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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGA E INGENIERIA ECBTI CENTRO COMUNITARIO DE ATENCION VIRTUAL CCAV EJE CAFETERO DOSQUEBRDAS - RISARALDA GUIA DE PRCTICAS DEL CURSO DE BIOQUIMICA

Sandra Patricia Gutirrez Patio Tut or: E-mail del Curso: [email protected] Direccin de Blog: http://sapagupa.blogspot.com PRCTICA NO. 1: FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEM ILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD Objetivos Realizar la extraccin

fraccionada de los componentes protenicos de las semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de solubilidades de los diferentes tipos de protenas. Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de Biuret.

1 Fundamento terico 1.1 Solubilidad y precipitacin de las protenas La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza lnica, el pH y la concentracin de solventes orgnicos. A bajas concentraciones salinas del solvente, las protenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a los iones simples, es decir cumplen la teora de Debye-Huckel, o sea en esta regin de concentraciones de sal, el aumento de sta estabiliza los grupos cargados sobre la protena y por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacin por salado: saltlng-In). El fenmeno contrario (precipitacin por salado: saltlng-out) que se observa a altas fuerzas inicas, es probablemente el resultado de la competencia entre la protena y los iones de la al por las molculas de agua del medio para solvatarse. Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas, la concentracin efectiva de las molculas de agua (solvente) disminuye y son insuficientes para la solvatacin total de la protena, por lo tanto la interaccin protena-protena predomina sobre la interaccin protena-agua y ocurre la precipitacin. En esta regin la solubilidad de la protena est a menudo relacionada en una forma logartmica con la fuerza lnica y se rige por la ecuacin: log S = - Ks. donde: S = Solubilidad = log. de la solubilidad hipottica a fuerza lnica (ji) igual a cero. Ks = Constante de precipitacin por salado, que varia considerablemente con la naturaleza de la sal y muy poco con la naturaleza de la protena. La solubilidad de la mayora de las protenas a una fuerza inica constante, presenta un mnimo cerca del punto isoelctrico. A este pH, las repulsiones electrostticas intermoleculares entre las molculas de soluto estn en su mnimo, lo mismo qu e las interacciones electrostticas entre los grupos polares cargados y el agua, por lo tanto las protenas precipitan ms fcilmente. La mayora de los solventes orgnicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dielctrica. El dimetilsulfxido y la formamida, con constantes dielctricas relativamente

altas, son buenos solventes.

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1.2 Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad La clasificacin comnmente usada no se basa en aspectos estructurales de stas sino principalmente en su solubilidad frente a diferentes solventes. Desafortunadamente entre los grupos clasificados no existe un lmite fijo, pero de todas maneras permite el fraccionamiento de las protenas provenientes de una misma fuente. Segn Osborne, las protenas vegetales pueden clasificarse segn su so lubilidad en: albminas, globulinas y glutelinas. Las albminas corresponden al grupo de protenas qu e son solubles en agua destilada y en soluciones salinas diluidas. Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas. Con base en las propiedades de solubilidad no es posible distinguir entre albminas y seudoglobulina s. Si se aplican los conceptos de precipitacin por salado, se observa que las globulinas precipitan en soluciones de sulfato de amonio del 50% de saturacin, mientras que las albminas lo hacen a concentraciones mayores del 75% de saturacin. Estas precipitaciones son mejores si se hacen a pHs cercanos a sus puntos isoelctricos. Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en soluciones acuosas de alcoholes de bajo peso molecular, en concentraciones entre el 50 y el 90%. Las glutelinas son insolubles en los solventes anteriores pero se solubilizan en soluciones diluidas de cido o bases. Estos dos ltimos grupos solo se encuentran en mate riales vegetales, mientras que las protenas animales estn constituidas bsicamente por albmin as y globulinas. 1.2.1 Mtodo Biuret La reaccin de Biuret es una medida del nmero de enlaces peptdicos presentes. Los compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos entre el los pptidos y protenas dan un color rosado o lila caracterstico cuando se tratan con sulfato de cobre diluido en solucin alcalina. El color se debe al complejo de coordinacin que se forma entre el tomo de cobre y cuatro tomos de nitrgeno provenientes de enlaces peptdicos (dos de cada pptido). La estructura del complejo es la siguiente:

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Los espectros de absorcin de los complejos de cobre formados con diferentes protenas, son similares aunque no idnticos. Por consiguiente, es posible utilizar cualquier protena como patrn de coloracin. Esta es bastante reproducible, para una protena dada, aunque se requiere de cantidades relativamente grandes de protena (de 1 a 20 mg por mI) para obtener coloracin. Por otra parte, no es necesaria una digestin previa de la muestra. 2 Reactivos H2O desmineralizada, NaCI al 1%, Etanol al 75%, NaOH 0.1 N, reactivo Biuret, solucin patrn de albmina de huevo de concentracin conocida. 3 Procedimiento Recordar que el tratamiento de la harina, con cada uno de los siguientes solventes, extrae la fraccin indicada as:

Solvente Extractor Agua desmineralizada Cloruro de sodio al 1% Etanol al 75% Hidrxido de sodio 0.1 N3.1 Preparacin de la muestra

Fraccin Extrada Albminas Globulinas Prolaminas Glutelinas

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso ser una de la s harinas de: arveja, soya, frjol, haba, trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H 2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y centrifugar la suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H 2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior. Despus de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona al baln que contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H 2O desmineralizada hasta el enrase. As se tiene separada la fraccin de las albminas.

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Proceso de Extraccin

Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora todo el proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Despus de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extraccin con NaCl al 1%, se llevan a otro baln aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fraccin de las globulinas. Sobre el residuo anterior se extrae en idntica forma la fraccin de las prolaminas, usando esta vez alcohol etlico al 75% y una temperatura de extraccin cercana a 60C. Por ltimo sobre el mismo residuo, con la adicin de solucin de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiento general, se separa la fraccin de las glutelinas.

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3.2 Mtodo de Biuret Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo proceder a la determinacin de protenas, aplicando el mtodo deBiuret. La curva de calibracin se har utilizando como patrn una solucin de albmina de huevo de concentracin conocida. Para las muestras de soya, arveja y frjol, de las fracciones de albminas y glutelinas deber tomarse para cada una y por aparte, una alicuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua desmineralizada para las albminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como extract os problemas para dichas fracciones. En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican en el siguiente cuadro. Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos en un bao de agua a 30C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usando el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia. 4 Clculos y resultados Consultar tablas de conversin para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondientes valores de absorbancia o calclelos utilizando la f rmula: A = 2 - log (%T) Trazar en papel milimetrado la grfica de calibraci n (absorbancia en ordenadas vs. concentracin (mg/mI) en abcisas) e interpolar las absorbancias de los tubos problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada caso, a calcular los porcentajes de cada fraccin protenica.

Condicione s B 1 patr Sol. n albumina, ml Fraccin albuminas, ml Fraccin globulinas, ml Fraccin prolaminas, ml Fraccin glutelinas, ml 0.1 2 0. 3 3 0.5 4 0. 7 5 0. 9 6 1.2

Tubos 7 0. 5 8 1.0 9 0. 5 10 1. 0 11 12 13 14

1. 0

0.5

1. 0

0.5

H2 1. 1. 1. O 2 1.9 7 1.5 3 1 destilada, ml Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml

0.8

1. 5

1.0

1. 5

1. 0

1.5

1. 0

1.5

1. 0

Debern compararse los valores obtenidos con los qu e se hallen en la literatura consultada.

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Calcular tambin los rendimientos de las extracciones, los cuales se deducen de la comparacin con los porcentajes de protena total, obtenidos por micro Kjeldahl, en la siguiente prctica (No.6). Cuestionario

1.2 .

Qu se entiende por pl de una protena? Explique por qu las protenas precipitan en este punto. Discuta un mtodo colorimtrico alternativo para la determinacin de protenas indicando en que se fundamenta. Cmo se clasifican las protenas de origen animal de acuerdo con su solubilidad? Qu ventajas en panificacin ofrece el hecho de que una harina de leguminosa tenga mayor o menor contenido de glutelinas y de prolaminas?

3. 4.

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGA E INGENIERIA ECBTI CENTRO COMUNITARIO DE ATENCION VIRTUAL CCAV EJE CAFETERO DOSQUEBRDAS - RISARALDA PRCTICA NO. 2: DETERMINACIN DE VITAMINA C EN FRUT AS Y VERDURAS

Objetivo Determinar el contenido de esta vitamina en frutas y verduras utilizando el mtodo de Moor.

1 Fundamento terico Las vitaminas son factores dietarios esenciales requeridos por los organismos en pequea cantidad y cuya deficiencia produce ciertas enfermedades. Hay organismos que pueden sintetizar algunas de ellas, por lo tanto el tipo y cantidad de vitaminas que necesitan los diferentes seres vivos no es igual para todos. La vitamina C es esencial para la formacin del tejido conjuntivo, huesos, cartlagos, dentina y tambin para el mantenimiento de la funcin normal de dichos tejidos. Adems la vitamina C estimula las funciones de defensa del organismo (actividad fagocitaria de los leucocitos, formacin de anticuerpos). Como el cido ascrbico se oxida fcilmente a cido dehidroascrbico y ste puede volver a reducirse a cido ascrbico, se ha propuesto que la vitamina C, como sistema de xido-reduccin, partcipe en procesos de oxidacin celular, interviniendo en la hidroxilacin de hormonas esteroidales (principalmente, las sintetizadas en las suprarrenales y aminocidos aromticos). Se ha relacionado la inhibicin de la formacin desustancia intercelular de los tejidos de sostn por carencia de vitamina C, con los trastornos de la hidroxilacin de la prolina en hidroxiprolina, constituyente fundamental del colgeno. La forma oxidada, cido dehidroascrbico, puede ser reducida nuevamente por el glutatin en forma reducida (GSH).

Por tratamiento con la 2-nitroanilina diazotada, el cido ascrbico la convierte en la 2nitrofenilhidrazida del cido oxlico, la cual en p resencia de un exceso de hidrxido de sodio forma la sal sdica de coloracin rojo-violeta que presenta un mximo de absorcin a 540 mm.

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Para el anlisis de la vitamina C total (cido asc rbico + cido dehidroascrbico) es necesario reducir primero el cido dehidroascrbico; esto se logra tratando la muestra con cido sulfhdrico ya que este no presenta interferencia con el mtodo. 2 Reactivos 2-nitroanilina 0.16% en actico HCI Nitrito de sodio 0,08% en H2O Etanol 96% Acido oxlico 0.15% Solucin de vitamina C, recin preparada (0.2 mg/mI) 3 Procedimiento Cada grupo traer una fruta y una verdura de acuerd o con lo convenido previamente con el profesor. Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso de las frutas ctricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de cido oxlico al 0,15%, se mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer la determinacin colorimtrica. Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible con 4 ml de solucin de cido oxlico al 0,15%. Despus de filt rar completar el filtrado con la solucin de oxlico hasta un volumen final de 5 ml. De ah toma r 1 ml de cada extracto problema para tubos D 1 (fruta) y D2 (verdura). Si la extraccin se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar 30 ml de cido oxlico al 0.15%.

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Si el extracto exhibe coloracin se recomienda adicionar una pequea cantidad de carbn activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se agita y luego se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solucin patrn de cido ascrbico contiene 0.2 mg/ml y debe estar recientemente preparada. El nitrito de sodio tambin debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro anilina se diazotice bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se decolora la solucin. Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:

Tubos Condiciones B 0. 1 0. 1 3.8 1. 0 1 0. 1 0. 1 3. 8 0. 1 0. 9 1. 2 3. 8 2 0. 1 0. 1 3. 8 0 . 2 0. 8 1. 2 3. 8 3 0. 1 0. 1 3. 8 0 . 4 0. 6 1. 2 3. 8 4 0. 1 0. 1 3. 8 0.6 0.4 1. 2 3. 8 5 0. 1 0. 1 3. 8 0.8 0.2 1. 2 3. 8 6 0. 1 0. 1 3. 8 1.0 1. 2 3. 8 Fr uta D1

Verdur a D2 0.1 0.1 3.8 1.0

2-nitroanilina, ml Nitrito de sodio, ml Mezclar y esperar la decoloracin Etanol 96%, ml Patrn vitamina C, ml cido oxlico, ml

0. 1 0. 1 3. 8 1. 0 1. 2 3. 8

Extracto problema, ml Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos NaOH 10%, ml Agua destilada, ml 1.2 3.8

1.2 3.8

Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotmetro las absorbancias correspondientes a una longitud de onda de 540 nm. Elabore la curva de calibracin e interpole las absorbancias de sus muestras. 4 Expresin de resultados De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y verdura correspondiente, expresndolo como mg/100 g de frut a o verdura o como mg/100 ml de jugo. Finalmente compararlo con el valor reportado en la bibliografa. Cuestionario

1. 2.

Compare el mtodo que utiliz con otro mtodo de determinacin de la misma vitamina. Qu ocurrira si no se decolora por completo la solucin de 2-nitroanilina al adicionar nitrito de

sodio?

3. 4. 5. 6.

Cul es la funcin del hidrxido de sodio en la determinacin de la vitamina C? Cmo se afectara la determinacin si la muestra ha sido tratada previamente con calor? Cmo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales? Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubrculos) ricos en vitamina C.