2007 Desarrollo Profesional. Transformación de pGLO ™ y Purificación de la Proteína GFP (Green...
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2007 Desarrollo Profesional
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Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein)
Instructores
Essy Levy, M.S.Coordinadora de Programas de Hughes Scholars
UCSD, San Diego CA
Julie MathernBioEducation Product ManagerBio-Rad Laboratories, Hercules CA
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¿Para que enseñar la transformación genética?
• Una herramienta poderosa para el aprendizaje
• Parte de los estándares nacionales curriculares
• Varias extensiones de practicas de laboratorio
• Conexiones con el mundo real
• Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria
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Dogma Central de la Biología Molecular
ADN ARN Proteína Característica
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Conexiones con el mundo real
• GFP es un marcador visual
• Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas)
• Localización y regulación de la expresión de un gen
• Movimiento celular
• El destino celular durante el desarrollo
• Formación de los diferentes órganos
• Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos
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Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™
Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad
• Basado en los estándares curriculares
• Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento
• Compatible con un periodo de clase de 50 minutos
• Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo)
• Costo económico
• Resultados exitosos en las manos de los estudiantes
• Seguro para uso en el aula
• ¡Resultados tangibles!
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Procedimiento Transformación
Day 1
Day 2
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Horario para el Taller de GFP
• Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína
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Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™
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¿Que es una transformación?
Absorción deADN exógeno;frecuentemente un plásmido circular
GFP
Lactamasa beta
Resistencia a la
Ampicilina
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¿Que es un plásmido? Un pedazo circular deADN que se replica autónomamente
Evolucionado originalmente enbacterias
Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede
ser modificado paraexpresar una proteína de interés
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Las diferentes caras de un plásmido
Micrografía de transmisión de electrones
Gel de agarosaRepresentación Grafica
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Plásmido pGLO
• Lactamasa Beta -Resistencia a la
ampicilina
• La proteína GFP (Green Fluorescent Protein)– Aequorea victoria
gen de medusa
• araC: Regulador Regula la trascripción de GFP
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Transformación con pGLO
Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
Cromosoma Bacteriano (ADN)
Pared celular
GFP
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ADN Bacteriano
Plásmido de ADN
Célula de Bacteria
ADN Geonómico
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Regulación de Trascripción
•Operón de lactosa
•Operón de Arabinosa
•Plásmidos de pGLO
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Regulación de Trascripción
B A DaraC
B A DaraC
ARN Polimerasa
Efector (Arabinosa)
araC B A D
Operón ara
ARN Polimerasa
Z Y A
Z Y ALacI
Efector (Lactosa)
Z Y ALacI
Operón lac
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Regulación de la expresión del gen
ARN Polimerasa
araC
Operón GFP
Gen de GFP
araC Gen de GFP
araC Gen de GFP
Efector (Arabinosa)
B A DaraC
B A DaraC
ARN Polimerasa
Efector (Arabinosa)
araC B A D
Operón ara
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Métodos de Transformación
• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente
competentes absorben el ADN después del choque térmico
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Proceso de Transformacion
• Suspender las colonias en la Solución de Transformación
• Añadir el plásmido pGLO ADN
• Incubar los tubos en hielo ice
• Choque térmico a 42°C y colocar en hielo
• Incubar con caldo nutriente LB
• Extienda la suspensión por la superficie de las placas
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¿Porque es importante cada paso de la transformación?
1. La solución de transformación = CaCI2
La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN
Ca++
Ca++
OCH2
O
P O
O
OBase
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
OCa++
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¿Porque es importante cada paso de la transformación?
2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular
3. Choque térmico -incrementa la
permeabilidad de la membrana celular
4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta
Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)
Pared Celular
GFP
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¿Que es el caldo nutriente de LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés
– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– Sales– Vitaminas
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¿Crecer? ¿Brillar?
Siga el protocolo
¿En que placas crecerán colonias?
¿Que colonias brillarán?
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Medida de Volumen