14

Identificación por PCR

De los cultivos analizados con cebadores específicos de Fibrobacler succinogenes,

la cepa de referencia GC5 y 3 aislamientos nativos mostraron la amplificación de

fragmentos de tamaño teórico esperado mientras que las cepas de referencia de

Ruminococcus usadas como control negativo, no presentaron amplificación (figura

4).

Figura 4. Amplificados especificas de ADNr de Fibrobacter succinogenes. MP, marcador de peso molecular; 1 cepa de referecia F. succinogenes GC5; 2 aislado nativo (6); 3, aislado nativo (L6); 4, aislado nativo (3) ; 5 Cepa de referencia R. albus (AlCC 27210); 6, cepa de referencia R. f1avefaciens (AlCC 19208); 7 Control (H 20) .

Los perfiles térmicos diseñados para R. albus y R. f1avefaciens permitieron la

amplificación específica de los fragmentos de 1.195 y 258 pb, en las respectivas

cepas de referencia (fig . 5). En el grupo analizado con los cebadores específicos de

R. albus no se observó amplificación en ninguno de los aislados nativos de esta

especie, excepto en la cepa de referencia; mientras que el análisis del mismo grupo

con cebadores específicos de R. flavefaciens, mostró amplificación específica de un

aislado nativo y la cepa de referencia R93-68, A TIC 19208 (figura 6, carril 15). Las

demás no presentaron amplificación con ninguno de los cebadores analizados.

15

Figura 5. Amplificación especie específica de ADNr en las cepas de referencia Ruminococcus albus, ATCC 27210 (Carriles 1-5) y Ruminococcus flavefaciens , ATCC 19208 (carriles 7,8,10,11). Carril 5: control negativo (con agua) .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 .

Figura 6. Amplificación específica de ADNr de R. flavefaciens en aislamientos nativos. Carril 1: Marcador de peso molecular, carril 2: Cepa de referencia Ruminococcus flavefaciens ATCC 19208, carril 3: Cepa de referencia Ruminococcus albus ATCC 27210 y carriles 4-18: Cepas nativas 8,19, AR205, 14, 16,20,10, 18, 17,13, 11 , 9,12,15,22, respectivamente.

16

Durante la determinación de las condiciones de amplificación por PCR se encontró

que a temperaturas por debajo de 60°C, la cepa de referencia Ruminococcus albus

amplifica con el cebador específico para Ruminococcus f1avefaciens (RF1). El

análisis de restricción teórico reveló que este segmento es blanco de la enzima de

restricción Hpa I en el amplicón de R. albus pero está ausente en el amplicón de R.

flavefaciens (Anexo1).

17

Identificación por análisis de secuencias.

Se obtuvieron secuencias editadas en un rango de 1396 a 1550 nucleótidos en

longitud, correspondiente a la secuencia de ADNr 16S, los cuales se utilizaron en el

análisis Blast. Para la construcción del árbol filogenético se utilizaron secuencias

editadas de 1396 nucleótidos de longitud . El análisis Blast mostró que las

secuencias de los aislamientos nativos presentaron similitudes entre el 98 -100%

entre 855 a 1430 posiciones.

Los aislados previamente identificados con cebadores específicos como Fibrobacter

succinogenes y Ruminococcus flavefaciens mostraron una similitud del 98% con

secuencias de la base de datos de estas especies (878/893 y 911/928,

respectivamente) . Los otros aislamientos que no amplificaron con los cebadores

específicos presentaron similitudes con las especies Butyrivibrio fibrisolvens (99%),

Clostridium algidixylanolyticum (99%), Streptococcus bovis (96% , 98-100%) Y

Clostridium putrefaciens (91%, 99%) .

En las dos últimas especies se encontraron secuencias con porcentajes de similitud

96% y 91%, respectivamente (aislamientos 17 y 4), los cuales están por debajo al

punto de corte propuesto por Drancourt et al, 2000, debido a que las secuencias con

las cuales había una mayor similitud correspondían a especies no identificadas.

Las otras nueve secuencias, las cuales no fueron analizadas previamente por PCR

específico de especie, mostraron similitudes con R. albus (99%), Bacteroides sp ,

(98%, 100%), Clostridium algidixylanolyticum (99%, 99%), Streptococcus bovis

(99%, 100%, 99%), R. flavefaciens (99%) y Clostridium putrefaciens (99%) .

El dendograma NJ utilizando la distancia Kimura de 2 parámetros generó 11 grupos.

El primero agrupa un aislamiento nativo con secuencias publicadas de Butyrivibrio

fibrisolvens, el segundo agrupa aislamientos nativos con secuencias de Clostridium

algidixylanolyticum, el tercero agrupa un aislamiento nativo con el género

18

Clostridium, el cuarto agrupa tres aislamientos nativos con R. flavefaciens, el quinto

dos aislamientos nativos con C. putrefaciens, el sexto, seis aislamientos nativos con

S. bovis, el séptimo un aislamiento nativo con F. succinogenes, del octavo al

décimo, secuencias de especies utilizadas como grupos extemos y undécimo,

agrupa dos aislamientos nativos con el género Bacteroides. Estos agrupamientos

presentaron valores bootstrap de 100.

19

Figura 1. Dendograma Neighbor-joining de secuencias de ADN ribosomal 165 en bacterias anaerobias ruminales de ganado criollo BON. En la parte superior de la rama se indican los valores bootstrap y en la parte inferior la distancia Kimura 2 parámetros.

88

0 .00 100

0.03

54

0 .00

100

100 0 .03

0 .04

004

100

0 .08

95

0 .02 58

0.01 100

0 .03 I 100

0 .04 100 I

0 .02

0.01 100

0 .09 79

0.02 0 .00 93

0 .00

100 I 0 .13 I

0.09

0 .12

0 .02

100 0.07

0 .09 100

0.06 66

0 .00

991 0 .00

0 .00 1

0 .00

99 0 .00

0 .00 0 .00

002

60 0 .01

0 .00 0 .00

731 0 .01

0 .00 1 0.00

0 .02

100 0 .00

67 0 .00

0 .00 0 .00

0 .00

0.00

0.00

95 0.01

0 .00 0 .00

0 .01

0 .01

94 0 .01

0 .01 0 .00

100 0.00

0 .00

0 .01

76 0 .01

0.00 0.00

0.01

99 0 .00

0.01 0.01

96 0.08

0 .09

0.01

0.00

84 0 .00

0 .00 0.00

22F

24 F

7F

C /ostridium U201

C/ostridium a/gidiJ<ylano/yficum AF09.

C/ostridium sp. HAAP-2

1F

Butyrivibrio CF316

Butyrivibrio fibriso/vens OB 189

Butyrivibrio fibriso/vens

Butyrivibrio fibriso/vens

4F

C/ostridium sp. sukashi-2

C /ostridíum putrefaciens

C/ostridíum putrefacíens AF127024

C /ostndium putrefacíens DSM129

5F

2F

21 F

Rummococcus flevefacíens JM 1

9F

Rumínococcus a/bus Ra 8- A TCC 27

16 F

Rumínococcus a/bus RUMRGOAG

17 F

26F

11 F

Streplococcus bovis B315

23F

Streplococcus bovis 1

20F

18 F

Fíbrobacter succinogenes A TCC191,

6F

Fíbrobacter succinogenes HM2-2

Agrobacterium tumefaciens

Wo/inella succinogenes

Mixococcus xanthus

Bdellovibrio sto/pii

Bacteroides AR 29

8F

Bacteroides sp. 1

25F

Bacteroides sp. 2

-- - -=--p-' ~..;... ......--..

20

DISCUSiÓN

En el presente trabajo se utilizaron como cebadores, sondas oligonucleotídicas

especie específicas previamente publicadas (Odenyo et al 1994, Briesacher et al

1992 y Aman, et al, 1990), para la identificación molecular por PCR de cultivos

bacterianos nativos del rumen de ganado criollo BON. Las amplificaciones especie

específicas permitieron la identificación de las respectivas cepas de referencia, tres

aislados nativos de F. succinogenes y uno de R. flavefaciens, lo cual fue

corroborado mediante análisis de secuencias de la región ADNr 16S.

En este trabajo no se utilizaron protocolos de extracción que emplearan partículas

de zirconio o de vidrio para lograr la ruptura de la pared celular; por tal razón el

tiempo de incubación de los cultivos a partir de los cuales se extraería el ADN, es

una variable crítica considerando el comportamiento variable de la composición de

la pared de especie tales como F. succinogenes. En efecto, los mejores resultados

se obtuvieron de células con menos de 48 horas de cultivo aun cuando había mayor

cantidad de células a las 72 y 96 horas de cultivo. Estos datos son congruentes con

el comportamiento Gram variable descrito para todos los aislamientos analizados,

los cuales muestran un aumento de la proporcion de celulas Gram positivas, a

medida que los cultivos tienen mas tiempo de incubación.

Durante el proceso de estandarización de la PCR específica de F. succinogenes, se

encontró que cantidades por encima de los 700ng/l-ll generan bandas inespecíficas

en los amplificados, debido al exceso de molde. En el caso de la PCR específica de

R. flavefaciens, se encontró que a temperaturas menores a 60°C, los cebadores

RF1 y Universal, amplificaron inespecíficamente la cepa de referencia de R. albus,

generando un fragmento de 258 pb, de tamaño similar al esperado para R.

flavefaciens. Por esta razón, no es aconsejable utilizar con estos cebadores,

temperaturas inferiores a las reportadas en el presente trabajo. Sin embargo, el

análisis teórico de restricción de estos fragmentos reveló que el fragmento

amplificado para R. albus presenta una diana de corte para la enzima Hpal mientras

que el de la otra especie no, lo cual puede ser utilizado para la identificación de

I 21

1'0...0 l'I ...C'(l~~E.~~~~\' ''' ~"'T' ''' 'rf Cf\<:

BiBU O .­P V'PTO. DE ., r, ," ,

r.r " EH ­r '1"-UOTL,-A -­

estas dos especies de Ruminococcus utilizando los mismos cebadores y evaluando

la presencia o ausencia de corte con la enzima Hpa 1.

El uso de sondas previamente reportadas como cebadores forward y una sonda

universal como cebador reverso, permitió la identificación específica de F

succinogenes, R albus y R flavefaciens utilizando perfiles térmicos similares Estos

resultados en conjunto con la posibilidad de discriminar amplicones especie­

específicos con la enzima Hpal, sugieren la posibilidad de desarrollar PCR multiplex

para identificar en un solo tubo de reacción la presencia de las tres principales

especies bacterianas con solo 2 cebadores específicos y un cebador universal, lo

cual agilizaría los análisis.

En relación con la secuenciación, no se encontraron datos ambiguos en las

secuencias de ADNr 16S característicos de cultivos mixtos, debido a que la

extracción de ADN se realizó a partir de cultivos puros. Tampoco se encontraron

picos dobles en los electroferogramas que evidenciaran la presencia de operones

quiméricos dentro de los mismos aislados.

En el presente trabajo se encontraron porcentajes de similitud en longitudes de

secuencia menores a los propuestos por Drancourt et al., 2000 para la identificación

de géneros (97% de similitud) y especies (99%) entre secuencias de por lo menos

1500 nucleótidos de longitud. Con base en esta propuesta, es claro que el análisis

Blast como criterio único, no permitiría hacer una identificación inequívoca de los

aislamientos nativos; sin embargo, permitió elegir las secuencias de especies

bacterianas con las cuales analizar las relaciones filogenéticas.

Este punto es importante si se tiene en cuenta que en este estudio, se encontraron

varios aislamientos cuya identidad genética es compatible con las especies

Clostridium putrefaciens y Clostridium algidixylanolyticum, dos especies que no han

sido previamente reportadas en el ambiente ruminal, sino en carnes en

22

descomposición (Borda et al., 2000). La presencia de estas dos especies en las

muestras bacterianas nativas, podría ser el producto de una contaminación de la

sonda utilizada para extraer el contenido ruminal a través de la fístula infectada del

animal.

Otra posibilidad es que ambas especies presentes en la herida del animal, puedan

sobrevivir en el contenido ruminal gracias a sus habilidades para degradar celobiosa

y habitar ambientes anaeróbicos. Ambas posibilidades están apoyadas por el hecho

de que estos microorganismos crecieron en medios de cultivo anaeróbicos

suplementados con celobiosa y utilizados para el aislamiento de microorganismos

ruminales. Sin embargo, la presencia de estas bacterias en el líquido ruminal de ese

animal o en los cultivos de aislamiento debe ser corroborada con métodos de

hibridación o PCR.

A diferencia de las variaciones en la longitud de las secuencias comparadas

mediante Blast, en el análisis filogenético se incluyeron solo las secuencias

similares que tenían una longitud de 1396 nUcleótidos, lo cual garantiza establecer

comparaciones entre fragmentos de igual longitud. De otro lado, la confiabilidad de

los agrupamientos está apoyada por el uso de la distancia genética de Kimura de 2

parámetros, la cual puede considerar diferentes tasas de transversiones y

transiciones; el método de agrupamiento, el cual permite considerar las diferentes

tasas evolutivas entre los taxones analizados y los altos valores bootstrap

encontrados (100 en todos los casos).

El análisis conjunto de la similitud genética y agrupamiento, confirmó la identidad de

los aislados previamente identificados por PCR específico como F. succinogenes y

R. flavefaciens y apoya la idea de que la falta de amplificación de en los otros

aislados no se debe a cambios en los sitios de anclajes de los cebadores sino a la

ubicación taxonómica de las especies bacterianas analizadas, cuyas identidades

son compatibles con las especies Butyrivibrio fibrisolvens (hemicelulolítica),

Streptococcus Bovis (aprovechadora de ácidos intermedios), especies celulolíticas o

23

amilolíticas de los géneros Bacteroides y Clostridium y finalmente las especies

Clostridium putrefaciens, Clostridium algidixylanolyticum presentes en carnes en

descomposición.

Todas las especies encontradas tienen la habilidad de degradar celobiosa a pesar

de que no todas estén clasificadas en los mismos grupos tróficos principales. La

muestra analizada mostró diversidad de especies celulolíticas pero bajo número de

aislamientos por especie, en contraste con lo observado con la bacteria

aprovechadora de ácidos intermedios S. bovis la cual presentó el mayor número de

aislamientos/especie. Estos resultados están sesgados por la selección de los

aislamientos basada en criterios macroscópicos y microscópicos y evidencian una

vez más, las imprecisiones en estos métodos de identificación.

Esta consideración es particularmente importante en estudios de recuentos

bacterianos que no involucran el uso de herramientas moleculares, debido a que la

caracterización morfológica de bacterias que se presumen celulolíticas, podrían en

realidad corresponder a especies de grupos tróficos diferentes. Por ejemplo, al igual

que F. succinogenes, otras especies bacterianas ruminales de los géneros

Bacteroides, Actinobacillus y Clostridium, también pueden presentar pleomorfismo,

variabilidad en la composición de la pared celular y pueden degradar celobiosa

cuando no existen otras fuentes de carbono (Welter et al., 2002; Manual Bergey's,

2001). En efecto, en el presente trabajo se encontraron especies de los géneros

Bacteroides y Clostridium, los cuales no amplificaron con los cebadores especificos

de las principales bacterias celulolíticas. Sin embargo, es necesario adelantar

ensayos bioquímicos y morfológicos más rigurosos, que permitan establecer con

claridad la identidad de los aislados .

Los PCR utilizados resultaron útiles para la identificación molecular de las

principales bacterias celulolíticas anaerobias y abre la posibilidad de implementar en

nuestro medio , una sola prueba para detectar la presencia de las tres especies

bacterianas. Sin embargo, el bajo número de aislamientos de las bacterias de

24

interés y la utilidad en un número mayor de aislamientos queda aún por explorar. De

manera similar, es necesario secuenciar un mayor número de aislamientos por

especie, en los ambientes ruminales de los ganados criollos colombianos que

permitan no solo estimar la utilidad de secuencias diagnósticas sino también

profundizar en la biología básica y genética de la microbiota ruminal del trópico, de

la cual se tiene escasa información hasta la fecha.

25

HONGOS ANAEROBIOS DEL RUMEN DE GANADO CRIOLLO BON: ACTIVIDAD CELULOLíTICA EN RESIDUOS DE COSECHA

INTRODUCCiÓN

A pesar de la abundancia y ubiquidad de los microorganismos que degradan

celulosa, pocos de ellos producen un sistema de celulasas completo que

degrade extensivamente in vitro, la forma más recalcitrante de la celulosa: la

celulosa cristalina. Hasta el presente las especies mejor conocidas en este

sentido son los hongos aeróbicos Trichodenna y Phanerochaete; bacterias

como Clostridium thermocellum, y los hongos anaerobios ruminales,

especialmente del género Neocallimastix, los cuales han mostrado tener una

capacidad celulolítica mayor que las cepas mejoradas de Trichodenna

reesei, el modelo celulolítico más utilizado hasta el momento, (Srinivasan, K.,

et al 2001, Bhat M. K. and Bhat S., 1997).

Con base en lo anterior y teniendo en cuenta que en zonas tropicales como

la nuestra el ganado criollo como el Blanco Orejinegro (BON) se alimenta de

forrajes de baja digestibilidad, es posible pensar que en estas razas ha

habido una selección de microorganismos celulolíticos productores de

enzimas con gran capacidad degradativa. Por esta razón resulta interesante,

evaluar la capacidad celulolítica de microorganismos ruminales autóctonos;

dado que se presume que estando sometidos a rigurosas condiciones de

selección del trópico, podrían producir un complejo de celulasas más

eficiente para la degradación in vitro de los materiales lignocelulolíticos.

Este aspecto es de especial interés desde el punto de vista económico, si se

tiene en cuenta las amplias aplicaciones de las celulasas en la conversión de

materiales lignocelulolíticos, en el mejoramiento de la calidad de forrajes, la

26

extracción de jugos y sabores desde plantas y frutas, facilitación del

procesamiento cervecero, elaboración de vinos, mejoramiento de productos

de panadería, etc., lo cual estimula aún más, su estudio, obtención y

mejoramiento para fines industriales, (Uhlig, H.1998) .

Al igual que las bacterias, los hongos anaerobios ruminales presentan

pleomorfismo en cultivos in Vitro y por tal razón , es necesario establecer la

identidad taxonómica de los aislados utilizando metodologías adecuadas.

También en este caso se han desarrollado sondas oligonucleotídicas cortas

que permiten no solo la identificación sino también la cuantificación de

microorganismos del rumen. Desafortunadamente estas técnicas que

involucran la hibridación de ácidos nucleicos, presentan dificultades técnicas

(Brookman., et al. 2000) y siguen siendo costosas y dispendiosas en nuestro

medio lo cual limita su utilidad a nivel investigativo.

A pesar de que para algunas especies bacterianas se han desarrollado

técnicas diagnósticas específicas y eficientes basadas en PCR (Wang, Cao y

Cerniglia , 1997; Ossa., et al 1999), no se han encontrado reportes en los que

se utilice la técnica molecular PCR para la identificación de hongos

anaerobios ruminales.

Con el fin de contribuir a la búsqueda de enzimas celulolíticas de uso

potencial en procesos biotecnológicos agroindustriales, en el presente trabajo

se aislaron cepas nativas de hongos ruminales presentes en el rumen de

bovinos criollos BON y se evaluó su capacidad celulolítica en medios de

cultivo suplementados en residuos de cosecha. De manera adicional, se hizo

una aproximación a la identificación molecular de hongos anaerobios del