- y β-pícricos sensibles a la oxidación. A estas sustan-cias componentes se les atribuyó hace poco tiempo propiedades de captadores de radicales, así como propiedadesinhibidoras de la peroxidación lipídica. (M. Tagashita et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59, 740-742 (1995). En el do-cumento EP 0 677 289 A2 se describen, además, composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la osteoporosis,que contienen compuestos del grupo de los ácidos α-pícricos y los ácidos α-isopícricos.

En los últimos años, junto a los ácidos α- y β-pícricos (J. Hölzl, Zeitschrift für Phytotherapie 13, 155-161 (1992) seexaminaron también, de forma incrementada, los componentes fenólicos del lúpulo y, junto al xantohumol 1 conocidoya desde hace tiempo, se encontraron en la planta del lúpulo numerosos compuestos más del tipo de las flavonas (J.F. Stevens et al., Phytochemistry 44, 1575-1585 (1997), J. F. Stevens et al., J. Chromat. A 832 (1-2), 97-107 (1999)).Se trata en este caso, en primera línea, de flavonoides isoprenilados tales como, por ejemplo, 6- u 8-prenilnaringe-nina 2 y 3, así como isoxantohumol 4. Stevens et al., (Photochemistry 53, 759-775 (2000)) examinaron también laquimiotaxonomía de especies de lúpulo y taxa.

Una y otra vez se observó, que en el caso de las recolectoras de lúpulo, se presentaban perturbaciones de lamenstruación que se atribuyeron a sustancias estrógenas en el lúpulo, pero sin que estos efectos pudieran atribuirse demanera clara a uno o a varios componentes. Entre tanto, se pudo confirmar esta actividad estrógena del lúpulo. Así,

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

se demostró que la 8-prenilnaringenina 3 es esencialmente responsable de estos efectos (S. R. Milligan et al., J. Clin.Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252 (1999)). La actividad estrógena in vitro de este compuesto quedó demostrada en surelativa afinidad de unión a receptores de estrógenos y se ensayó, especialmente con ayuda de la estimulación de lafosfatasa alcalina en células Ishikawa -Var-I. Se comprobó en este caso, que la 8-prenilnaringenina era esencialmentemás activa que los fitoestrógenos conocidos hasta ahora, tales como cumestrol, genisteína o daidazeína, y sólo actuabade un modo un poco más débil que el 17β-estradiol. Milligan et al., (J. Endocrin. Metabol. 85, 4912-4915 (2000))informaron también sobre la unión de diferentes componentes fenólicos del lúpulo a un receptor humano de estrógenosexpresado a partir de células de levadura. En este caso, de nuevo la 8-prenilnaringenina mostraba la actividad estrógenamás fuerte. Propiedades estrógenas más débiles mostraban la 6-prenilnaringenina, 6,8-diprenilnaringenina y la 8-geranilnaringenina. Miyamoto et al., (Planta Med. 64, 516-519 (1988)) pudieron demostrar que la 8-prenilnaringeninanormalizaba el peso del útero y la densidad ósea en ratas ovariectomizadas. Además, en el documento JP 08 165238(ref. CA 125:158632) se describe la actividad estrógeno-agonística de una serie de derivados de flavona 8-prenilizados,entre ellos también la 8-prenilnaringenina.

En estudios más recientes se pudo demostrar que algunos flavonoides del lúpulo, especialmente el xantohumol1, pueden actuar sobre el metabolismo de las células. Están en condiciones de influir positivamente sobre reaccionesenzimáticas que juegan un importante papel en la formación de células tumorales. Con ello, estos compuestos sepueden considerar como agentes preventivos del cáncer (Tagung der deutschen Gesellschaft für Hopfenforschung,Stand der Kentnisse zum Hopfeninhaltsstoff Xanthohumol, (congreso de la sociedad alemana para la investigacióndel lúpulo, estado de conocimientos del componente del lúpulo xantohumol) 24. marzo 1998, Aschheim). Miranda etal., (Food Chem. Tox. 37(4), 271-285(1999)) informan sobre la fuerte actividad antiproliferativa del xantohumol 1 ydel iso-xantohumol 4 en células cancerígenas mamarias MCF-7 humanas, así como en líneas celulares de cáncer deintestino grueso HAT-29 y de ovario A-2780.

Además de esto, se pudo demostrar que el xantohumol 1 influye inhibiendo la osteoporosis. Su utilización comoagente terapéutico contra la osteoporosis se describe en el documento EP 0 679 396 B1. Aunque los inventores ha-blan a favor de las propiedades estrógenas del xantohumol, sin embargo éstas no se demuestran. Por el contrario, S.R. Milligan et al., (Pharm. Pharmacol. Lett. 7, 83-86 (1997)) llegaron a la conclusión unívoca de que la actividadinhibidora de la osteoporosis del xantohumol se basa en un efecto estrógeno, puesto que no pudieron determinar ac-tividades correspondientes ni en la línea celular humana, Ishikava, del carcinoma de endometrio ni en un ensayo delgen reportero de la levadura (S.R. Milligan et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 84, 2249-2252 (1999)). En contra deestas investigaciones, en el presente invento se demuestra que xantohumol 1 e isoxantohumol 4 se unen con actividadcomparable a los receptores de estrógenos alfa y beta.

Kumai y Okamoto (Toxicology Letters 21, 203-207 (1984)) informaron sobre fracciones de carbohidratos de ele-vado peso molecular a partir de extractos de lúpulo puramente acuosos, los cuales reducían el peso del ovario deratas jóvenes tratadas previamente con gonadotropina PMS. Okamoto y Kumai (Acta Endocrinologica 127, 371-377(1992)) confirmaron estos descubrimientos en virtud de la observación de niveles reducidos de LH en sangre y de 17β-estradiol, causados por la administración de extractos de lúpulo puramente acuosos.

En el documento DE 199 39 350 A1 se describe un extracto de lúpulo con un contenido incrementado en xantohu-mol. Este extracto debe añadirse a la cerveza así como a bebidas refrescantes que contienen jugo de frutas. Sobre lapresencia de naringeninas prenilizadas en este extracto no se sabe nada. Conforme al ejemplo de realización, el xanto-humol se extrae del lúpulo con etanol al 50% en peso. Pero esto no conduce a una extracción óptima del xantohumol,puesto que esto ocurre solamente con etanol de elevada concentración (>80%) en peso) con elevada recuperación enel extracto.

En el documento WO 83/00701 A1 se reivindica un procedimiento para la obtención de sustancias con actividadestrógena a partir de lúpulo, caracterizado porque primero se prepara un extracto en dióxido de carbono a partir delúpulo bajo la adición de agua como agente de arrastre y, a continuación, se obtienen las sustancias con actividad es-trógena mediante extracción con éter o mediante procedimientos cromatográficos. Además, se reivindica la utilizaciónde estas sustancias como aditivo para piensos, para agentes cosméticos o como aditivo para baños (sales de baño).Sobre la naturaleza de estas sustancias con actividad estrógena no se dan datos algunos.

En el documento WO 01/30961 A1 se reivindica un procedimiento para la obtención de aditivos estables para lafabricación de cerveza, caracterizado porque el residuo del orujo de lúpulo procedente de la extracción con dióxido decarbono, se extrae con un disolvente polar, preferentemente agua caliente, a continuación se acidifica el extracto, selava con un disolvente no polar, preferentemente hexano, y -eventualmente después del secado- se utiliza como aditivopara la fabricación de cerveza. El orujo restante se desecha.

El presente invento tiene como misión poner a disposición extractos vegetales que sean adecuados para la prepara-ción de medicamentos para la profilaxis y la terapia de estados patológicos, causados por una deficiencia de estrógenoso por disregulaciones del metabolismo de las hormonas sexuales, especialmente del metabolismo de los estrógenos.

Una misión más del invento es la puesta a disposición de un procedimiento para la preparación de estos extractos,así como de los preparados farmacéutico que los comprenden, los cuales son adecuados para el tratamiento de losestados patológicos anteriormente citados.

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

Estos cometidos se solucionan conforme al invento por el extracto de lúpulo conforme a las reivindicaciones 1 y 2,los procedimientos conforme a las reivindicaciones 3-12, el preparado farmacéutico conforme a la reivindicación 13,así como la utilización de los extractos o del preparado farmacéutico conforme a las reivindicaciones 14-16.

El presente invento se basa, entre otras cosas, en el sorprendente descubrimiento de que a partir de la droga dellúpulo, después de la separación de materiales de carga lipófilos e hidrófilos, se obtiene extractos que contienen, igualque antes, los ácidos pícricos del lúpulo de tipo floroglucinol, al mismo tiempo calconas y flavonas libres o ligadas,tales como xantohumol, isoxantohumol, así como 6- y 8-prenilnaringenina que, por el contrario, se obtienen en formaenriquecida. Especialmente sorprendente es el hecho de que el contenido en 6- y 8-prenilnaringenina depende de latemperatura de la extracción previa con agua (véase el Ejemplo 3) y que se puede aumentar aproximadamente por unfactor 2.

La Figura 1 representa la dependencia de la concentración de los componentes analizados, con la temperatura dela extracción previa con agua.

Un extracto de este tipo se puede obtener por extracción unitaria o múltiple con un alcano(C5-C7) o con CO2supercrítico (etapa de desengrasado), subsiguiente extracción del residuo de la droga con agua y, después, subsiguienteextracción del residuo de la droga con un disolvente de polaridad media, seleccionado del grupo constituido poralcoholes, alcoholes acuosos, cetonas, cetonas acuosas, ésteres y, eventualmente ulterior distribución líquido-líquido.Sorprendentemente, los ácidos pícricos del lúpulo no pasan completamente al extracto lipófilo, sino sólo en parte,mientras que por otro lado, en el caso de la extracción con agua, las calconas y flavonas permanecen casi totalmente enel residuo de la droga. Por ello, es posible obtener un extracto de lúpulo que contiene todas las sustancias componentesfarmacológicamente relevantes (ácidos pícricos, calconas, flavonas) en una proporción equilibrada. Debido a estacomposición favorable a base de varios principios activos terapéuticos, este extracto se puede administrar de formaideal en estados patológicos provocados por una deficiencia de estrógenos o por otras disregulaciones hormonales.

Los extractos de lúpulo conformes al invento son adecuados para la profilaxis y el tratamiento de dolencias quecorren paralelas con el climaterio o la postmenopausia en la mujer, que abarcan síntomas tales como, entre otros, sofo-cos, depresiones, estados de ansiedad, confusión mental, insomnio, así como serios problemas de salud dependientesde la postmenopausia tales como osteoporosis, enfermedades cardíacas y circulatorias, ataques cerebrovasculares, de-mencia y enfermedades tumorales. Otras enfermedades que se basan en una disregulación del metabolismo de lashormonas sexuales y que pueden ser tratadas con el extracto conforme al invento son, por ejemplo, amenorrea, ciclosanovulatorios, menometrorragia, dolencias premenstruales y depresiones post parto. Igualmente, estos extractos sepueden utilizar para el tratamiento de enfermedades dependientes de las hormonas sexuales en el caso del hombre,tales como, por ejemplo, la hiperplasia benigna de próstata o el carcinoma de próstata.

La sorprendente elevada actividad estrógena de los extractos de lúpulo conformes al invento se demostró tanto conun ensayo competitivo de unión al receptor para receptores humanos de estrógenos alfa y beta, como también en unensayo recombinante con levadura en comparación con la actividad del 17β-estradiol. En contraposición con esto, losextractos de lúpulo estándar convencionales muestran, a igual dosis, una actividad sensiblemente más débil o ningunaactividad.

La Figura 2 muestra la actividad de un extracto comparativo y de dos extractos de lúpulo conformes al invento enun ensayo del gen reportero de la levadura.

Conforme al invento, se prepara un extracto de lúpulo con un contenido incrementado, frente a extractos conven-cionales especialmente extractos acuoso-alcohólicos, en calconas y flavonas libres y/o ligadas, especialmente 6- y 8-prenilnaringenina, xantohumol e isohantohumol, el cual contiene, además, simultáneamente, ácidos α- y eventualmen-te β-pícricos (humulon y, respectivamente, lupulon y sus derivados).

Ulteriormente se pone a disposición conforme al invento un procedimiento para la preparación de estos extractosde lúpulo, que abarca las etapas:

(a) extracción unitaria o múltiple de una droga de lúpulo con un alcano(C5-C7) o CO2 supercrítico, y separacióndel residuo de la droga de la solución de extracción;

(b) extracción unitaria o múltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (a) con agua a una temperaturaen el intervalo de 60 a 95ºC, y separación del residuo de la droga;

(c) extracción unitaria o múltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (b) con un disolvente seleccio-nado del grupo constituido por 80-96% (p/p) de etanol, metanol, metanol acuoso, acetona, acetona acuosay acetato de etilo, así como filtración de la solución de extracción obtenida; y

(d) separación del disolvente de las soluciones de extracción reunidas, obtenidas en la etapa (c) y secado delresiduo obtenido.

La relación entre droga y disolvente se sitúa en cada etapa de extracción en el intervalo de aproximadamente 1 : 7hasta aproximadamente 1 : 12.

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

La extracción con un alcano (C5-C7) o con CO2 supercrítico en la etapa (a) se lleva a cabo una, dos o tres veces,especialmente tres veces.

La extracción con CO2 supercrítico es particularmente preferida.

El alcano (C5-C7) en la etapa (a) es preferentemente un n-alcano(C5-C7) del grupo constituido por n-pentano, n-hexano y n-heptano, siendo muy particularmente preferido n-heptano.

La extracción en la etapa (b) se lleva a cabo preferentemente a 90ºC, pudiendo ser de una a varias horas la duraciónde la extracción.

El disolvente en la etapa (c) se selecciona preferentemente del grupo constituido por 74 a 99% (p/p) de metanol,respectivamente 60 a 99% (p/p) de acetona y 92% (p/p) de etanol.

El extracto (seco) de lúpulo conforme al invento se caracteriza por un contenido en ácidos α-pícricos de al menos0,5%, preferentemente al menos 0,8% y, en especial al menos 1%, en xantohumol al menos 2%, preferentementeal menos 3% y en especial al menos 4%, y en flavonas prenilizadas de al menos 0,5%, preferentemente al menos0,7%. Las flavonas prenilizadas abarcan preferentemente 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol.El xantohumol en el sentido del presente invento no se cuenta entre las flavonas prenilizadas. Los datos porcentualesse refieren al peso del extracto seco de lúpulo.

Los extractos obtenidos se puede elaborar junto con habituales coadyuvantes farmacéuticos tolerables para darpreparados farmacéuticos tales como cápsulas, comprimidos peliculares y grageas. Como coadyuvantes farmacéuticosse utilizan los habituales agentes de relleno, aglomerantes, disgregantes y de revestimiento para tabletas peliculares ygrageas, así como aceites y grasas como masas de relleno para cápsulas de gelatina blanda.

Los extractos conformes al invento se pueden utilizar para la profilaxis y terapia de estados patológicos provo-cados por una deficiencia de estrógenos o por otras disregulaciones hormonales tales como dolencias del climaterio,enfermedades cancerígenas dependientes de las hormonas sexuales, hiperplasia benigna de próstata, osteoporosis, en-fermedad de Alzheimer y enfermedades cardiovasculares. En el caso de enfermedades cancerígenas dependientes delas hormonas sexuales, los extractos conformes al invento se pueden utilizar para la profilaxis y terapia de cáncer demama, cáncer de útero y cáncer de próstata.

La dosificación de los extractos conformes al invento se sitúa en el intervalo de 0,005 g a 2 g de extracto 1 a 4 vecesal día, preferentemente en el intervalo de 0,02 a 1 g 1 a 2 veces al día. La dosificación en el caso aislado depende delcuadro patológico y de las circunstancias individuales del paciente y puede ser adaptado por el facultativo que trata elcaso de forma correspondiente a las necesidades individuales.

Los ejemplos citados a continuación ilustran el invento y no deben ser considerados como limitativos. Todos losdatos porcentuales, en caso de que no se indique de otro modo, se refieren al peso.

Ejemplo comparativo 1

Preparación de un extracto en etanol al 96%, sin desengrasado previo

50 g de la droga de lúpulo (clase “Hallertauer Magnum”) se mezclaron con 500 g de etanol al 96% (p/p) y sefragmentaron con un aparato Ultraturrax. Se extrajo a 60ºC durante 1 h. A continuación, se filtró por un filtro Seitz1500. La droga se extrajo otras 2 veces más de la misma manera. Las soluciones de extracción reunidas se liberarondel etanol en el evaporador rotatorio y se secaron durante una noche en la estufa de secado al vacío a 50ºC. A partir dela masa seca se determina el contenido en sustancias componentes características por el método de HPLC siguiente.Este método HPLC se aplica también para la determinación de las sustancias componentes en los demás ejemplos.

Columna LiChrospher 100 5 µm. 250 x 4 mm

Eluyente A: 1000 ml de agua bidestilada/3 ml de ácido fosfórico (85%)/2 ml de trietilaminaB: 1000 ml de acetonitrilo / 3 ml de ácido fosfórico (85%) / 2 ml de trietilamina / 60 mlde agua bidestilada

Gradiente 40% de B sobre 70% B en 30 min;70% de B sobre 100% de B en 10 min

Flujo 1,2 ml/min

Detección Diodenarray

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

Rendimiento (extracto de etanol al 96% (p/p): 18,38 g => 36,8%

Contenido HPLC en ácidos α-pícricos del lúpulo: 19,8%Contenido HPLC en ácidos β-pícricos del lúpulo: 4,2%Contenido HPLC en xantohumol: 1,3%Contenido HPLC en 6- y 8-prenilnaringeninas,así como en isoxantohumol: inferior al límite de detección(<0,01%)

Ejemplo 1a

Preparación de un extracto de lúpulo (extracción con CO2 y, a continuación, extracción previa con agua a 90ºC)

Extracción en serie con CO2 supercrítico, agua y etanol al 92% (p/p):

80,6 g de una droga de lúpulo (clase “Hallertauer Magnum”), que antes se había extraído previamente con CO2supercrítico (condiciones: trituración a 10 mm de tamaño de grano, extracción con CO2 a 250 bar/50ºC, separacióndel extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 960 g de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despuésbajo agitación durante 1 h a 90ºC. A continuación, el extracto acuoso se separó por filtración por un Supra filtro 1500de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente húmedo, se extrajo después, en cada caso 2 veces, con 800 g de etanolal 92% (p/p) durante 1 hora a 60ºC en cada caso. Se separó después por un Supra filtro 1500 de Seitz y la solución deextracción se separó del etanol en el evaporador rotatorio con una temperatura del baño de agua de 55-65ºC, y se secóen la estufa de secado a 60ºC.

Rendimientos:

Residuo de la extracción con agua: 18,96 g (23,5%)

Residuo de la extracción con EtOH al 92% (p/p): 9,83 g (12,2%)

Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

Contenido en ácidos α-pícricos del lúpulo: 2%Contenido HPLC en ácidos β-pícricos del lúpulo: 0,5%Contenido HPLC en xantohumol: 5,83%Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina 0,63%Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina 0,21%Contenido en isoxantohumol 0,42%

Ejemplo 1b

Preparación de un extracto de lúpulo (extracción con CO2 y, a continuación, extracción previa con agua a 90ºC)

Extracción en serie con CO2 supercrítico, agua y etanol al 92% (p/p):

504,26 g de una droga de lúpulo (clase “Hallertauer Magnum”), que antes se había extraído previamente con CO2super-crítico (condiciones: trituración a 10 mm de tamaño de grano, extracción con CO2 a 250 bar/50ºC, separacióndel extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 6 kg de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despuésbajo agitación durante 1 h a 90ºC. A continuación, el extracto acuoso se separó por filtración por un Supra filtro 1500de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente húmedo, se extrajo después, en cada caso 2 veces, con 5 kg de etanolal 92% (p/p) durante 1 hora a 60ºC en cada caso. Se separó después por un Supra filtro 1500 de Seitz y la solución deextracción se separó del etanol en el evaporador rotatorio con una temperatura del baño de agua de 55-65ºC, y se secóen la estufa de secado a 60ºC.

Rendimientos:

Residuo de la extracción con agua: 105,9 g (21%)

Residuo de la extracción con EtOH al 92% (p/p): 63,37 g (13,8%)

Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

Contenido en ácidos α-pícricos del lúpulo: 1%Contenido HPLC en ácidos β-pícricos del lúpulo: 0,5%Contenido HPLC en xantohumol: 4,41%

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina 0,49%Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina 0,15%Contenido en isoxantohumol 0,6%

Ejemplo 2

Preparación de un extracto de lúpulo (extracción con CO2 y, a continuación, extracción previa con agua a 60ºC)

Extracción en serie con CO2 supercrítico, agua y etanol al 92% (p/p):

80,36 g de una droga de lúpulo (clase “Hallertauer Magnum”), que antes se había extraído previamente con CO2super-crítico (condiciones: trituración a 10 mm de tamaño de grano, extracción con CO2 a 250 bar/50ºC, separacióndel extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 964 g de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despuésbajo agitación durante 1 h a 60ºC. A continuación, el extracto acuoso se separó por filtración por un Supra filtro 1500de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente húmedo, se extrajo después, en cada caso 2 veces, con 800 g de etanolal 92% (p/p), primero durante 5 min en el Ultra-Turrax, después bajo agitación durante 1 hora en cada caso a 60ºC.Se separó después por un Supra filtro 1500 de Seitz y la solución de extracción se separó del etanol en el evaporadorrotatorio con una temperatura del baño de agua de 55-65ºC, y se secó en la estufa de secado a 60ºC.

Rendimientos:

Residuo de la extracción con agua: 17,91 g (22%)

Residuo de la extracción con EtOH al 92% (p/p): 9,95 g (12,4%)

Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

Contenido en ácidos α-pícricos del lúpulo: 1,58%Contenido HPLC en ácidos β-pícricos del lúpulo: 0%Contenido HPLC en xantohumol: 6,1%Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina 0,4%Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina 0,09%Contenido en isoxantohumol 0,21%

Ejemplo 3

Preparación de un extracto de lúpulo (extracción con n-heptano y, a continuación, con agua a 90ºC)

247,6 g de droga de lúpulo (clase “Hallertauer Magnum”), se extrajeron con 7 veces su peso de n-heptano, primero5 min en el Ultra-Turrax, después bajo agitación durante 1 h. Después de separar por filtración la solución de extraccióncon heptano por un Supra filtro 1500 de Seitz, se extrajo una segunda vez de igual manera. Después, el residuo de ladroga obtenido se liberó del heptano en la estufa de secado. El residuo seco de la droga (205 g) se mezcló acto seguidocon 12 veces su peso con agua y se mantuvo durante 1 hora a 90ºC. Después de volvió a separar por filtración y elresiduo de la droga, aun ligeramente húmedo, se extrajo dos veces bajo agitación a 60ºC con 10 veces su cantidad enpeso de etanol al 92% (p/p). Se filtró por un filtro Supra 1500 de Seitz y la solución de extracción se liberó del etanolen el evaporador rotatorio a una temperatura del baño de agua de 55-65ºC, y se secó a 60ºC en la estufa de secado.

Rendimientos:

Extracto de heptano: 26,4 g (10,7%)

Extracto con agua: 41,1 g /16,6%)

Extracto con etanol al 92% (p/p): 52,0 g (21,0%)

Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

ácidos alfa- pícricos: 0,86%ácidos beta-pícricos: 0,05%xantohumol: 3,3%6-prenilnaringenina: 0,45%8-prenilnaringenina: 0,13%isoxantohumol: 0,25%

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

Ejemplo 4

Dependencia del contenido en 6-prenil-, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol con la temperatura de la extracciónprevia con agua

Extracción: aproximadamente 80 g de una droga de lúpulo extraída previamente con CO2 se extrajeron con 12veces su peso de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, después, bajo agitación, 1 hora a 60, 70, 80, 90 y 95ºC. Acontinuación, el extracto de agua se separó por filtración por un filtro Supra 1500 de Seitz. El residuo de la droga, aunligeramente húmedo, se extrajo dos veces con 800 g de etanol al 92% (p/p) primero durante 5 min en el Ultra-Turrax,después bajo agitación 1 hora a 60ºC en cada caso. Se filtró después por un filtro Supra 1500 de Seitz y la solución deextracción se liberó del etanol en el evaporador rotatorio a una temperatura del baño de agua de 55-65ºC, y se secó a60ºC en la estufa de secado.

Los resultados representados gráficamente en la Figura 1 muestran una dependencia clara de la concentración delas sustancias componentes prenilizadas, analizadas, con la temperatura de la extracción previa con agua.

Ejemplo 5

Examen de los extractos de lúpulo en cuanto a actividad estrógena

Para el examen de las sustancias componentes individuales de un extracto comparativo y de un extracto conformeal invento en cuanto a interacciones con el receptor de estrógenos humano alfa (ER-α) y respectivamente beta (ER-β),se llevó a cabo un ensayo competitivo de ligamiento al receptor. En este caso se liga primeramente estradiol marcadoradiactivamente al receptor humano de estrógenos y, a continuación, se trata con la sustancia de ensayo a analizar. Sesuprime en este caso la parte de estradiol marcado, correspondiente a la potencia estrógena de la muestra. El estradiolen exceso se separa por lavado después de la unión del complejo a hidroxilapatita. Los receptores de estrógenos ER-αy ER-β se adquirieron comercialmente como receptores humanos recombinantes. Las tandas de ensayo se componíanen cada caso de 1000 µl de tampón TEDG (Tris 10mM, EDTA 1,5 mM, 10% de glicerol, pH 7,5), 5 µl de receptor (200nM), 10 µl de estradiol 3H y 10 µl de etanol(valor de control), 10 µl de dietilestilestrol (100 mM, control positivo) o10 µl de extracto o, respectivamente, sustancia componente del extracto. Las tandas se mezclan cuidadosamente y seincuban en la oscuridad durante aproximadamente 16 horas a la temperatura ambiente. Después de la incubación seañaden 250 µl de hidroxilapatita (HAP), para adsorber las proteínas. Durante una fase de incubación de 15 minutos semezclan las tandas a mano cada cinco minutos. El precipitado se separa rigurosamente a 10.000 rpm durante algunossegundos y el residuo se separa con pipeta. El gránulo (pellet) se lava, en cada caso, tres veces con 1000 µl de tampónTEDG y para la medición se mezcla con 1000 µl de etanol, se forma una suspensión y se traslada a un vial paracentelleo. Tras la adición de 9 ml de líquido de centelleo (Ready Safe, Beckmann) tiene lugar una medición sobre todala ventana 3H en un contador-beta Beckmann.

La caracterización de las capacidades de ligamiento de las sustancias de ensayo tiene lugar a través de la deter-minación de los valores DE50 a partir de las curvas de dosis-actividad de la supresión de estradiol. Los resultados serecogen en la Tabla 1 y demuestran para todas las sustancias componentes ensayadas potentes interacciones con losdos receptores de estrógenos. De manera sorprendente, el extracto conforme al invento resultó ser esencialmente másfuertemente activo que lo que cabría esperar de las actividades de cada uno de los componentes. En contraposición conesto, el extracto comparativo mostró una actividad en los dos receptores que se situaba al menos en 10 veces menos aldel extracto conforme al invento.

TABLA 1

Ligamiento de sustancias componentes de un extracto conforme al invento y de un extracto comparativo al receptor-alfa de estrógenos (ER-α) y, respectivamente, receptor-beta de estrógenos (ER-β), humanos

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

El examen de extractos en cuanto a propiedades estrógenas se efectuó, además, con un ensayo del gen reportero(Reporter-gen-Assay) utilizando células de levadura (Sacharomyces). Las células son estables con el receptor á deestrógenos humano y un plásmido de expresión, el cual contiene un elemento de respuesta al estrógeno y transfecta elgen de la enzima β-galactosidasa. Todas las muestras se disolvieron en una concentración de 20 mg/ml en DMSO y seañadieron sin diluir o después de diluidas con DMSO en relaciones 1/10, 1/100 o 1/1000 en un volumen de 1 µl para100 µl de medio de cultivo en placas de fondo plano para microtitulación de 96 pocillos. A continuación se añadieron100 µl de suspensión de levadura y el sustrato cromogénico rojo de clorofenol-β-D-galactopiranosida. En cada placa seprepararon para el control pocillos en los que sólo se había vertido medio de cultivo o, respectivamente de disolvente,o las que contenían las concentraciones estándar de 1β-estradiol. Las células de levadura se incubaron durante 72 h a32ºC y, después, se midió la absorción del medio a 540 nm en un fotómetro para placas de microtitulación. En parte,las muestras se examinaron, dos veces.

Resultados

Muestra Actividad

Extracto de etanol al 96% (p/p) conforme al ejemplo comparativo inactivo

Extracto de etanol al 92% (p/p) conforme al Ejemplo 1a activo

Extracto de etanol al 92% (p/p) conforme al ejemplo 2 activo

Los resultados del ensayo se representan en la Figura 2. Como “activos” se caracterizan en este caso aquellosextractos cuya actividad en comparación con la curva estándar del 17β-estradiol se situaba de forma significativa porencima de los valores Background (corresponde aproximadamente al 10% de la estimulación máxima).

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 240 787 T3

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtención de un extracto de lúpulo, que abarca las etapas:

(a) extracción unitaria o múltiple de una droga de lúpulo con un alcano(C5-C7) o CO2 supercrítico, y separacióndel residuo de la droga de la solución de extracción;

(b) extracción unitaria o múltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (a) con agua a una temperaturaen el intervalo de 60 a 95ºC, y separación del residuo de la droga;

(c) extracción unitaria o múltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (b) con un disolvente seleccio-nado del grupo constituido por 80-96% (p/p) de etanol, metanol, metanol acuoso, acetona, acetona acuosay acetato de etilo, así como filtración de la solución de extracción obtenida; y

(d) separación del disolvente de las soluciones de extracción reunidas, obtenidas en la etapa (c) y secado delresiduo obtenido.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) se extrae una, dos o tres veces.

3. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el disolvente en la etapa (a) se seleccionadel grupo constituido por n-pentano, n-hexano y n-heptano.

4. Procedimiento conforme a la reivindicación 3, en donde el disolvente en la etapa (a) es n-heptano.

5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la extracción en la etapa (b) tiene lugaraproximadamente a 90ºC.

6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el disolvente en la etapa (c) se seleccionadel grupo constituido por etanol al 92% (p/p), metanol al 74-99% (p/p) y acetona al 60-99% (p/p).

7. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en donde el disolvente en la etapa (a) es n-heptano y, el disolventeen la etapa (c) es etanol al 92% (p/p).

8. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en donde el disolvente en la etapa (a) es CO2 supercrítico, y eldisolvente en la etapa (c) es etanol al 92% (p/p).

9. Extracto de lúpulo obtenible según el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadopor un contenido en ácidos α-pícricos de al menos 0,5%, en xantohumol de al menos 2% y en flavonas prenilizadas,seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,5%.

10. Extracto de lúpulo según la reivindicación 9, caracterizado por un contenido en ácidos α-pícricos de al menos0,8%, en xantohumol de al menos 3% y en flavonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringe-nina, 8-prenil-naringenina e isoxantohumol, de al menos 0,7%.

11. Preparado farmacéutico que abarca un extracto de lúpulo caracterizado por un contenido en ácidos α-pícricosde al menos 0,5%, en xantohumol de al menos 2% y en flavonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,5%, y los habituales coadyuvantes farmacéu-ticos tolerables.

12. Preparado farmacéutico según la reivindicación 11, que abarca un extracto de lúpulo caracterizado por uncontenido en ácidos α-pícricos de al menos 0,8%, en xantohumol de al menos 3% y en flavonas prenilizadas, selec-cionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,7%.

13. Utilización de un extracto de lúpulo tal como se define en la reivindicación 9 o 10, o de un preparado farma-céutico según la reivindicación 11 0 12 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y terapia de estadospatológicos provocados por una deficiencia de estrógenos o por una disregulación del metabolismo de las hormonassexuales, especialmente del metabolismo de los estrógenos, seleccionados del grupo constituido por molestias clima-téricas, hiperplasia benigna de próstata, osteoporosis, enfermedad de Alzheimer y enfermedades cardio-circulatorias.

14. Utilización de un extracto de lúpulo tal como se define en la reivindicación 9 o 10, o de un preparado farma-céutico según la reivindicación 11 o 12 para la preparación de un medicamento para la profilaxis de enfermedadescancerígenas dependientes de las hormonas sexuales.

15. Utilización según la reivindicación 14, seleccionándose las enfermedades cancerígenas dependientes de lashormonas sexuales del grupo de cáncer de mama, cáncer de próstata y cáncer de útero.

10

ES 2 240 787 T3

11

ES 2 240 787 T3

12