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TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XIX, No. 2, 1999 91

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PARA PRODUCCIÓNDE VITAMINA B12

Romildo M. Sampaio, Ranulfo M. Alegre

Departamento de Engenharia de Alimentos - FEA - UNICAMP, Brasil

La fermentación de vitamina B12 puede ser considerada un proceso industrial relativamente bien

establecido, pero aún necesita ser mejorado. De esta forma, la elaboración de este trabajo fue motivada

por la posibilidad de estudiar las condiciones óptimas de la fermentación de vitamina B12. Se presentan

además, los resultados referentes a la evaluación y optimización de las variables experimentales y la

obtención de parámetros cinéticos de la fermentación. Se estudiaron siete microorganismos, tres

composiciones de medios de cultivo y dos tipos de substratos. Los resultados mostraron quePseudomonas

P3 y Propionibacteri um jensenii tuvieron los mayores rendimientos de vitamina B12 (3,86 y 2,93 µ g

B12/mL respectivamente) utilizando sacarosa como substrato.

Palabras claves: vitamina B12, fermentación,Propionibacterium , Pseudomonas.

The key step in the great majority of studies of the B12 production is the selection of the microorganisms

producers and a better understanding of the fermentation. In order to improve the vitamin B12

production, the purpose of this study was to investigate the influence of the different microorganisms

producers and culture media in the vitamin production. The results showed that the higher yields - 3,86

and 2,93µ g B12/mL- were achieved withPseudomonas P3 and Propioni bacteri um jenseni i cultivated

using sucrose with main carbon source.

Key words: vitamin B12, fermentation,Propionibacterium , Pseudomonas .

IntroducciónLas vitaminas son substancias orgánicas ex-

tremadamente necesarias para muchas formas de

vida. Gran parte de los microorganismos vivos no

pueden sintetizarlas y deben, de esta forma, obte-

nerlas de fuentes externas.

La vitamina B12 fue descubierta como resul-

tado de investigaciones sobre anemia

megaloblástica. Su aislamiento se dio en 1948,

pero su síntesis química completa sólo fue obte-

nida en 1973. Sin embargo, debido al gran núme-ro de etapas involucradas, el procedimiento no

alcanzó interés industrial. Actualmente, la vita-

mina B12 es producida exclusivamente por vía

fermentativa. Según Spallaet al . /1/, debido a sus

implicaciones en reacciones químicas importan-

tes, la vitamina B12 originó gran interés y útiles

aplicaciones en la salud, tanto de personas como

de animales.

La producción mundial de vitamina B12 varía

de 5 a 10 toneladas/año, con un precio medio de

$ 5 000/kg (USD) /2/. Brasil se ha tornado a un

tradicional importador, con compras anuales del

orden de cinco millones de dólares (Trade Pointde Campinas, São Paulo, 1997).

La vitamina B12 pertenece a un grupo de

moléculas grandes y complejas, denominadas

cobalto-corrinoides. Todos los cobalto-

corrinoides cuyo ligante axial inferior de molécu-

la es el 5,6 dimetilbenzimidazol son conocidos

como cobalaminas. De la misma forma, si el

ligante axial superior está constituido por un

radical ciano, se obtiene la cianocobalamina o la

verdadera vitamina B12. /3/

A medida que la investigación de la vitamina

B12 evolucionó, se tornó claro que la mejor

fuente productora es representada por los micro-

organismos. Actualmente, ella es sintetizada por

una gran variedad de bacterias, destacándose los

géneros Pseudomonas, Propionibacterium y

Corynebacterium. /1/

De acuerdo con Quesada-Chanto et al . /4/,

Cummin y Johnson /5/ y Keuth y Bisping /6/, la

uti-lización de Pseudomonas y Propionibacterium

se ha justificado, debido al hecho de que esas

bacterias y sus mutantes presentan ventajas, tales

como el aumento intracelular del contenido de

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TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XIX, No. 2, 199992

vitamina, alta productividad y un rápido creci-

miento.

El objetivo de este trabajo es estudiar las condi-ciones óptimas de producción de vitamina B12.

Para esto, fue efectuado un "screening" con bacte-

rias del gênero Propionibacterium y Pseudomonas,

así como una selección de la mejor fuente de substrato

y de la mejor composición del medio de cultivo.

Materiales y métodos

Microorganismo

Se realizó un "screening" con cuatro líneas de bacterias, descritas en la literatura como buenas

productoras de vitamina B12: Propionibacterium

freudenreichii ATCC 9614, Propionibacterium

jenseniiDSM 20274, Propionibacterium shermanii

ATCC 6207 y Pseudomonas sp. ATCC 13867. Los

tres primeros cultivos fueron conservados en medio

líquido a 4 °C, mientras que la Pseudomonas sp. fue

mantenida en un tubo inclinado, con 1,5 % de agar

a 4 °C.

Obtención de los mutantes

La bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a

un tratamiento químico, usando concentraciones

crecientes de 5,6 dimetilbenzimidazol (5,6 DMI),

con el propósito de obtener mutantes que mostra-

sen mayores rendimientos de vitamina B12. Se-

gún Garofano y Merli (apud. por Spalla et al . /1/

), como solamente aquellos microorganismos que

sintetizan vitamina B12 pueden metabolizar

5,6 DMI, es posible obtener mutantes de Pseudomonas sp. resistentes a altas concentra-

ciones del mismo.

Se hicieron experimentos usando concentra-

ciones de 5,6 DMI variando desde 25 mg/L hasta

1 g/L. En cada experimento fueron observados

cambios en relación con la morfología, creci-

miento del microorganismo y la producción de

vitamina B12. Los mutantes obtenidos fueron

aislados en placas de Petri y mantenidos en tubos

de ensayo conteniendo el medio de cultivo apro-

piado y agar.

Substrato

Se evaluaron dos azúcares como principales

fuentes de carbono: sacarosa y lactosa. La sacaro-

sa provino de un azúcar comercial que contenía

99,8 % de pureza, mientras que la lactosa fue

obtenida a partir de la ultrafiltración del suero de

queso en polvo reconstituido. El filtrado obteni-

do fue diluido a fin de obtenerse las concentracio-

nes deseadas de lactosa. La ultrafiltración del

suero de queso se efectuó en una unidad del tipo

"Alfa-Laval-UFS 1", con una membrana "cut-

off" de 10 000 Daltons.

Medios de cultivo

Se evaluaron tres composiciones de medios de

cultivo, descritos como eficientes para el creci-

miento de Propionibacterias y Pseudomonas. Cada

medio fue evaluado usando sacarosa y lactosa como

substrato. En esta etapa del trabajo, para el desarro-

llo de los experimentos se utilizó un diseño factorial

completo. Los medios de cultivo empleados fueron

los siguientes:

Medio 1: Descrito por Florent /3/, usado para losexperimentos con Pseudomonas sp. y

sus mutantes. La composición en (g/L)

fue: substrato=100; extracto de

l e v a d u r a = 2 ; ( N H4)

2H P O

4= 5 ;

MgSO4.7H

2O=3; MnSO

4.H

2O=0,2;

CoCl2.6H

2O=0,02; ZnSO

4.7H

2O=0,02;

Na2MoO

4.2H

2O=0,005; Betaína=10; 5,6

DMI=0,025; pH 7,4; T=29 °C, agitación

300 r/min aireación 1 VVM.

Medio 2: Descrito por Quesada-Chantoet al . /

7/, usado para las fermentaciones con

Propionibacterias. La compo- sición en

(g/L) fue: substrato=90, extracto de le-

vadura=10; KH2PO

4=2;

MgSO4.7H

2O=0,2; CoCl

2.6H

2O=0,02;

FeSO4.7H

2O=0,005; (NH

4)

2HPO

4=4;

MnSO4.H

2O=0,005; CaCl

2.2H

2O=0,02;

5,6 DMI=0,025; pH 6,8; T=29 °C, agita-

ción 300 r/min, aireación 0,5 VVM.

Medio 3: Descrito por Florent y Nine /8/, usado

para Propionibacterias. Su composición

en (g/L) fue: substrato=100;

milosina=40; CoCl2.6H2O=0,02; 5,6

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DMI=0,025; pH 7,0; T=29 °C, agitación

300 r/min, aireación 0,5 VVM.

Fermentación

Las fermentaciones fueron conducidas en fras-

cos agitados (erlenmeyers de 1 000 mL), los cuales

fueron adaptados para que se hiciera un control de

la aireación y del pH. En los experimentos que

envolvieron Propionibacterias, que son

microaerofílicas, los frascos fueron llenados con

800 mL del medio de cultivo, y las fermentaciones

fueron conducidas bajo condiciones anaeróbicas en

las primeras 64 h y aeróbicas en las 64 h siguientes.Este procedimiento fue descrito por Pérez-Mendoza

y García-Hernandez /9/. Cuando el microorganis-

mo utilizado fue la Pseudomonas (aeróbica), el

erlenmeyer contenía un volumen de 500 mL, con

aireación y agitación eficientes, durante 120 h de

fermentación.

Análisis

La concentración celular se determinó al final

de la fermentación por densidad óptica. Dosalícuotas de igual volumen fueron extraídas del

medio de fermentación, centrifugadas y lavadas.

Posteriormente, una alícuota fue secada, mien-

tras que la otra fue sometida a diluciones conoci-

das, a fin de relacionar la concentración celular

(g/L) vs absorbancia (610 nm). Ese procedimien-

to siguió la metodología descrita por Quesada-

Chanto et al /7/.

La determinación de la vitamina B12 a partir

del caldo de fermentación fue hecha por el méto-

do químico descrito por Rudkin y Taylor /10/ y

Fisher 11/, siguiendo la metodología de extrac-

ción descrita por Marwaha et al . /12/ y Quesada-

Chanto et al . /7/, basada en la complexación y

conversión de la cobalamina en cianocobalamina,

en presencia de NaCN. Después de la extracción,

la solución final tuvo su absorbancia leída a

582 nm, contra una solución patrón de

cianocobalamina de 100 mg/mL.

Cianocobalamina de la Sigma fue usada como

patrón. Los resultados de la determinación de la

vitamina B12 por el método químico fueron pe-

riódicamente comparados con un método micro-

biológico descrito por AOAC /13/, basado en el

crecimiento de un microorganismo evaluado -

Lactobacillus leishmanii ATCC 7830.

Resultados y discusión

Obtención de los mutantes dePseudomonas sp

Conforme fue descrito en el epígrafe ítem 2.2.,

la bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a un

tratamiento químico, con concentraciones cre-

cientes de 5,6 DMI, con vistas a la obtención de

mutantes que produjeran mayores rendimientos

de vitamina B12. Según Spalla et al . /1/ como el5,6 DMI es un nucleótido importante en la

biosíntesis de la vitamina B12, y solamente aque-

llos microorganismos productores de la misma

son capaces de metabolizarla, es posible obtener

mutantes de microorganismos que necesiten del

nucleótido, pero no están aptos para sintetizarlos,

como es el caso de las Pseudomonas. Todos los

mutantes aislados fueron evaluados con los dos

tipos de substratos.

Utilizando concentraciones de 5,6 DMI va-

riando desde 25,0 mg/L hasta 1,0 g/L, fueronaislados tres mutantes, nombrados como

Pseudomonas P1 , Pseudomonas P2 y

Pseudomonas P3, que mostraron características

morfológicas diferentes en relación con la cultu-

ra original. Los tres mutantes fueron obtenidos

cuando la concentración de 5,6 DMI alcanzó el

valor de 800 mg/L, mientras que para la concen-

tración de 1,0 g/L no hubo crecimiento de los

mismos. Los tres mutantes aislados mostraron

mejorías significativas cuando los comparamos

con el cultivo original. Los parámetros observa-

dos: rendimiento de vitamina B12, concentración

celular y consumo de substrato fueron mayores

según puede ser observado en la tabla 1.

Además, de acuerdo con la tabla 1, se observa

que entre los mutantes el P3 presentó los mejores

rendimientos, siendo la producción de vitamina

B12, en relación con el cultivo original, aproxi-

madamente 5 veces mayor cuando se utilizó saca-

rosa como substrato y 1,5 veces mayor cuando la

lactosa fue utilizada. También hubo una mayor

eficiencia en el consumo del substrato, permi-

tiendo mayores rendimientos celulares. Quesada-

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Cultivo Medio/Substrato B12

(µg/mL)

Conc. celular

(g/L)

Consumo substrato

(%) P. jensenii 2 – Sacarosa 2,93 4,78 16,8

P. freudenreichii 2 – Sacarosa 1,78 1,08 3,0

P. shermanii 2 – Sacarosa 0,83 0,56 1,3

P. jensenii 2 – Lactosa 2,02 1,72 25,5

P. freudenreichii 2 – Lactosa 2,08 4,51 36,3

P. shermanii 2 – Lactosa 1,43 2,39 16,9

P. jensenii 3 – Lactosa 1,72 1,30 14,5

P. freudenreichii 3 – Lactosa 2,14 5,57 33,6

P. shermanii 3 – Lactosa 1,38 2,43 10,2

P. jensenii 3 – Sacarosa 1,98 1,84 10,2

P. freudenreichii 3 – Sacarosa 1,29 1,60 3,8

P. shermanii 3 – Sacarosa 0,97 0,79 2,1

Cultivo Substrato B12

(µg/mL)

Conc. celular

(g/L)

Consumo substrato

(%)

Pseudomonas Sacarosa 0,68 2,40 20,1

Mutante P1 Sacarosa 2,50 3,30 58,7



Pseudomonas Lactosa No Detectable 1,80 9,2

Mutante P1 Lactosa No Detectable 1,93 9,5

Mutante P2 Lactosa 0,95 1,70 10,3

Mutante P3 Lactosa 1,40 1,49 19,2

Chanto et al . /7/, también obtuvo mejores resul-

tados cuando utilizó sacarosa como substrato

para la producción de vitamina B12.

Selección de los microorganismos

De acuerdo con los resultados descritos en el

epígrafe 3.1, los experimentos para la obtención de

los mutantes permitieron seleccionar el microorga-

nismo Pseudomonas P3 y la sacarosa como substrato,

para las etapas posteriores del trabajo: análisis y

optimización de las variables experimentales y laobtención de los parámetros cinéticos.

Además de la Pseudomonas sp., tres bacterias

más, - Propionibacterium freudenreichii, P.

jensenii y P. shermanii, fueron empleadas para la

etapa de "screening". Cada una de ellas se evaluó

usando dos composiciones de medio de cultivo

(medio 2 y medio 3) y dos substratos (sacarosa y

lactosa). La tabla 2 presenta los resultados obte-

nidos para las fermentaciones. Como se observa,

los mejores rendimientos fueron obtenidos por el

Propionibacterium jensenii , alcanzando un máxi-

mo de 2,93 µg B12/mL de medio. Para esta

corrida, el consumo de sacarosa fue de 16,8 % y

la producción celular de 4,78 g/L. El medio de

composición 2 y la sacarosa propiciaron los me-

jores rendimientos cuando se utilizó el Propionibacterium jensenii. Tal comportamien-

to no se repitió para el Propionibacterium

freudenreichii y el P. shermanii, donde la lactosa

y el medio 3 promovieron los mejores rendimien-

tos de vitamina B12.

Tabla 2

Valores del rendimiento de vitamina B12, concentración celular (X) y consumo de substrato, para

Propionibacterium freudenreichii , P. jensenii y P.shermanii

Tabla 1

Valores del rendimiento de la vitamina B12, concentración celular y consumo de substrato, para

Pseudomonas sp. y sus mutantes

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Cultivo Medio/Substrato YX/S

(g/g)B12/X

(mg B12/g cél.)

Pseudomonas P3 1 – Sacarosa 0,07 0,64

Prop. jensenii 2 – Sacarosa 0,28 0,68

Prop. Freudenreichii 3 – Lactosa 0,17 0,38

Prop. shermanii 2 – Lactosa 0,14 0,60

De acuerdo con la tabla 3, para los mayores

rendimientos de vitamina B12 obtenidos con cada

microorganismo, los valores del rendimiento celu-

lar, YX/S

(0,07 a 0,25) no fueron elevados. Quesada-

Chanto et al . (1997) obtuvieron valores de YX/S dehasta 0,7; sin embargo, según ellos, cuando se

utilizan bajas tasas de aireación se favorece la

producción intracelular de vitamina B12, disminu-

yendo la concentración celular, y consecuentemen-

te, el valor del rendimiento celular. Por otro lado,

los valores obtenidos para el rendimiento B12/X

(tabla 3), se situaron en el rango descrito en la

literatura por algunos autores, que consiguieron

valores de 0,4 a 1,12 mg B12/g célula seca para B12/

X (Quesada-Chantoet al . /4/, Marwahaet al . /12/ y

Bainotti et al . /14/).

Conclusiones

Los resultados obtenidos nos permiten afirmar

que de las siete líneas de bacterias estudiadas, la

Pseudomonas P3 y el Propionibacterium jensenii

mostraron los mayores rendimientos en términos de

vitamina B12. De la misma forma, la sacarosa

pareció ser la fuente de substrato más indicada para

la continuidad de los trabajos, permitiendo la obten-

ción de mejores rendimientos de B12, concentra-

ción celular y consumo de substrato, en compara-ción con aquéllos donde se utilizó la lactosa como

fuente de substrato. En relación con los medios de

cultivo, los más indicados fueron los de composi-

ción 1 y 2 para PseudomonasP3 y Propionibacterium

jensenii, respectivamente.

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Tabla 3

Valores de YX/S

y B12/X para los mejores rendimientos de cada microorganismo

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Batch Culture", en J. Ferment. Bioeng., vol.

LXXX1, núm. 4, 1996, págs. 324-328.

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