INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Proceso por el cual se restringe el movimiento de los enzimas, dando lugar a una forma de los mismos insoluble en agua.Dichos enzimas deben mantener su actividad catalítica.

En estos sistemas, los mecanismos difusionales cobran gran importancia(transporte de reactivo-substrato y productos).

Ventajas

Inconvenientes

Permite uso en continuo del enzima. El proceso de inmovilización puede afectar a la actividad del enzima.

Simplifica las etapas de purificación del producto.

Permite reutilización del enzima en reactores discontinuos.

Procesos limitados por factores difusionales.

Mayor concentración del enzima. Aumento de la complejidad del sistema.

Mayor rendimiento.

Mayores caudales de entrada/salida para el mismo tamaño de reactor.

Mayor estabilidad del enzima. Resistencia a la desnaturalización.

Reduce el riesgo de contaminaciones accidentales del proceso.

Adecuado para conversiones sencillas, una sola etapa.

Conversiones de varias etapas: preferible el uso de células enteras.

Menores costes de operación.

Mayor control sobre la reacción. Permite mayor automatización del proceso.

ENZIMASAGENTE

PORTADOR

Propiedades bioquímicas

Característica s químicas

Cinética y mecanismo

Propiedades mecánicas

Método de inmovilización

Transferencia de materia

Estabilidad

“Performance”

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

• ADSORCIÓN

• ENLACE COVALENTE

• ENLACES CRUZADOS

• ATRAPAMIENTO

• MEMBRANAS

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ADSORCIÓN

• Para enzimas y células enteras.

• El más antiguo y sencillo (adsorción de β-D-fructofuranosidasa en Al(OH)3, Nelson y Griffin, 1916)

• Etapas:

o Contacto: solución acuosa de enzimas-adsorbenteo tads

o lavado

• Interacciones:

o Tipo iónicoo Puentes hidrógenoo Van der Waals

• Proceso muy suave:o La actividad del enzima se conservao Proceso reversible en función de las condiciones (Tª, pH…)o Estricto control de las condiciones de adsorción.

• Técnicas de inmovilización por adsorción:

o Adsorción estáticao Electrodeposicióno Proceso en reactoro Baño con agitación

• Gran variedad de soportes para la adsorción (orgánicos/inorgánicos).

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ENLACE COVALENTE

• Adecuado para enzimas.

• Formación de enlaces covalentes entre enzima y soporte. Mucho más fuertes que el caso anterior.

• Variedad de soportes:o Naturales: celulosa, dextrano…o Sintéticos: polímeros (poliacrilamida, poliestireno…)o Vidrio, materiales cerámicos

• La unión covalente debe afectar a grupos funcionales del enzima que no intervengan en el proceso catalítico.

• Etapas previas:o Activación del soporte (creación de grupos funcionales adecuados

para su unión con los del enzima): activación por bromuro de cianógeno, carbodiimida, complejos de diazonio…

o Vidrio y cerámica (inorgánicos): recubrimiento superficial con grupos funcionales orgánicos adecuados.

• Puede haber pérdida de actividad debida a:o Participación del centro activo del enzima en el enlace covalenteo Impedimentos estéricos

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ENLACES CRUZADOS

• Formación de agregados tridimensionales entrecruzados, insolubles en disolución acuosa. Se prescinde del soporte.

• Enlace (bi-multi)covalente entre enzimas y reactivos bi-multifuncionales(comerciales y baratos).

• Fácil preparación

• Alta especificidad (condiciones óptimas varían según cada caso), ensayos prueba-error en laboratorio.

INCLUSIÓN O ATRAPAMIENTO

• Mayoritariamente para células. Poco usado para enzimas (baja retención).

• Inclusión del enzima en una matriz tridimensional, quedando atrapado.• La matriz se forma en presencia del enzima.• Se debe permitir la difusión de substrato/productos.• Uso de polímeros sintéticos o geles de origen natural.

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

MEMBRANAS

• Retención del encima en un espacio limitado por una membrana semipermeable.

o Microencapsulacióno Membranas preformadas

a) Microencapsulación

• Partículas esféricas de pequeño tamaño.

• El enzima queda incluido en suspensión dentro de las esferas.

• Ventaja: se consigue una suspensión en medio líquido (buena difusión)

• Procedimiento:o Formación de emulsión en disolución acuosa (líquido

orgánico[monómero] + enzima)o Polimerización de la emulsión

• Puede hacerse también para fibras poliméricas.

b) Membranas preformadas

• Membrana impermeable a las enzimas y permeable a substrato/producto.

• Fibras huecas: Reactor cilíndrico con enzimas retenidos en membranas.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

MÉTODO VENTAJAS INCONVENIENTES

ADSORCIÓN

Los centros activos permaneceninalterados.

Posible desorción de enzimaspor cambios en pH, temperatura…

No se requieren reactivos y las etapas de activación sonsencillas

Métodos no específicos para cada reacción/enzima

Método sencillo y económico.

ENLACE COVALENTE

Estabilidad del enzima. No se desliga.

Método caro y complicado.

Método muy flexible, según se elija el agente portador y métodode enlace.

La actividad puede reducirse si los reactivos usados son tóxicospara el enzima.Los centros activos puedenmodificarse/dañarse durante el proceso.

ENTRECRUZAMIENTO

Enzima muy estable,fuertemente enlazado.

Puede dañar los centros activos.

Puede usarse en combinacióncon la adsorción para prevenir pérdida de catalizador.

Puede haber problemasdifusionales que limiten el rendimiento.Pérdida de enzima durantepreparación.

MEMBRANAS

Simplicidad. Problemas difusionales debidos ala membrana.

Posibilidad de uso simultáneo de varios enzimas.

Posible inactivación de enzimas, sometidos a fuerzas de cizallaelevadas.

Uso de membranas selectivas:control de sustratos/productos en mezclas.

Mal funcionamiento a bajas concentraciones de sustrato(adsorción de éste en la membrana)

Protección del enzima ante inhibición, envenenamiento…

Estricto control del tiempo de residencia para sustratos de bajopeso molecular.

No hay pérdidas.Adecuado para sustratos de altopeso molecular, buen contacto enzima-sustrato: altas conversiones.

ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

CARACTERÍSTICAS ADSORCIÓN ENL.COVALENTE

ENTRECRUZA-MIENTO

MEMBRANAS

PREPARACIÓN Simple Difícil Intermedia Difícil

FUERZA DE UNIÓN Débil Fuerte Fuerte Intermedia

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Intermedia Alta Baja Baja

REGENERACIÓN DELSOPORTE

Posible Rara Imposible Imposible

COSTE Baja Alta Intermedia Intermedia

ESTABILIDAD Baja Alta Alta Alta

APLICABILIDAD Si No No Si

PROTECCIÓN FRENTE AATAQUE MICROBIANO

No No Posible Si