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13. MetabolisMo del nitrógeno: asiMilación del aMonio y ciclo de la urea

E. Casaretto, P. Díaz, O. Borsani y J. Monza Revisado por los Dres. Antonio Márquez y Marco Betti,

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas. Facultad de Química, Universidad de Sevilla, España.

Figura 1. Fuentes de nitrógeno utilizadas por las plantas. El N2 es reducido a NH4

+ por la nitrogenasa, enzima presente en el rizobio (bacteroide). El NO3

- y el NH4+ ingresan a las

células epidérmicas de la raíz mediante transportadores es-pecíficos. El NO3

- es reducido a NH4+ en células de las raíces o

de otros órganos de la planta.

1. el suelo y el aire como fuentes de nitró-geno para las plantas

El nitrógeno forma parte de los aminoácidos y proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos, cloro-filas, fosfolípidos y coenzimas, entre otras bio-moléculas.

1.1 a partir del suelo las plantas obtienen nitrato y amonioPara las plantas, las principales fuentes de nitró-geno del suelo son el amonio (NH4

+) y el nitrato (NO3

-). Este último es la forma combinada más abundante. • El NO3

-, absorbido activamente por las células de las raíces, debe ser reducido a NH4

+ para ser asimilado (Fig. 1).

• En la mayoría de las plantas existen dos tipos de transportadores para el NO3

-, los que tienen una KM alta (en el rango de mM), y los que tie-nen una KM baja (en el rango de μM). Se deno-

Microorganismo Kg/ha año

Cianobacterias 25Azospirilum 12Rizobio-soja 90Rizobio-lotus 100Rizobio-alfalfa 200

minan transportadores de baja (LATS) y alta (HATS) afinidad respectivamente.

El NH4+ también es absorbido activamente, pero

no debe ser reducido y se asimila como tal (Fig. 1).

• Como el NH4+ y el NO3

- ingresan por transporte activo, su absorción decrece con baja pO2 en el entorno radicular, así como si se aplican inhi-bidores o desacoplantes de la Cadena respira-toria.

1.2 el n2 del aire es reducido a nH4+ por

los rizobios y asimilado por las legumino-sasEl 78 % de la atmósfera es N2, que no puede ser utilizado como tal por las plantas ni los anima-les porque es una molécula muy estable. Sin embargo un grupo de procariotas llamados fija-dores de nitrógeno pueden reducirlo enzimáti-camente a NH4

+.

• Entre las bacterias fijadoras de N2 se encuen-tran los rizobios, particularmente importan-tes porque se asocian a leguminosas, así como también bacterias “en vida libre” como algu-nas cianobacterias (Fig. 2). En el cuadro 1 se muestran ejemplos de la capacidad fijadora la capacidad fijadora de nitrógeno de microorga-nismos con importancia agronómica.

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Figura 2. Fijadores simbióticos y en vida libre A. Nódulos inducidos por rizobios en raíces de una leguminosa. B. Cia-nobacteria fijadora de nitrógeno en vida libre, el ejemplar mostrado es del género Anabaena y fue aislado de arrozales de INIA Treinta y Tres.

 

Figura 3. Reducción de NO3- a NH4+. En la reducción de NO3- a NH4+ participan la nitrato reductasa (NR) de locali-zación citosólica y la nitrito reductasa (NiR) de localización plastidial. La fuente de poder reductor son los cofactores NAD(P)H.H+ y la Fd red.

•Los rizobios, dentro de las células radiculares de las leguminosas, son capaces de reducir el N2 a NH4

+ por acción de la enzima nitrogenasa. Este proceso se conoce como fijación biológica del nitrógeno (FBN). Por esto, las leguminosas noduladas por rizobios utilizan el nitrógeno del suelo y el derivado de la FBN (Fig. 1).

•Mediante una reacción fuertemente endergó-nica catalizada por la nitrogenasa el N2 es redu-cido a NH4

+, según se resume a continuación:

N 2 + 8e- + 8H+ + 16 ATP nitrogenasa 2NH4+ + H2 + 16 ADP + 16Pi

•La nitrogenasa se inhibe a determinadas con-centraciones de nitrógeno combinado (NO3

- o NH4

+) en el suelo. Esto se debe a que la reduc-ción de N2 por FBN es un proceso costoso ener-géticamente, de manera que frente a una fuen-te de nitrógeno alternativa se usa esta última.

•Los rizobios generan el ATP necesario para reducir al N2 a partir de moléculas carbonadas derivadas de la fotosíntesis que la planta les proporciona. Las bacterias le suministran NH4

+ a la planta. A esta relación entre individuos de distinta especie en la que ambos se benefician se denomina simbiosis.

El nitrógeno limita la productividad de las plan-tas, por lo que en agricultura se ha recurrido al uso de fertilizantes nitrogenados, como la urea. El uso en exceso de fertilizantes tiene importantes repercusiones económicas, medioambientales y

para la salud. Por esto, la fijación simbiótica de nitrógeno tiene connotaciones cada vez más rel-evantes en la agricultura sostenible.

2. el nitrato debe ser reducido a amonio para ser asimilado

La reducción de NO3- a NH4

+ es un proceso que ocurre en dos reacciones consecutivas: una citoplasmática catalizada por la enzima nitrato reductasa (NR), que reduce el nitrato a nitrito (NO2

-), y otra plastídica catalizada por la nitrito reductasa (NiR), que reduce NO2

- a NH4+ (Fig. 3).

•La NR utiliza como fuente de poder reductor al NADH.H+ generado en la Vía Glucolítica o el del NADPH.H+ producido en la Vía de las Pentosas.

•En hojas la NiR utiliza el poder reductor apor-tado por la Fdred generados en la fase luminosa de la fotosíntesis. En raíces se utiliza el poder reductor del NADPH.H+ generado en la Vía de las pentosas, que reduce a la ferredoxina por acción de una Fd-NADP reductasa.

•Cuando a una planta se le suministra NO3-, au-

menta la cantidad y actividad de proteína NR en hojas y raíces. El aumento de la cantidad de NR se debe a la síntesis de novo de la enzima. En plantas, este es uno de los ejemplos más conocidos de inducción de la síntesis de una enzima en presencia de su sustrato. Existen también mecanismos post-traduccionales de regulación de la actividad NR, que se inactiva en oscuridad y bajo limitación de carbono.

•Los niveles de NiR son siempre muy superiores a los niveles de NR, lo que garantiza que no se acumule NO2

-, que es tóxico.

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Figura 4. Asimilación de amonio. La GS incorpora el amonio al glutamato con gasto de ATP para dar glutamina. La GOGAT transfiere el grupo amida al α-cetoglutarato para dar 2 glutamatos, con poder reductor proveniente del NADH.H+ o de la Fdred. Una aminotransferasa (AT) permite la síntesis de otros aminoácidos.

3. el amonio es asimilado mediante el ci-clo gs/gogat

La asimilación de amonio consiste en NH4+ su in-

corporación a moléculas orgánicas. En los tejidos vegetales prácticamente la totalidad del amonio es asimilado por la enzima glutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa (GOGAT), una amido transferasa (Fig. 4).

•La GS cataliza la incorporación del NH4+ al

glutamato para dar glutamina (Fig. 4) en una reacción que requiere ATP. La baja KM de la GS para el NH4

+ asegura su inmediata asimi-lación, lo que evita que este ión tóxico, quede libre en la célula.

•Seguidamente, el grupo amida de la gluta-mina es transferido a un α-cetoglutarato y se obtienen dos moléculas de glutamato (Fig. 4).

Esta reacción es catalizada por la GOGAT que tiene distintas isoformas, la NADH-GOGAT y la Fd-GOGAT que utilizan diferente fuente de poder reductor, NADH.H+ y Fdred respectiva-mente.

+ Observe que uno de los glutamatos acepta el NH4

+, cerrando el Ciclo GS/GOGAT, mientras que el otro es el resultado neto de la asimilación de amonio, a partir del cual se sintetizan otros aminoácidos (Fig. 4).

4. las aminotransferasas transfieren gru-pos aminos

Una vez asimilado el amonio, el grupo amino del glutamato es transferido a cetoácidos por reac-ciones de transaminación catalizadas por amino-transferasas o transaminasas.

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•Las aminotransferasas catalizan la transferen-cia del grupo amino del carbono α de un ami-noácido al carbono α de un cetoácido, permi-tiendo sintetizar aminoácidos a partir de cetoá-cidos y viceversa (Fig. 5 A).

•En una reacción de transaminación (Fig. 5 A), un aminoácido cede su grupo amino al fosfato de piridoxal (PAL) que lo capta y queda como fosfato de piridoxal amino (PAM), mientras que el aminoácido se transforma en un cetoá-cido. A su vez, la transaminasa transfiere el grupo amino del PAM a otro cetoácido que se transforma en el correspondiente aminoácido y se regenera el PAL. En la figura 5 B se repre-senta un ejemplo concreto de transaminación.

•La reversibilidad de las reacciones de transa-minación permite ajustes de acuerdo a la de-manda de aminoácidos.

+ Observe que la síntesis de un nuevo aminoá-cido implica la degradación de otro que funciona como dador del grupo amino y viceversa (Fig. 5).

5. el glifosato inhibe la síntesis de ami-noácidos aromáticos

En plantas, la síntesis de aminoácidos aromáti-cos (fenilalanina, triptófano y tirosina), ocurre a partir de las mismas reacciones, desde el siqui-mato (Fig. 6). A su vez, estos aminoácidos son necesarios la síntesis de proteínas y para la pro-ducción de la hormona vegetal ácido indol acéti-co y antocianinas, entre otras (Fig. 6).

•La vía de síntesis de aminoácidos aromáticos presenta un particular interés porque el gli-fosato, principio activo del herbicida Roun-dup®, inhibe competitivamente a la enzima 5 enolpiruvato siquimato sintasa 3P (EPSP sin-tasa) que cataliza un paso de esa vía.

•La construcción de plantas transgénicas con resistencia a ese herbicida se basó en la posi-bilidad de inhibir a esa enzima con glifosato.

•Las plantas transgénicas llevan una forma del gen que codifica a la EPSP sintasa bacteriana, enzima que no es inhibida por glifosato. Ac-tualmente se han generado transgénicos con capacidad de metilar al glifosato, lo que deter-mina que no se comporte como inhibidor com-petitivo.

6. los aminoácidos pierden el grupo ami-no por desaminación oxidativa

La desaminación oxidativa es un proceso degra-dativo de los aminoácidos por el que éstos pier-den un grupo amino. Un ejemplo es la desamina-ción oxidativa del glutamato, que ocurre en mi-tocondrias de animales y plantas, catalizada por la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH) que utiliza NAD+ como cofactor (Fig. 7).

•En los animales, los grupos amino que se li-beran de la desaminación no se utilizan para la síntesis de nuevos aminoácidos u otros pro-ductos nitrogenados, y deben ser excretados.

Figura 5. Transaminaciones. A. Reacción general de transa-minación. Se requiere del cofactor fosfato de piridoxal (PAL) que capta el grupo amino y queda como fosfato de piridoxal amino (PAM). B. Transaminación Glutamato - Piruvato.

Figura 6. Síntesis de aminoácidos aromáticos. La inhibi-ción competitiva de la enzima EPSP por glifosato, impide la síntesis de aminoácidos aromáticos.

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•Los peces y larvas de batracios, con alta dispo-nibilidad de agua en el medio, excretan el amo-nio como amoníaco, son amonitélicos. Las aves y reptiles lo excretan como ácido úrico, son uri-cotélicos y los mamíferos como urea, son ureo-télicos. En las plantas, la urea es una molécula de reserva de nitrógeno.

•Los microorganismos y plantas poseen la en-zima ureasa, que hidroliza la urea en amonio CO2 y NH4

+, este último es reasimilado por el ciclo GS/GOGAT.

7. ciclo de la urea

El ciclo de la urea ocurre en animales y plantas según las mismas reacciones (Fig. 8), pero el sig-nificado biológico es diferente.

•El amonio liberado por desaminación oxidati-va del glutamato es incorporado a una molé-cula de CO2 con gasto de 2 ATP y se produce el carbamil fosfato. Esta molécula se condensa con la ornitina y rinde citrulina que obtiene otro grupo amino del aspartato y rinde succi-nil-arginina, con gasto de otros 2 ATP. La enzi-ma arginasa permite que el ciclo se cierre con la liberación de urea (Fig. 8).

• La conversión de succinil-arginina en arginina se logra por la liberación de fumarato, que in-gresa al ciclo de Krebs.

•La arginina que se genera en el Ciclo de la urea es la principal forma de almacenamiento de ni-trógeno en plantas y en semillas constituye el 40 % del nitrógeno.

•En animales, el flujo de nitrógeno a través del ciclo de la urea varía con la dieta. Cuando la

ingesta de proteínas es elevada, la utilización de los esqueletos carbonados de los aminoáci-dos como fuente de energía da lugar a un incre-mento en la producción de urea.

al finalizar la preparación del tema será capaz de:

1. Diferenciar transaminación de desaminación.

2. Relacionar a las transaminaciones con la de-gradación - síntesis de aminoácidos.

3. Identificar los requerimientos para que el NO3-

y el N2 sean reducidos a NH4+.

4. Explicar en que consiste la asimilación del amonio.

5. Establecer similitudes del Ciclo de la urea en animales y vegetales y las diferencias en la fi-nalidad del mismo en cada caso.

6. Visualizar la magnitud de la FBN en la entrada de nitrógeno a los ecosistemas.

7. Establecer relaciones entre el metabolismo del C y N.

Figura 7. Desaminación oxidativa del glutamato. La reac-ción, catalizada por la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH), tiene como cofactor al NAD(P)+.

Figura 8. Ciclo de la urea. La desaminación oxidativa del glutamato libera NH4

+ que en los vegetales y animales ureo-télicos forma carbamil fostato, molécula que abastece al Ci-clo de la urea. Este ciclo libera urea y regenera el aminoácido no proteico ornitina. En las plantas la urea es hidrolizada por la ureasa.

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