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Maritza Andrea Gil Garzn*

Benjamn A. Rojano**

Carlos Andrs Guerrero*

* Corporacin UniversitariaLasallista

** Universidad Nacional deColombia, sede Medelln

Inhibicin de la polifenoloxidasaextrada del banano (cavendish) por

medio de algunos derivadosdel isoespintanol

Resumen

Introduccin.Buscando nuevas fuentes de compues-tos naturales que contengan actividad antioxidante, seha encontrado una amplia variedad de plantas fen-licas con alto poder protector sobre la inhibicin delpardeamiento enzimtico responsable de cambios decolor indeseables en frutas y vegetales frescos. Obje-tivo. En este trabajo, se estudi la inhibicin del par-deamiento enzimtico de la polifenol oxidasa, PPO,extrada del banano Cavendish Gigante (tipo exporta-cin), utilizando como sustrato dopamina.Metodolo-ga. Como inhibidores se utilizaron: el isoespintanol,

metabolito extrado de la planta Oxandra cf.xylopioi-des (Annonaceae) y dos de sus anlagos: 2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol y 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno que fueron obtenidossimultneamente por el mtodo de bromacin conbromuro de dimetilsulfonio, en una relacin (75:25),respectivamente. Adems, se utiliz el cido ascrbicocomo antioxidante de referencia. Los compuestos sin-tetizados fueron caracterizados por espectroscopia de

resonancia magntica, RMN y cromatografa acopla-da a masas, GC-MS y su capacidad antioxidante fue

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evaluada por los mtodos de ABS, FRAP y DPPH.La actividad de laPPO parcialmente purificada, fue analizada sobre el extracto enzimti-co, espectrofotometricamente a 30C en presencia de los antioxidantes

a 500, 1000 y 1500 ppm. Resultados y anlisis.El isoespintanol pre-sent la mejor respuesta por las tres tcnicas de capacidad antioxidante,mientras el bromado present la mejor capacidad reductora por la tc-nica FRAP y el demetilado tuvo un mejor comportamiento en mediometanlico (DPPH). La actividad de la PPO fue 102.93 unidades deactividad; esto significa que hubo una reduccin entre un 72.5 y 92%con todos los compuestos. La mayor inhibicin se logr a 1500 ppmde cido ascrbico (92%). Con la inhibicin de la actividad enzimticapara el compuesto bromado y demetilado no se presentaron diferencias

significativas (P>0.05) a 500 ppm (84.8 84.53%), 1000 ppm (73.87- 72.53%) y 1500 ppm (84 82.4%), respectivamente. Lo contrarioocurri para el isoespintanol con respecto a sus dos anlogos, a 1000ppm (42.4%), que evidenciaron diferencias estadsticamente significa-tivas (P>0.05).

El tipo de inhibicin fue estudiada para el isoespintanol que presentuna inhibicin competitiva (KI=0.015M y KM=0.026M).

Palabras clave: PPO, Isoespintanol, pardeamiento enzimtico, DPPH,FRAP, ABS.

Inhibition of poliphenoloxidase from bananas (cavendish) by

the use of some isoespintanol derivatives

Abstract

Introduction.Looking for new sources of natural compounds withanti-oxidant activity, a great variety of phenolic plants have been beingfound. Tey have a high protective power on the enzymatic browning,

responsible for undesired color changes in fresh fruits and vegetables.Objective. In this work, enzymatic browning inhibition of polyphenoloxidase, PPO, extracted from Giant Cavendish bananas (export type)is studied, by the use of the dopamine substratum. Methodology. Teinhibitors used were: Isoespintanol (a metabolite extracted from Oxan-dra cf. xylopioides (Annonaceae) and two of its analogs: 2-isopropyl-4-bromo-3 ,6-dimethoxy-5-methylphenol and 3-isopropyl-6-methyl-1,2,4-trihydroxybenzene, which were simultaneously obtained by the useof the bromination method with dimethylsulphonium bromide in a(75:25) relation, respectively. Also, ascorbic acid was used as a refe-rence anti-oxidant. Te compounds synthesized were characterized by

Maritza Andrea Gil Garzn, Benjamn A. Rojano, Carlos Andrs Guerrero

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performing a magnetic resonance spectroscopy and a chromatographycoupled to masses and its anti-oxidant capability was evaluated withthe ABS, FRAP and DPPH methods. PPOs activity, partially pu-

rified, was analyzed on the enzymatic extract, spectrophotometrically,at 30C before the anti-oxidants at 500, 1000 and 1500 ppm. Re-sults and analysis. Isoespintanol had the best response under the threeanti-oxidant capability techniques, while the bromination had the bestreduction capability under the FRAP method and the demethylatedhad a better performance in the methanolic medium. PPOs activitywas 102.3 activity units, this means that thee was a reduction between72.5 and 92% with al of the compounds. Te highest inhibition wasachieved at 1500 ppm of ascorbic acid (92%). With the inhibition

of the enzymatic activity for the brominated and the demethylatedcompound there were no significant differences, (P>0.05) at 500 ppm(84.8 84.53%), 1000 ppm (73.87 - 72.53%) and 1500 ppm (84 82.4%), respectively. Te opposite took place for the isoespintanolconcerning its two analogs, at 1000 ppm (42.4%), which obtained sig-nificant statistic differences (P>0.05). Te inhibition type was studiedfor isoespintanol, which had a competitive inhibition (KI=0.015M yKM=0.026M).

Key words: PPO, Isoespintanol, enzymatic browning, DPPH, FRAP,

ABS.

Introduccin

El color en los alimentos es un parmetro de gran importancia parael consumidor. Al menos cinco causas han sido detectadas como respon-sables del cambio de color en frutas y vegetales frescos: pardeamiento u

oxidacin enzimtica de polifenoles, reacciones de Maillard, oxidacin decido ascrbico, caramelizacin y formacin de polmeros oscurecidos porla accin oxidativa de lpidos1-4.Estas reacciones ocurren cerca del esque-ma de proceso del consumidor, como el almacenamiento y exhibicin;por tal razn, el control debe ser realizado desde la recoleccin hasta elconsumidor para minimizar prdidas y sostener el valor econmico parael agricultor y el procesador. Se han comprobado prdidas que sobrepasanel 50% en frutas exticas y vegetales, en particular variedades tropicales y

subtropicales5.

Inhibicin de la polifenoloxidasa extrada del banano (cavendish)...

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Las enzimas que catalizan el pardeamiento pertenecen a las xido-reduc-tasas, y se conocen con diferentes nombres: monofenol oxidasa, tirosina-sa y fenolasa; esta ltima es la ms aceptada y cuyo nombre correspondea la o-difenol-oxgeno-xido-reductasa (E.C. 1.14.18.1 usualmente llama-da, PPO)6,7. La PPO cataliza el paso inicial de la oxidacin de o-fenoles ao-quinonas, los cuales sufrirn ms adelante polimerizacin para producirpigmentos insolubles y oscuros reconocidos como melaninas responsablesdel color8-11. El pardeamiento enzimtico tambin est involucrado con laprdida en el valor nutricional debido a la oxidacin del cido ascrbico12,13.

En la industria de alimentos, la actividad de la PPO puede ser evitadausando tratamientos trmicos14,pero el calor puede causar caractersticas nodeseables15especialmente en vegetales y frutas frescas16. Otras alternativaspara la inhibicin de la actividad han sido propuestas: aditivos qumicoscomo bisulfitos17-19, cido ascrbico y sus anlogos20-22y cistena como agentereductor de quinonas a difenoles23-25Adems, puede ser inhibida por variastcnicas basadas en la eliminacin de uno o ms componentes esencialescomo oxgeno y Cu2+, cambios del sustrato26,27. As, los inhibidores de par-deamiento pueden ser clasificados segn su modo de accin en seis catego-ras: agente reductores, quelantes y acomplejantes, inhibidores de enzimas,

tratamientos enzimticos28y atrapadores de oxgeno singulete29.El control del pardeamiento es un reto en la industria de frutas y vegeta-

les. Actualmente, los productores de alimentos prefieren aditivos naturalesespecialmente agentes antioxidantes libres de sulfitos, debido al peligroque representan para la salud humana, especialmente en pacientes asm-ticos30. De esta forma, hay una tendencia de crecimiento en el reemplazode antioxidantes sintticos por antioxidantes naturales que no produzcanefectos txicos31. En los ltimos aos, los compuestos fenlicos de origenvegetal han sido objeto de estudio32-35 y se ha identificado un gran nmerode sustancias con amplio espectro de actividades funcionales, principal-mente por su potencial benfico para la salud debido a su actividad an-tioxidante36, por la presencia de algunos de sus productos de degradacinque son multifuncionales y pueden actuar como agentes reductores, reac-cionantes con radicales libres, quelantes y acciones antimicrobianas37,38,39que los convierte en una nueva alternativa antioxidante.

En la planta Oxandra cf.xylopioides(Annonaceae) se encuentran comometabolitos principales el berenjenol y el isoespintanol (0.1 y 1.5 % en


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base seca respectivamente) los cuales poseen actividad anti-inflamatoria40.Adems, se ha estudiado el efecto protector del isoespintanol (2-isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol), sobre el ADN de linfocitos humanos, y com-parado con el BHA como antioxidante de referencia, muestra un granefecto a un bajo rango de concentraciones (3-80 mM)41. Por la anteriorrazn, el objetivo de este trabajo consisti en la evaluacin de la inhibicindel pardeamiento enzimtico en el extracto parcialmente purificado del ba-nano usando isoespintanol y dos de sus anlogos, y compararlos, adems,con el cido ascrbico que en anteriores estudios present inhibicin totalsobre la pulpa de banano42.

Marco tericoLas reacciones de xido-reduccin son comunes en los sistemas biol-

gicos y tambin en los alimentos. Algunas de estas reacciones son benefi-ciosas para los alimentos, pero otras son perjudiciales como ocurre con ladegradacin oxidativa de las vitaminas, pigmentos y lpidos que prducen laprdida del valor nutricional, el desarrollo de malos olores y color desagra-dable. La oxidacin se produce cuando un tomo o grupo de tomos cedenelectrones. De forma simultnea, se produce la correspondiente reaccin

de reduccin que implica la captacin de electrones por otro tomo dife-rente o grupo de tomos. Estas reacciones pueden o no incluir la adicinde tomos de oxgeno o la prdida de tomos de hidrgeno de la sustanciaque se est oxidando43.

Antes del desarrollo de una tecnologa qumica especfica para el controlde los radicales libres responsables de la oxidacin, el trmino antioxidantese aplic a todas las sustancias que inhiban las reacciones de oxidacin,independiente de su mecanismo de accin. Ms recientemente, el trmino

antioxidantes alimentarios se ha aplicado a aquellos compuestos que in-terrumpen la reaccin en cadena de los radicales libres formados en la oxi-dacin de lpidos y a los que eliminan el oxgeno singulete; sin embargo, eltrmino no debera utilizarse con un sentido tan restrictivo44.

Existen cientos de compuestos naturales y sintticos con propiedadesantioxidantes, aunque para su empleo en los alimentos deben cumplir cier-tas exigencias, entre ellas, superar las pruebas de inocuidad. Para que sueficacia sea mxima se realizan combinaciones de antioxidantes o con di-versos agentes secuestradores de metal, y se logra una accin sinrgica queproporciona una proteccin ms completa45,46.


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Mecanismo de accin de los antioxidantes

Para comprender el papel protector de los antioxidantes, se han pro-

puesto dos mecanismos principales. En el primero, los radicales libres re-mueven un tomo de hidrgeno del antioxidante (ArOH) que, a su vez, seconvierte en radical:

(1)

La alta estabilidad del radical ArO. corresponde a una mejor eficacia delantioxidante ArOH.

El segundo mecanismo es la transferencia de un electrn, donde el an-tioxidante puede dar un electrn al radical libre y convertirse en un catin

radical. (2)

En este caso, el radical catin es ms estable y no reacciona con las mo-lculas del sustrato47,48.

Pardeamiento enzimtico

El pardeamiento enzimtico est relacionado con la oxidacin de com-

puestos fenlicos en presencia de oxgeno. Estos compuestos se encuentranlocalizados principalmente en las vacuolas y son catalizados por la enzimapolifenol oxidasa, PPO, localizada en el citoplasma. Diferentes situacionespueden causar pardeamientos: daos fisiolgicos durante la maduracin,algunos desrdenes en el almacenamiento y procesos tecnolgicos invo-lucrados con heridas o rompimientos de la superficie. La tendencia delas plantas a cambiar de color (ms oscuras) resulta de la accin de variosfactores, los cuales estn naturalmente involucrados con la actividad dela enzima, la naturaleza y el contenido del sustrato oxidable. odos estosfactores varan con el tiempo de maduracin de las frutas y vegetales, suestado fisiolgico, la variedad y los tratamientos a las que son sometidos.

Polifenol oxidasa, PPO

Las enzimas que catalizan el pardeamiento y coloracin de las frutas yvegetales pertenecen a las xido-reductasas, y se conocen con diferentesnombres: fenoloxidasa, monofenol oxidasa, difenol oxidasa, catecolasa,tirosinasa y fenolosa; esta ltimo es la ms aceptada y su nombre corres-ponde a la o-difenol-oxgeno-xido-reductasa, usualmente llamada PPO


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[6]; por esta razn, su actividad ha sido ampliamente estudiada durantelas ltimas dos dcadas49,50. Desde 1992, se han hecho muchos progresosconcernientes a la estructura, localizacin y clasificacin de la PPO, parti-cularmente debido a actividad biolgica, molecular e inmunolgica, y suuso en mtodos qumicos51.

Dependiendo de su especificidad sobre sus sustratos, se pueden agruparen tres tipos de enzimas:

Cresolasa (EC. 1.14.18.1 monofenol monooxigenasa).Catecolasa o fenolasa (EC. 1.10.3.1, o-difenol: oxgeno xido-reductasa).p -difenoloxidasa o laccasa52,53.

As tambin, dependiendo del sustrato sobre el que acta, se han defi-nido dos clases de actividades enzimticas: la primera denominada (cre-solasa) cuando hidroxila monofenoles, y la segunda (catecolasa) oxidadifenoles a quinonas Dependiendo de la fuente, la actividad cresolasaes mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos, pero, en general,todas las enzimas tienen actividad catecolasa.

La forma de actuacin de la enzima con dos actividades distintas ha sidoaclarada en parte hace pocos aos, relativamente. La enzima cataliza dosreacciones porque en el estado nativo se encuentra en dos formas distintas:la llamada met-tirosinasa, que es activa solamente sobre monofenoles, y laoxi-tirosinasa. Estas formas se interconvierten entre ellas, de forma acopla-da al desarrollo de la reacciones que catalizan54.

La caracterstica estructural ms importante de estas enzimas es la pre-sencia en su centro activo de dos iones de cobre, Cu1+(figura 1), unidoscada uno de ellos a dos55o tres histidinas, que se han conservado a lo largode la evolucin en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias alhombre. En su entorno se sita una serie de aminocidos hidrofbicos,

con anillos aromticos, que tambin son importantes en su actividad, parala unin de los sustratos56.Adems, existe una alta heterogeneidad entre especies y dentro de la

misma especie durante las diferentes etapas del desarrollo, con el fin deexpresar la actividad enzimtica de la PPO que puede variar dependiendode factores como: pH ptimo, latencia, especificidad por el sustrato, etc.58

Mecanismo de pardeamiento enzimtico

Las reacciones de formacin de quinonas involucran compuestos fe-nlicos tipo flavonoides59 y no fenlicos. Las quinonas resultantes de la


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oxidacin enzimtica tienen diferentes caractersticas espectrales que de-penden del fenol a partir del cual ellas se originan y el pH del medio60.La oxidacin de quinonas con otra molcula de fenol puede ser muy rpi-da, y depende del potencial de reduccin respectiva del complejo enzima-sustrato formado. Esta reaccin gua a la formacin de dmeros del fenoloriginal o regeneracin del fenol. Por supuesto, sus productos estn suje-tos a oxidaciones futuras, ya sea por va enzimtica o por va o-quinona, ydan como resultado grandes oligmeros y formacin de enlaces covalentescon aminocidos nucleoflicos para producir pigmentos insolubles y os-curos reconocidos como melaninas61. Las reacciones de o-quinonas concompuestos no fenlicos conducen tambin a la formacin de pigmentos

oscuros e insolubles en agua llamados melaninas62.El mecanismo descrito en forma ordenada para la formacin de melani-

na consiste en varias etapas: en la primera (hidroxilacin de monofenoles ao-difenoles) la enzima liga primero el oxgeno y despus el monofenol; estaetapa es determinante de la reaccin, con participacin de los intermedia-rios indicados en la figura 2. Segundo, se produce un cambio de valencia(Cu1+ Cu2+), y se forma un complejo, en el que el enlace O-O est tanpolarizado que se produce la hidroxilacin hasta o-difenilos. Finalmente la

oxidacin del o-difenol hasta quinonas finaliza el ciclo63.

Figura 1. Estructura del sitio activo de la polifenoloxidasa de la batata

omado de Calvo, M.57


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Figura 2. Oxidacin de tirosina causada por PPO para producir melanina.

omado de Belizt, H. D.64y Lerner, A. B.65


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Control de pardeamiento

El control de pardeamiento es un reto en la industria de frutas y vegeta-

les, especialmente con el desarrollo de tcnicas que requieran del mnimoprocesamiento de estas materias primas. Se han reportado previamente m-todos biolgicos-moleculares desarrollados para el control del pardeamiento.En adicin, diferentes mtodos para el control del pardeamiento enzimticomodernos o tradicionales como los tratamientos fsicos (trmicos, deseca-cin o disminucin de la a

w, congelacin, refrigeracin, etc.) y qumicos (adi-

cin de inhibidores y otros aditivos) son an objeto de investigacin. Estasformas de control pueden dividirse en tres clases dependiendo del factor queataquen, ya sea la enzima, el sustrato o los productos de la reaccin66.

Accin sobre la enzima

La acidificacin, alcalinizacin y tratamientos trmicos son frecuente-mente aplicados para inhibir la actividad enzimtica. La alcalinizacin nopuede ser aplicada a compuestos fenlicos por su alta sensibilidad a la oxi-dacin a pH alcalinos. La PPO muestra su actividad ptima a un pH entre5 y 7 67,68,69y la enzima parece relativamente sensible a pH cidos. Pero, elcontrol del pardeamiento enzimtico nicamente por acidificacin es muy

difcil, a menos que sea a pH muy bajos.

Accin sobre los sustratos

La remocin completa del oxgeno es una forma muy satisfactoria parael control de la oxidacin fenlica catalizada por la PPO, aAunque estemtodo no puede ser aplicado a tejidos vivos porque puede causar condi-ciones anaerbicas y tampoco es aceptable en algunos productos frescos.

Concerniente a los sustratos fenlicos, dos opciones han sido investiga-das. La primera es la eliminacin fsica por adsorbentes especficos como laciclodextrina 70. La segunda forma de remocin de compuestos fenlicos espor su modificacin enzimtica a travs del uso de o-metil-transferasa71.

Accin sobre productos

Las o-quinonas pueden ser reducidas a o-difenoles o pueden reaccionarcon otros compuestos y formar complejos no coloreados. Algunos de loscompuestos reductores ms usados son: el cido ascrbico, los sulfitos, lostioles como la cistena y los aminocidos72,73.


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Recientemente, muchas tcnicas nuevas son aplicadas en la prevencindel pardeamiento enzimtico, tales como: tratamientos fsicos (irradiacin,altas presiones74, ultrasonido75, luz pulsada, calentamiento hmico, coc-cin al vaco, ultrafiltracin, etc.) y qumicos o biolgicos (bioconservan-tes, atmsferas modificadas, enzimas inhibidoras, etc.) que disminuyen losriesgos que traen los tratamientos trmicos76,77.

Clasificacin de inhibidores

El uso de inhibidores es restringido teniendo en cuenta consideracionesrelevantes como la toxicidad, el efecto sobre las caractersticas organolp-ticas y el costo. Los inhibidores de pardeamiento pueden ser clasificadossegn el modo de accin en seis categoras:

Agentes reductores: agentes sulfhdricos, cido ascrbico y sus anlogos,cistena, glutatin, etc.Acidulantes: cido ctrico y fosfrico.Agentes quelantes: fosfatos, EDA, cidos orgnicos, etc.Agentes acomplejantes: ciclodextrinaInhibidores de enzimas: cidos carboxlicos aromticos, alcoholes alif-

ticos, aniones, pptidos, resorcinol sustituido.ratamientos enzimticos: oxigenasas, o-metil transferasas, proteasas.

Agentes reductores

Previenen el pardeamiento enzimtico por la reduccin de o-quinonas ao-difenoles no coloreados o al reaccionar irreversiblemente con o-quinonaspara formar productos no coloreados ms estables. Los compuestos deri-vados del azufre son los ms ampliamente empleados en la industria de los

alimentos.Derivados de azufre. Los derivados de azufre tienen un rol multifun-cional en los alimentos; estos poseen actividad antimicrobiana e inhibenel pardeamiento tanto enzimtico como no enzimtico. algunas especiescomo el bisulfito HSO

3 y sulfitos SO

32 ejerce un efecto competiti-

vo con la PPO, debido al enlace formado entre este y el sitio activo de laenzima; adems, este compuesto reacciona con algunos intermediarioscomo quinonas, que resultan en la formacin de sulfoquinonas e inhi-ben irreversiblemente la PPO.


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Los sulfitos y sus derivados son antioxidantes qumicos muy poderososactualmente utilizados en la industria, pero que representan un poten-cial riesgo para la salud78,79.cido L-ascrbico . El cido L-ascrbico (vitamina C) es un agentereductor moderado80-84. Este previene el pardeamiento y otras reaccio-nes oxidativas en frutas y vegetales; adems, es considerado como unbuen secuestrante (atrapador) de oxgeno que permite la remocin deloxgeno molecular en las reacciones de la PPO85. Sin embargo, el cidoascrbico es oxidado al cido dihidroascrbico en forma irreversible du-rante el proceso de reduccin y permite el pardeamiento posteriormen-te. Es muy usado el cido ctrico en conjunto con el cido L-ascrbico

para mantener el nivel del pH en el medio [3].Cistena. La cistena tiene un efectivo poder inhibidor enzimtico86-89,pero tiene efectos negativos sobre el sabor. La inhibicin de la melano-sis por cistena es debido a la formacin de o-quinonas tiol conjugadas(reaccin de adicin); la cistena tambin muestra reduccin de las o-quinonas a su fenol precursor.

Acidulantes.

Los grupos ionizables de la estructura proteica de las enzimas son afec-tados por el pH del medio. Estos grupos deben estar en su forma inicaapropiada a fin de mantener la conformacin del sitio activo, el enlace conel sustrato o catalizar la reaccin enzimtica. Los cambios en la ionizacinson generalmente reversibles. La desnaturalizacin irreversible ocurre bajocondiciones extremas de pH. La estabilidad del sustrato es tambin afec-tada por el cambio del pH. Los sustratos degradados actan como inhibi-dores de enzimas.

Los acidulantes son aplicados generalmente para mantener el pH pordebajo del punto ptimo de actividad cataltica de la enzima. Acidulantescomo el cido ctrico, mlico y fosfrico pueden inhibir el efecto de laPPO. Los acidulantes son usados frecuentemente con otros antioxidantes.

Quelantes

Las enzimas generalmente poseen iones de metales en su sitio activo.Los agentes quelantes remueven estos iones y pueden de esta forma inac-tivar la enzima. anto los complejos formados entre los agentes quelantescomo los prooxidantes tales como el cobre o el hierro son inhibidores.


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Agentes acomplejantes

La cavidad central de la ciclodextrina es hidrofbica mientras que la

regin externa de este oligosacrido es hidroflica, debido a la presencia degrupos hidroxilos primarios y secundarios.La ms importante propiedad funcional de la ciclodextrina es su habili-

dad para la inclusin de molculas dentro del ncleo hidrofbico o ligera-mente apolar, que la convierte en un excelente inhibidor de pardeamientoen frutas frescas y vegetales crudos90.

Inhibidores de enzimas, 4-Hexilresorcinol (4-HR)

Los resorcinoles sustituidos, compuestos m-difenlicos que estn es-tructuralmente relacionados con los sustratos fenlicos, tienen un efec-to inhibidor competitivo con la PPO91-93; la sustitucin hidrofbica conhexil, dodecil y grupos ciclohexil en la posicin 4 del anillo aromtico delresorcinol incrementa la efectividad de su efecto inhibidor competitivosobre la polifenoloxidasa.

El 4-HR sustituido tiene I50

capacidad inhibidora del 50% a una con-centracin de 0.2 M. La actividad de la monofenolasa y difenolasa de latirosinasa son inhibidas por el 4-HR.

Las principales ventajas del 4-HR son: la efectividad a bajas concentra-ciones, la estabilidad qumica, la inhabilidad para decolorar compuestospreformados94y el alto sinergismo con el cido ascrbico debido a que elcido ascrbico reduce las quinonas y el 4-HR interacta con la PPO95.

Plantas fenlicas como antioxidantes naturales

Los antioxidantes naturales en alimentos pueden provenir de compuestos

endgenos en uno o ms componentes del alimento, de sustancias formadasde reacciones durante el procesamiento o de aditivos alimenticios aislados defuentes naturales. La mayora de los antioxidantes son compuestos fenlicospresentes en todas las frutas y vegetales ampliamente consumidos en la dietadiaria en forma fresca o como derivados de productos alimenticios.

Los antioxidantes fenlicos de plantas comnmente incluyen compo-nentes flavonoides, derivados de cido cinmico y tocoferoles. Muchoscompuestos fenlicos son buenos sustratos del pardeamiento y buenos an-tioxidantes como las catequinas; por el contrario, los flavonoles no sonbuenos sustratos de pardeamiento pero son antioxidantes muy activos.


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Las fuentes naturales de las plantas antioxidantes han sido ampliamenteestudiadas. Estas plantas incluyen diferentes rganos tales como semillas,frutas, hojas, entre otros.

Las plantas con contenido de fenoles y algunos de sus productos dedegradacin son multifuncionales y pueden actuar como agentes reducto-res, reaccionantes con radicales libres, quelantes y atrapadores de oxgenosingulete96.

Los estudios ms recientes sobre la planta Oxandra cf.xylopioides(Anno-naceae), perteneciente al gnero deMagnoliales,presentan como metaboli-tos altamente bioactivos, el berenjenol y el isoespintanol97-99.

El Isoespintanol (2-isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol) es uno de loscompuestos aislados de las hojas de Oxandra cf.xylopioides(Annonaceae),el cual es considerado como un monoterpeno de estructura cristalina sli-da con propiedades antioxidantes100-103. Los estudios ms recientes acercadel efecto protector de linfocitos humanos, sometidos a estrs oxidativo in-ducido por perxido de hidrgeno y comparado con el butilhidroxianisol(BHA), muestran como resultado una gran actividad antioxidante a bajasconcentraciones, y no presentan efectos cito genotxicos.

Anlisis de la actividad antioxidante

Existen varios mtodos para la evaluacin de la capacidad antioxidante;estos son de fcil aplicacin y son citados a continuacin:

La actividad antioxidante es ampliamente usada como parmetro paracaracterizar diferentes materiales vegetales. Esta actividad se relaciona concompuestos capaces de proteger un sistema biolgico del efecto poten-cialmente daino de procesos que causan excesiva oxidacin involucrandoespecies reactivas del oxgeno; otras se basan en la oxidacin-reduccinde iones metlicos y la capacidad de una muestra para atrapar radicaleslibres104,105.

Reaccin con el radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)

El DPPH(figura 3) es un radical estable de color violeta, cuya absor-bancia disminuye al ser reducido por un antioxidante (AH):

(3)


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Esto permite cuantificar la capacidad antioxidante de las muestras, ymedir el grado de decoloracin de una disolucin metanlica de DPPH,a una longitud de onda de 515-517nm106.

Figura 3. Estructura del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH

omado de Prior; et al.107

Reaccin con el radical catinico 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato

de amonio (ABTS+)

Este ensayo es denominado tambin Mtodo EAC (rolox EquivalentAntioxidant Capacity Assay)108y es uno de los ms usados para la deter-minacin de la capacidad antioxidante total. La base del mtodo consisteen la cuantificacin de la decoloracin del radical ABS+, debido a la in-teraccin con especies donantes de hidrgeno o de electrones (figura 4). Elradical catinico ABS+es un cromforo altamente absorbente a una lon-gitud de onda de 415 734nm y se genera por una reaccin de oxidacindel ABS (2,2 -azino- bis-(3-etil benzotiazolin -6- sulfonato de amonio)en presencia de peroxidasas u oxidasas sobre ABS. Una solucin establede ABS+tambin puede ser preparada con agentes oxidantes tales como

dixido de manganeso o persulfato de potasio109.La actividad antioxidante se evala midiendo el cambio de absorbancia

a 732 734 nm de la solucin de ABS +cuando se alcanza el estado es-tacionario111.

Medida de la capacidad reductora: Mtodo Ferric Reducing/AntioxidantPower, FRAP

Este mtodo evala la capacidad antioxidante de una muestra de acuer-do con su capacidad para reducir (por transferencia electrnica) el Fe+3


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presente en un complejo con un compuesto orgnico: ripyridyltriazine(PZ).

Cuando el hierro es reducido a la forma ferrosa (Fe+2

) toma un colorazul, que presenta un mximo de absorbancia a una longitud de onda a593 nm (figura 5)112.

Figura 5. Reaccin en el Mtodo FRAP.

omado de Prior et al.113

Figura 4. Reaccin con el radical ABTS+.

omado de Huang et al.110

Sntesis de compuestos

La reaccin de sustitucin electroflica aromtica es una de las mejores

formas de introducir grupos funcionales dentro de un anillo aromtico.


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Esta reaccin consiste en la sustitucin de un hidrgeno del sistema aro-mtico por un electrfilo y representa la reaccin ms importante que su-fren estos sistemas como se muesrea en la figura 6.

Figura 6. Reaccin de sustitucin electrfila aromtica.

omado de Wingrove114.

Mediante esta metodologa se pueden introducir grupos tales como:-NO

2, -SO

3H, -Cl, -Br, -R.

Estas reacciones proceden por el mecanismo tpico de una sustitucin

electroflica aromtica (SEA), el cual se puede visualizar en tres etapas prin-cipalmente:Formacin del electrfiloAtaque de los electrones pdel benceno a este electrfilo yDesprotonacin del catin intermediario 115, 116.

El benceno es normalmente inerte en presencia de halgenos, debidoa que los halgenos no son lo suficientemente electrfilos para destruir

su aromaticidad, sin embargo, estos pueden activarse mediante cidos deLewis como los haluros de hierro, FeX3 o de aluminio, AlX

3, para dar

electrfilos ms potentes. Al hacer una revisin bibliogrfica sobre las vassintticas para la halogenacin de compuestos aromticos polisustituidosen su gran mayora se nos remite a la reaccin de bromacin117.

Bromacin

Algunos de los mtodos reportados para la realizar la bromacin em-plean el bromo en presencia de tetracloruro de carbono o con bromuro dedimetilsulfonio.


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Bromacin con bromo en tetracloruro de carbono. Mtodo realizadopor tratamiento con bromo en presencia de tetracloruro de carbono ycloruro frrico como catalizador.El mecanismo de reaccin es una ilustracin de la secuencia de una sus-

titucin electroflica clsica sobre un anillo aromtico. Figura 7118.

Figura 7. Bromacin con bromo ytetracloruro de carbono en presencia de cloruro frrico.

omado de Carda119.

Bromacin con bromuro de dimetilsulfonio. Los agentes halogena-dos positivos tales como el bromurodimetilsulfonio de bromo son am-pliamente usados en sntesis por su facilidad para su preparacin y di-versas transformaciones en las que se puede usar como rompimiento detioacetales, oxidacin de tioles y principalmente como otra alternativapara la bromacin de bromoarenos, pues presentan altos rendimientosy estereoespecificidad.La reaccin transcurre en varias etapas:

- Formacin del bromurodimetilsulfonio de bromo in situ por medio delmecanismo mostrado en la figura 8.

Figura 8. Bromacin con bromurodimetilsulfonio de bromo in situ.

omado de Majetich120.


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Sustitucin electroflica del agente halogenado positivo al anillo-aromtico121.

Demetilacin

Como resultado de un medio cido en la reaccin de bromacin decompuestos aromticos con sustituyentes metoxi, se produce como subpro-ducto el compuesto demetilado (no publicado antes).

Medicin de la actividad enzimtica

La medicin de la actividad enzimtica de la PPO est dada por su ci-ntica; de esta forma se puede evaluar su disminucin o inhibicin del par-deamiento enzimtico en presencia de los antioxidantes sintetizados122-124.

Cintica

La velocidad a la que ocurre una reaccin catalizada por una enzima estdeterminada por un nmero de factores tanto inherentes como externosa ella. Se han desarrollado varios mtodos matemticos agrupados bajoel trmino de cintica para la cuantificacin de los factores que afectan lavelocidad de reaccin125.

La medida de la cintica enzimtica es de inters por dos razonesprincipales:

Para caracterizar una enzima individual y proveer datos acerca del fun-cionamiento de la enzima bajo diferentes condiciones fisiolgicas.

Para proveer informacin acerca del mecanismo de catlisis 126.

La velocidad a la cual una enzima cataliza una reaccin es conocida

como actividad127

. La actividad enzimtica puede ser medida por la velo-cidad de formacin de productos o desaparicin de reactivos en presenciade una cantidad de enzima dada; tiene ms ventajas en la mayora de loscasos seguir la formacin de productos mediante incrementos finitos quepequeos decrecimientos de una concentracin inicial.

Teora Michaelis Menten

La teora del estado estacionario de la cintica enzimtica fue desarro-llada por L. Michaelis y M. Menten in 1913, con modificaciones hechaspor G. Briggs y J. B. S. Haldane en 1925128. En este modelo, la enzima se


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combina reversiblemente con su sustrato para formar el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto,hecho que regenera a la enzima. El modelo para una molcula de sustratose muestra a continuacin:

(4)

Donde: S es el sustrato E es la enzima ES es el complejo enzima sustrato o complejo de Michaelis y

Menten

k1,k-1y k2 son las constantes de velocidad de la reaccin.La ecuacin de Michaelis y Menten describe cmo vara la velocidad de

reaccin con la concentracin de sustrato:

(5)

Esta ecuacin describe una reaccin en la cual un solo sustrato produceun solo producto. As:

v es la velocidad inicial de la reaccinV

mxes la velocidad mxima

KM

es la constante de Michaelis y Menten= k1+k

2/k

1

[S] es la concentracin de sustrato129.

Existen varias suposiciones que consideran la teora del estado estacio-nario. La primera es que la enzima y el sustrato forman un complejo, [ES].La segunda es que la concentracin del complejo [ES] no cambia con eltiempo. Por ltimo, la concentracin de sustrato [S] no cambia signifi-

cativamente durante la reaccin debido a que la cantidad de S es muchomayor que la de E, de tal manera que la cantidad de sustrato unido a laenzima en cualquier momento es muy pequea130.

Para el anlisis de reacciones enzimticas, slo se utiliza la velocidadinicial de la reaccin, que es la velocidad ejercida por la enzima, inmediata-mente despus de que se ha puesto en contacto con el sustrato y hasta antesde que se haya consumido el 10 % de la concentracin inicial del mismo.La razn de lo anterior es que en ese momento la concentracin del pro-

ducto de la reaccin que se ha acumulado es muy pequea y, por tanto, la


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reaccin en el sentido inverso, es decir, la transformacin del producto enel sustrato original puede ser ignorada131.

De acuerdo con la ecuacin del estado estacionario, la velocidad de re-accin, v, incrementar proporcionalmente con el aumento de S, como esmostrado en la figura 9. Sin embargo, en la prctica, esto puede ser verdadsobre un rango limitado de concentracin de enzima. Para obtener buenalinealidad deben procurarse las condiciones de reaccin tales que la for-macin de producto sea lineal con el tiempo (reaccin de orden 1), y estanecesita ser directamente observada o establecida para la estandarizacinde las condiciones en un ensayo nuevo132.

Figura 9. Efecto de la concentracin del sustratosobre la velocidad de reaccin. Ecuacin de Michaelis Menten.

omado de ipton133.

La grfica muestra una curva hiperblica que aproxima a un valor mxi-mo para v, correspondiente a una concentracin infinita de S. Este valores la velocidad mxima de reaccin o V

max. La velocidad mxima puede ser

definida como la reaccin de velocidad cuando la enzima es completamen-te saturada con el sustrato. De la ecuacin en estado estacionario, se puedever que K

Mes numricamente igual a la concentracin de sustrato donde

la velocidad de reaccin es la mitad de la Vmax

(KM

= Vmax

/2).La constante KM es caracterstica de una enzima particular para un sus-

trato y est dada en unidades de concentracin. Cuando comparan par-metros cinticos de diferentes enzimas, K

Mrefleja la afinidad de la enzima

por ese sustrato; un valor numrico pequeo refleja una alta afinidad dela enzima por su sustrato porque a una baja concentracin del mismo, laenzima ha desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima.


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Cuando se grafica la velocidad de la reaccin, v, contra la concentra-cin de substrato, [S], no siempre es posible determinar la condicin enque se ha llegado a la velocidad mxima, V

mx

, debido al incremento de lapendiente en la hiprbola a concentraciones de sustrato elevadas. Por talmotivo, se puede presentar un ajuste al modelo de Michaelis-Menten134.

2.8.3 Cintica enzimtica en presencia de un inhibidor. Una granvariedad de compuestos naturales y sintticos tienen la capacidad de unirsereversible e irreversiblemente a enzimas especficas y alterar su actividad.Los inhibidores competitivos, no competitivos e incompetitivos son rever-sibles135.

2.8.3.1 Inhibidores reversibles, Inhibidores competitivos. Un com-puesto que puede estar o no relacionado estructuralmente con el sustratonatural se une reversiblemente con la enzima en o cerca al sitio activo; lainhibicin ser competitiva entre el sustrato y el inhibidor. Los inhibidorescompetitivos son comunes en la naturaleza136.

Una forma de medir el efecto del inhibidor es mediante la medida develocidad enzimtica para una variedad de concentraciones de sustrato enpresencia y ausencia de un inhibidor. En este caso, el inhibidor sustancial-

mente reduce la velocidad de la enzima a bajas concentraciones de sustrato,pero no la altera mucho a concentraciones altas137.

El inhibidor no altera Vmax, pero incrementa el valor de KM(tambinllamada K

Maparente). La K

Mobservada est dada por la siguiente ecuacin:

Inhibidores no competitivos. Los compuestos que se unen reversible-mente con la enzima o el complejo enzima sustrato se conocen comoinhibidores no competitivos. Esta inhibicin no es revertida comple-tamente con el aumento de sustrato. Dado que el sitio de unin delinhibidor no es idntico al sitio activo, ni modifica a ste directamente,la K

Mno se altera, pero V

maxdisminuye con respecto a la observada en

ausencia del inhibidor138.Inhibidores incompetitivos. Los compuestos que se combinan rever-

siblemente slo con el complejo ES pero no con la enzima libre se co-


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nocen como inhibidores incompetitivos. Este tipo de inhibicin no essuperada con altas concentraciones de sustrato, y la KM aparente enpresencia de un inhibidor es ms pequea que el valor de la K

M

noinhibida139.Un inhibidor que es unido covalentemente a la enzima inactivndolairreversiblemente es llamado irreversible o inactivador140.

Inhibidores irreversibles.

Un inhibidor irreversible forma un enlace covalente con un grupo fun-cional especfico, por lo general una cadena lateral de un aminocido que,de alguna manera, se asocia con la actividad cataltica de la enzima. Uninhibidor irreversible no puede ser liberado por dilucin o dilisis; sus efec-tos no pueden ser revertidos simplemente al aumentar la concentracin delsustrato. La velocidad de la reaccin disminuye a un nivel que correspondecon la fraccin de las molculas de enzimas que han sido inactivadas141.

Las diferencias bsicas entre inhibicin reversible e irreversible estnresumidas en la tabla 1142.

Tabla 1. Algunas diferencias bsicas entre inhibidores reversibles e irreversibles.

Ecuacin bsicaConstante

cinticaVelocidad

de inhibicin

reversibilidad

In vitro In vivo

Reversible

E + I

Usualmenterpida

DilucinDilisis:

Filtracin gel

Eliminacin deinhibidores libres

IrreversibleE + I

kFrecuentemente

lentaNinguna

Sntesis de msenzima

omado de K. F.143

Mtodos para la medicin del pardeamiento enzimtico

Los mtodos disponibles para determinar la susceptibilidad de pardea-miento son la espectrometra de absorcin o mtodos de reflactancia. Lastcnicas de absorcin involucran la medida espectrofotomtrica sobre solu-ciones obtenidas despus de separar los tejidos y remover los slidos. alesmedidas estiman los pigmentos solubles y suelen estar presentes cerca de


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400 nm, correspondientes a la absorcin mxima del catecol. La medidade los pigmentos polimerizados y solubles unidos a membranas puede serevaluada por medidas de reflactancia sobre la fraccin insoluble144. Actual-mente existen varias tcnicas que aplican este mismo principio, como es elmtodo Pizzocaro145,146.

Metodologa

La metodologa seguida en la sntesis y estudio del efecto inhibidor delpardeamiento enzimtico fue:

Sntesis de compuestos (modificaciones estructurales del Isoes-

pintanol)Sntesis de 2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol.

Se sigui el procedimiento citado por Majetich et al.147.

Figura 10. Bromacin y demetilacin del isoespintanol Majetich et al.148

La bromacin se llev a cabo mediante la mezcla de 500 mg de isoes-pintanol en 15 ml de dimetil sulfxido (DMSO), y 5 ml de cido bromh-drico al 48% adicionado gota a gota. La reaccin se produjo a temperatu-ra ambiente, durante 6 horas;la desaparicin del reactivo esseguida porcromatografa de placa fina con un eluente diclorometano:hexano (3:7).La reaccin se detiene con una solucin saturada de bicarbonato de sodioy los productos fueron aislados usando extracciones con diclorometano,


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seguido por la adicin de sulfato de sodio anhdrido, para luego ser con-centrada bajo presin reducida. Finalmente, el compuesto es separado porcromatografa de columna diclorometano: hexano (80:20) como eluentey cromatografa de capa fina (ciclohexano:diclorometano 7:3 al 1% demetanol).

Sntesis de 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno.

La demetilacin del isoespintanol para la obtencin del 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno se obtuvo en forma paralela a la reaccinde bromacin. El compuesto fue separado por cromatografia de placa fina

(ciclohexano: diclorometano 7:3).Luego de la purificacin de los compuestos, condicin indispensable en

la evaluacin de actividad antioxidante, se realiz la caracterizacin por lassiguientes tcnicas de anlisis instrumental:

Espectroscopia de resonancia magntica nuclear 1H y 13C, en un espec-trmetro de 300 MHz marca BRUKER modelo AM-300, utilizandocomo solvente cloroformo deuterado.

Cromatografa gases-masas, en un cromatgrafo de gases marca Agilent

6890N con un detector selectivo de masas marca Agilent 5973, acopla-do a un Chemstation Hardware.

Medicin de la actividad antioxidante

La evaluacin de la capacidad antioxidante de los compuestos sinteti-zados se bas en dos mtodos productores de un radical orgnico y otrobasado en la xido-reduccin de iones metlicos. Las muestras fueron pre-paradas en DMSO. Los procedimientos son descritos a continuacin:

DPPH (Radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo).

El mtodo se llev a cabo segn el protocolo de Cavin149. La mues-tra de anlisis consisti en 10 mL de extracto y 990 mL de la disolucinde DPPH (20 mg/L). Se evalu por cuadruplicado y como referencia delreactivo se us la misma cantidad de DPPH y 10 mL del solvente de lamuestra. Se produjo un blanco, reemplazando el cromforo por metanol.La absorbancia se ley a una longitud de onda de 517nm, luego de 30 mi-nutos de reaccin a temperatura ambiente y en la oscuridad.


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El porcentaje de inhibicin se calcul de la siguiente manera:

(7)

Abs: Absorbancia

Para cada compuesto se determin la concentracin inhibitoria 50(IC

50), que se define como la concentracin de muestra requerida para dis-

minuir en un 50% el contenido inicial del radical DPPH, y se determinpor medio de la grfica Porcentaje de inhibicin contra concentracin deextracto150.

ABTS (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio).

El radical ABS+ se produjo utilizando una mezcla de reaccin quecontiene ABS (3,5 mM) y persulfato de potasio (1,25 mM) en aguadestilada. La mezcla de reaccin se prepar 12 horas antes de su uso y semantuvo a temperatura ambiente y en ausencia de luz. En el momento derealizar las mediciones, esta solucin se diluy en buffer fosfato a un pH de7.4, hasta lograr una absorbancia de 0.7 unidades a 734 nm.

En la evaluacin de los compuestos se utilizaron 20 l de muestra y 980l de la solucin del radical ABS+. Luego de 30 minutos de reaccin,tiempo necesario para a temperatura ambiente y en la oscuridad, se mi-di el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo, a unalongitud de onda de 734nm. La referencia del reactivo consisti en unasolucin del radical ABS+con el solvente de la muestra (DMSO).

Se determin igualmente la concentracin necesaria para disminuir enun 50% el contenido inicial del radical ABTS+ (IC50)

151, de la misma

manera que en la prueba DPPH.Mtodo FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power).

Este ensayo se llev a cabo en buffer actico-acetato de sodio 0.3M a unpH de 3.4, que contiene PZ (1mM) y FeCl3(2mM). Se utilizan 900 lde esta solucin, 50 l de muestra y 50 l de buffer acetato pH 3.6. Luegode 30 minutos de reaccin se determina la absorbancia a una longitud deonda de 593nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la absor-bancia del blanco sin cromforo, de la misma manera que en las pruebasanteriores. La curva de referencia se construy usando cido ascrbico en


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un rango de concentraciones de 5-40 M. Las actividades de las muestrasen estudio se expresan como AEAC (capacidad antioxidante en equiva-lentes de cido ascrbico: mol cido ascrbico /g muestra), valor que seobtiene al interpolar los resultados de las muestras en la curva referencia(Absorbancia contra concentracin de cido ascrbico)152.

Medicin del efecto inhibidor del pardeamiento enzimtico de losantioxidantes sobre la polifenol oxidasa en el extracto enzimticode banano

Determinacin de parmetros cinticos e inhibicin de pardeamiento enzimtico

Las muestras utilizadas en este trabajo fueron adquiridas en fruteras dela ciudad de Medelln. Se utiliz la especie Musa Sapientum o comnmen-te conocida como banano variedad Cavendish Gigante (ipo exportacin).Las muestras de banano fueron amarillo-verdosas. Grado de maduracin4153correspondiente a 18 Brix.

Extraccin de la enzima. La extraccin parcial se realiz con base en elprocedimiento de Palmer154con algunas modificaciones en la centrifu-gacin y el detergente usado: en un homogenizador (marca B. Braun) semezclaron 2 g de la fruta madura y pelada con 18 ml de buffer fosfato

(0,1 M, pH 7.0), el cual, contena detergente riton 100X al 1%.El homogenato fue centrifugado (centrfuga marca Heraeus) durante25 minutos a 16.060 g y 4C; el sobrenadante fue filtrado con papel fil-tro Schleicher & Schuell 589/1. El filtrado se constituy en el extractoenzimtico utilizado en el trabajo cintico. Durante todas las operacio-nes de extraccin, las temperaturas fueron inferiores a 4C.Ensayo de actividad de la PPO. La actividad de la enzima fue determi-nada siguiendo el mtodo de Pizzocaro modificado155; se us un espec-

trofotmetro Shimadzu UV-160 y se hizo el monitoreo a 420 nm y a30C. La mezcla de reaccin consisti en 1 ml de buffer fosfato 0.1 pH6.0, 0.5 ml de dopamina (0.18 mol/L) y 0.25 ml de extracto de enzima.El cambio en absorbancia fue registrado cada 15 s durante 3 min. Laporcin lineal obtenida del grfico de absorbancia en funcin del tiem-po fue usada para el clculo de la actividad de la PPO. Una unidad dela actividad de PPO fue definida como 0.001 DA420/min/ml. odos losextractos fueron analizados por triplicado.Parmetros cinticos. Los valores de las constantes cinticas K

M

y Vmx

se calcularon mediante el mtodo grfico de LINEWEAVER-BURK.


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Tabla 2. Volmenes de reactivos usados para la determinacin de losparmetros cinticos, K

My Vmax.

Reactivo Blanco Ensayo

Buffer fosfato pH 6.0 1.0 ml 1.0 ml

Agua destilada 0.5 ml -

Extracto enzimtico 0.25 ml 0.25 mlDopamina

(0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.14,0.18,0.22,0.26) M -0.5 ml

Datos establecidos por los autores.

Efecto de inhibidores. Se estudi la inhibicin de la enzima usando

cido ascrbico (como referencia comercial), isoespintanol, el compues-to bromado y el demetilado. Las concentraciones del inhibidor fueron:500 (mximo recomendado por la norma)156, 1000 y 1500 ppm (con-centraciones antes usadas para evaluar inhibicin de pardeamiento enfrutas)157,158. En todos los casos el sustrato oxidable fue dopamina 0,18M en buffer fosfato 0,1 M. La actividad enzimtica se determin me-diante el mtodo colorimtrico a 420 nm y una temperatura de 30C.

Tabla 3. Volmenes de reactivos usados para la determinacin de laactividad enzimtica en presencia de inhibidores sobre extracto de banano.

Reactivo Blanco Ensayo

Buffer fosfato pH 6.0 0.5 ml 1.0 ml

Agua destilada 0.5 ml -

Extracto enzimtico 0.25 ml 0.25 ml

Dopamina - 0.5 ml

Antioxidante 0.5 ml 0.5 ml

Datos establecidos por los autores.

Anlisis de resultados

Sntesis

Inicialmente se realizaron las modificaciones sintticas al 2-isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol, hasta obtener dos compuestos:

2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol.

3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno.


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La relacin entre el compuesto bromado y el demetilado fue 75:25,respectivamente.

Informacin general de los dos compuestos

Solubilidad. Ambos compuestos son insolubles en agua. Para las prue-bas de inhibicin enzimtica se trabaj en un medio etanlico.Punto de Fusin. Se tomaron los puntos de fusin (tabla 4), debido alos altos puntos de fusin que presentan la mayora de los compuestosfenlicos donde es conveniente derivatizarlos para obtener sustanciasms volatilizables y trmicamente ms estables, para facilitar su anlisisen mezclas mediante GC o GC-MS159.

Tabla 4. Puntos de fusin del compuesto bromado y demetilado

Compuesto Punto de fusin (C)

Bromado 127 128

Demetilado 112 113

Datos hallados por los autores.

Segn los datos obtenidos, los puntos de fusin estn dentro del rangode temperaturas a las cuales se pueden trabajar con la columna del GC-MS(HP5) que alcanza una temperatura mxima de 300C, sin necesidad deuna derivatizacin previa.

Color. El compuesto bromado presenta una coloracin naranja, y eldemetilado es amarillo.Estructura. Cada una de las estructuras de las molculas fueron optimi-

zadas en el programa Gaussian 03160

, a un nivel B3LYP/6-311G(d,p).Figura 11.La estructura optimizada permiti observar las distancias entre el H

8y

el C9, donde se observa una posible formacin de un puente de hidrgeno

intramolecular, con una mayor probabilidad en el siguiente orden: isoes-pintanol > demetilado >bromado.


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Figura 11. Estructura optimizada del isoespintanol (a),compuesto demetilado (b) y bromado (c) a un nivel B3LYP/6-311G(d,p).Estructuras logradas por los autores con el programa Gaussian 03,

Revision B.05. 2003, Gaussian, Inc.

Pureza. Los resultados del anlisis de pureza obtenidos por cromatogra-fa de gases acoplada a masas, GC-MS, fueron:2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol: 90.8%-3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno: 99.1%-La pureza obtenida para los dos compuestos es suficiente para el anlisis

de inhibicin enzimtica en la que fueron probados.

Resultados de anlisis instrumental

Las tcnicas de anlisis instrumental utilizadas para caracterizar loscompuestos fueron:

Cromatografa gaseosa acoplada a masas, GC-MS.Resonancia magntica nuclear, RMN de 13C e 1H.

Cromatografia gases-masas

La tcnica acoplada GC-MS permiti obtener el espectro de masas yaunque esta es una tcnica fundamental para obtener informacin estruc-tural de los compuestos161, en este caso no se encontraron en las bases de


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datos las estructuras objeto de estudio, debido a que los compuestos nohan sido reportados por la literatura. Por tal razn, la base de identificacinfueron sus pesos moleculares y el anlisis de cada uno de sus espectros demasas, partiendo de la estructura esperada.

Los cromatogramas de las figuras 12, 13 y 14 permiten observar el tiem-po de retencin del isoespintanol, y los compuestos sintetizados, sus posiblescontaminantes, al igual que el porcentaje de pureza para cada uno.

Figura 12. Cromatograma de 2-isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol obtenido por los autores.

Figura 13. Cromatograma de 2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol obtenido por los autores.


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La ausencia de un pico a un tiempo de retencin 19.13 (isoespintanol)en las figuras 13 y 14, es la forma de garantizar la presencia de un slocompuesto con posible actividad antioxidante (figura 15).

Figura 14. Cromatograma de 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno obtenido por los autores.

Figura 15. Cromatograma superpuesto de 2-isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol162, 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno163y 2-isopropil-

4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol164obtenido por los autores.

Los fraccionamientos de masas de cada uno de los compuestos muestranque debido a la presencia de un anillo aromtico en todas las estructuras,los espectros de masa tienen iones moleculares intensos, lo que facilit la


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determinacin de su peso molecular. En el espectro de masas del compues-to bromado se distingue un pico base M+2 igual al pico M+ caractersticode este tipo de compuestos165.

Espectroscopia de resonancia magntica nuclear

Muchos compuestos se pueden caracterizar qumicamente a partir delos datos de cromatografa de gases y los espectros de masas cuando secuenta con los compuestos de referencia en la base de datos, pero cuandoexisten dudas de tal caracterizacin se recurre a los mtodos espectralestradicionales como infrarrojo, ultravioleta y resonancia magntica nuclear.Por tal razn, se determinaron los espectros de RMN 1H y 13C.

Los espectros de RMN 1H y 13C revelan la presencia de los grupos-OCH

3, CH

3, OH, CH y C aromticos, respectivamente.

A continuacin se describen los desplazamientos correspondientes alos RMN 1H y 13C del 3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno y del2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol.

2-isopropil-4-bromo-3,6-dimetoxi-5-metilfenol

*HNMR (400 MHz, CDCI3) 1.34 (d, J= 7.2 Hz, 3H, H-8), 1.37(d,J= 7.2 Hz, 3H, H-9), 2.33 (s, 3H, H-10), 3.44 (m, 1H, H-7), 3.75 (s,3H, H-11), 3.78 (s, 3H, H-12), 5.80 (s, 1H, OH). 13C NMR (100 MHz,CDCl

3,) 16.4 (C-10), 20.8 (C-8 y C-9), 26.6 (C-7), 61.2 (C-11), 61.4

(C-12), 110.4 (C-4), 126.6 (C-2), 128.5 (C-5), 142.6 (C-3), 147.5 (C-5).EI-MS m/z 288 (97), 290 (94), 273 (20), 275 (19).

3-isopropil-6-metil-1,2,4-trihidroxibenceno

1H NMR (CDCI3, 400 MHz) 1.13 (d,J= 7.2 Hz, 3H, H-8), 1.14 (d,J= 7.2 Hz, 3H, H-9), 2.08 (s, 3H, H-10), 3.20 (m, 1H, H-7), 6.48 (s, 1H,H-5), 6.96 (s, 2H, OH, C-2 y C-4), 7.28 (s, 1H, C-1)13CNMR(CDCl3,100 MHz) 15.0 (x-10), 20.2 (X-8 xp X-9), 24.5 (X-7), 125.9 (X-5),136.2 (X-3), 136.4 (X-6), 140.9 (X-2), 51.2 (x-4), 187.7 (X-1). EI-MSm/z 182 [M]+(5), 180 (100), 165 (25), 137 (47).

Los resultados de RMN 1H y 13C fueron satisfactorios, teniendo encuenta que la presencia de los grupos se encuentra entre los intervalos delos reportados en la literatura166.


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Capacidad antioxidante

En la literatura se encuentra ampliamente referenciada la necesidad de

utilizar ms de un mtodo cuando se evala la capacidad antioxidante deextractos vegetales, debido a que los antioxidantes pueden actuar por meca-nismos diferentes167,168, dependiendo del sistema de reaccin o de la fuenteradicalaria169. Los antioxidantes pueden, adems, variar en su solubilidady localizacin de fase, su potencial redox y su especificidad y mecanismode accin, por lo que ensayos con diferentes caractersticas pueden brindaruna informacin ms completa al respecto. En este caso, los tres ensayosutilizados evalan la capacidad reductora de las muestras, al actuar sobreradicales preformados en diferentes fases170,171.

El imol fue tomado como referencia para las mediciones de capaci-dad antioxidante por su actividad antioxidante172-174y ser un compuestofenlico de estructura similar al del Isoespintanol. El timol, a diferenciadel isoespintanol, no presenta los dos grupos -OCH

3en posiciones orto y

meta, como se muestra en la figura 16.

Figura 16. Estructura del Timol.Estructura elaborada por autores en el programa Chemdraw.

Actividad atrapadora del radical libre DPPH..

Se determin la concentracin inhibitoria 50 (IC50

) del isoespintanol(compuesto modificado), timol (compuesto de referencia) y el compuestobromado y demetilado (compuestos sintetizados). Los valores obtenidosse observan en la tabla 5. Un menor valor indicara una mayor capacidadantioxidante.


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El DPPHes un radical estable que tiene un color prpura en mediometanlico, el cual es decolorado por la accin del antioxidante. Este en-sayo es riguroso debido al impedimento estrico en la molcula de DPPHy esto es determinante para la reaccin. Este ensayo es el ms usado en laliteratura cientfica para medir la capacidad de interaccin de compuestoso extractos con radicales libres175.

Los resultados obtenidos en este ensayo muestran que el isoespintanoltiene la mejor actividad antioxidante, seguido por el compuesto demetila-do, en comparacin con el compuesto de referencia o timol. Los resultadosdel bromado estn muy por encima de la referencia, esto debido posible-mente al gran impedimento estrico que se presenta entre ste y la mol-cula de DPPH, por la presencia de un sustituyente de alto tamao at-mico (-Br) en el anillo fenlico176. Adems, es importante la distribucindel compuesto en el medio metanlico, el isoespintanol es una molculalipoflica, la cual, se distribuye mucho mejor que los otros compuestos,interactuando ms fcil con el radical DPPH.

Ensayo de decoloracin con el radical catinico ABTS+

Para estos compuestos se calcul el IC50

, y se encontr un comporta-miento similar entre el isoespintanol, bromado y timol 11.43, 22.2 y 9.32M, respectivamente.

La capacidad para atrapar el radical libre ABS+en medio acuoso de-pende de la energa de disociacin del enlace, BDE-OH, que en el casodel timol y del isoepintanol son similares (-3,11 y -5,32 Kcal/mol conrespecto al fenol 82.89 Kcal/mol),177y valores semejantes se esperan para

Tabla 5. Actividad antioxidante del isoespintanol, compuesto bromado,demetilado y el timol por los mtodos DPPH, ABTS+ y FRAP. Datos

hallados por los autores.

COMPUESTOABTS

IC50 (M)DPPH

IC50 (M )

FRAP AEAC(g de Ac. Asc./

100g de muestra)

Isoespintanol 11.43 295.2 25 65.91

Bromado 22.2 1069.44 73.00

Demetilado 103.63 448.90 14.782

Timol 9.32 656.2 45 27


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el compuesto bromado. La energia de disociacin del enlace O-H estadeterminada por los diferentes efectos causados por la naturaleza de lossustituyentes178en las molculas y por los enlaces intra e intermolecularesque compromenten el enlace O-H179.

Prueba FRAP (Ferric Reducing/ Antioxidant Power)

El mtodo FRAP es muy usado para medir potencial reductor en plas-ma y capacidad reductora de diferentes extractos y compuestos puros180.Los resultados experimentales para el isoespintanol y timol son expresadoscomo valor FRAP y son equivalentes a los g de cido ascrbico por cada100 gramos del compuesto antioxidante. Los valores FRAP para el Isoes-pintanol, bromado, demetilado y timol son: 65.91, 73, 14.78, 27 g/100 gde muestra, respectivamente (tabla 9).

El compuesto bromado presenta la capacidad reductora ms alta. Estevalor puede estar determinado por la capacidad para donar electrones delbromo181, que le dan una mayor densidad electrnica al enlace O-H182, yson ms susceptibles al ataque de agentes oxidantes como los radicales li-bres o metales como el Fe3+que es el sitio activo en la metodologa FRAP.

El isoespintanol y el compuesto bromado en los ensayos ABS y FRAPson ms activos como antioxidantes que el timol. La mayor actividad deestos compuestos est influenciada por los efectos de los sustituyentes y laformacin de puentes de hidrgeno intra e intermoleculares. El timol for-ma puentes de hidrgeno intermoleculares lineales con el solvente (agua ometanol) que disminuyen la interaccin con los radicales libres, disminu-yendo as, su actividad. En el caso del isoespintanol, hay una competenciaentre la formacin de puentes intermoleculares lineales con el solvente y laformacin de puentes intramoleculares no lineales con el grupo metoxiloen posicin orto (figura 15); es decir, el centro reactivo del isoespintanol(enlace O-H), queda ms dispuesto para ceder electrones a radicales libresy otras especies oxidantes, aumentando su actividad antioxidante respectoal timol.

De los compuestos evaluados, el isoespintanol exhibi el potencial mspromisorio como antioxidante, teniendo en cuenta que en las tres tcnicaspresent actividad significativa con respecto al timol. Si se considera queen cada mtodo las condiciones de reaccin y solubilidad son diferentes,dicho extracto podra presentar varios compuestos activos en un amplio


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rango de su perfil metablico, de diferente polaridad, lo cual significa quehay una fuente mayor de metabolitos con potencial antioxidante en esta

especie; fue por esta razn que se escogi como un compuesto de estudiocon diferentes sustituyentes. Para sus anlogos hay una accin similar, sloque se ve favorecida por el medio para el bromado en la prueba de FRAPy para el compuesto demetilado DPPH.

La reaccin con el DPPH es ms selectiva que las reacciones que ocu-rren en los mtodos ABS y FRAP. Es decir, como compuestos que con-tengan cidos aromticos con 1 solo grupo OH no reaccionaran con elradical DPPH, pero s lo haran con el radical ABS183. Se esperara en-

tonces que compuestos que reaccionen con el DPPH reaccionen tambincon el ABS.

Inhibicin de pardeamiento enzimtico

Se utiliz un mismo extracto para medir la actividad enzimtica. SegnPalmer184, el extracto con detergente usualmente retiene hasta el 90% desu actividad durante dos semanas entre 2 y 5 C; por esta razn los ensayosse llevaron a cabo en 4 das.

El banano contiene diferentes enzimas como laccasa, monoamina oxi-dasas, citocromo o peroxidasa; sin embargo, el extracto obtenido est librede cantidades significativas para interferir en la determinacin de la activi-dad185. Una vez solucionada esta interferencia, se iniciaron las medicionesde los parmetros cinticos para dar a conocer las condiciones ptimas delensayo.

Estudios previos muestran que monofenoles tales como tirosina, o-cre-sol op-cresol no son oxidados por la PPO en la pulpa de banano. En nues-tro trabajo los ensayos se llevaron a cabo con dopamina como sustrato, porser este el mejor, segn los reportes en la literatura186-188. Como se muestraen la figura 17, el valor de K

Mde la enzima parcialmente purificada para

la oxidacin de la dopamina es de 2,6 x 10 -2M mucho ms alto que 6.3x 10-4M reportada por Palmer189para la enzima parcialmente purificadaextrada de musa acuminata, var. Hort. Gros Michel y la enzima purificadacompletamente de la Musa Sapientum L., donde se reporta un valor de2.8 10-3M190, estas diferencias son evidencia de la variacin entre cadavariedad de la fruta.


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Vmx 1,44E-02

Km 0,026057171[S] 0,052114342

Figura 17. Grfico Lineweaver-Burk de la oxidacin de dopamina por laenzima. V, velocidad de oxidacin; concentracin de sustrato.

Grfico constrido por los autores.

Inhibicin del pardeamiento enzimtico en presencia de antioxidantes (broma-

do y demetilado) en comparacin con el cido ascrbico e isoespintanol.

La inhibicin de la actividad en el extracto parcialmente purificado ob-tenido del banano en presencia del isoespintanol y dos de sus anlogos(compuesto demetilado y bromado) y el cido ascrbico como referenciacomercial es reportada en la tabla 6 y los promedios en la figura 18, res-pectivamente.

Figura 18. Promedio de la inhibicin de la actividad de la PPO en bananopor medio del isoespintanol y dos de sus anlogos (demetilado y bromado) y

cido ascrbico. Figura elaborada por los autores.


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Tabla6.Inh

ibicindelaactividaddelaPPOen

bananopormediodelisoespintanoly

d

osdesusanlogos(demetiladoybromado)ycidoascrbico.

COMPUESTO

CONCENTRACIN(ppm)

ACTIV

IDADENZIMTICA*

Abs420

/min/ml)

POR

CENTAJE

DEIN

HIBICIN

DESVIACIN

ESTNDAR

CONTROL

-

102.93

g

-

5.1

BROMADO

500

15.2a

84.8

1.1

1000

26.13

b

73.87

2.4

1500

16

a

84

2.8

DEMETILADO

500

15.47

a

84.53

1.8

1000

27.46

b

72.53

3.2

1500

17.6a

82.4

0

ISOESPINTANOL

500

20.27

c

79.73

6.1

1000

57.60

d

42.4

0

1500

26.4c

73.6

1.1

CIDO

ASCRBICO

500

24.53

c

75.47

2.4

1000

10.8e

89.2

0.6

1500

8f

92

3.2

*Losvaloresdeactividadesconiguals

ubndiceindicanquenoexistendiferenciasestadsticamentesignificativas,entreellas.Paraelcasocontrario,sexisten

dife

renciassignificativasP0.05). Los patrones de referencia (isoespinta-nol y cido ascbico) presentaron diferencias significativas (P

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extrada del banano.La mayor inhibicin de la actividad de la PPO en el extracto enzimtico

del banano se logr a 1500 ppm de cido ascrbico. El compuesto bro-mado y el demetilado lograron la misma accin protectora a 500 ppm,inhibiendo el 84% de la actividad enzimtica, valor 6% por debajo delobtenido con el cido ascrbico a altas concentraciones.Las modificaciones sintticas del isoespintanol aumentaron la inhibi-cin de la PPO ligeramente a 500 y 1500 ppm, pero significativamentea 1000 ppm.El isoespintanol presenta una inhibicin competitiva y el cido ascrbi-

co acta como reductor.El isoespintanol como compuesto natural y sus anlogos representanuna nueva alternativa como fuente inhibidora del pardeamiento enzi-mtico.

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