RESUMEN GENERAL DE CLASES DE BIOQUÍMICA

TEMA 1: AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

Las proteínas tienen una serie de funciones:

Función catalítica: Enzimas. Recuérdese que no todas las enzimas son proteínas (como el RNA) o que no todas las proteínas son enzimas.

Inmunoglobulinas: Anticuerpos, sistema inmune (función de defensa). Transporte: Para movimiento de material (por ejemplo: el transporte de oxígeno realizado por

la hemoglobina). Regulatoria: Hormonas, control del metabolismo. Estructural: Soporte, piel, pelo, uñas, proteínas contráctiles. Movimiento: Músculo. Recepción: Ligan o reciben sustancias específicas (por ejemplo la unión entre una molécula y

su receptor proteínico para que suceda alguna reacción química).

Algunos ejemplos de integración de las funciones proteínicas son los siguientes:

Cuando la glucosa necesita ingresar a la célula, requiere un receptor (función receptora) para atravesar la membrana celular (que es de carácter hidrofóbico), por medio de un canal proteínico (función de transporte) que es hidrofílico (puesto que la glucosa igualmente lo es). Luego de ello, la glucosa ingresa al citosol para iniciar sus procesos metabólicos que son llevados a cabo por enzimas (función catalítica).

La insulina requiere un receptor membranal (función de recepción) para así iniciar una serie de reacciones bioquímicas que disparan un conjunto de señales (función de señalización o marcadores).

La luciérnaga, gracias a la enzima luciferasa es capaz de producir luz en caso de que tenga energía en abundancia.

El cuerno de rinoceronte, de amplio uso en la industria de colágeno, se hidroliza en el cuerpo gracias a la presencia de enzimas.

Aminoácidos:

Los aminoácidos son las unidades monoméricas más simples de las proteínas. Las proteínas están conformadas por uniones lineales covalentes de aminoácidos. Los grupos radicales de los aminoácidos son los encargados de conferir propiedades específicas a las proteínas.

Cuando un aminoácido se une a otro, se denomina residuo, porque pierde parte de sus características en la unión (por medio del enlace peptídico). La estructura básica de un aminoácido es la que se encuentra a continuación:

Figura 1. Estructura básica de un aminoácido. El carbono central se denomina carbono alfa (α) mientras que el carboxilo (COO-) unido al carbono alfa se denomina alfa carboxilo, así como el grupo amino (NH3

+) o alfa amino. La excepción es la prolina, que es el único aminoácido cíclico. La glicina es el único aminoácido cuyo radical es el hidrógeno. El carbono central se denomina quiral porque tiene 4 sustituyentes diferentes (exceptuando la glicina). Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

(a) (b)Figura 2. En este resumen, se utilizará éste esquema para efectos prácticos (es decir, colocando el radical en la parte inferior). Para las estructuras, se utilizará la forma (a). Para el enlace peptídico y ejercicios de pKa, se utilizará la forma (b). El que el grupo amino o el carboxilo tengan o no hidrógenos dependerá de si el aminoácido se encuentra en su forma disociada o no. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Como los aminoácidos son ópticamente activos, se clasifican bajo el sistema de Fisher D y L, que tradicionalmente se llamaron dextrógiros (que se mueven en sentido horario) y levógiros (que se mueven en sentido antihorario). Sin embargo, en la actualidad, se han designado como D los que tienen el α-amino a la derecha y L los que tienen el α-amino a la izquierda. Todos los residuos de aminoácidos de las proteínas son de configuración L (sólo en paredes celulares o algunos antibióticos se han encontrado las formas D). Cuando en una mezcla de aminoácidos hay igual cantidad de formas D y L del aminoácido, se denomina mezcla racémica, que no rotan la luz en un plano polarizado.

Los aminoácidos absorben, en general, luz UV de 190 a 220 nm, y en dicha absorción el responsable es el grupo carboxilo. Sin embargo, generalmente la concentración de aminoácidos en las proteínas se mide a 210 o 280 nm (éste último sólo se aplica a soluciones puras de proteínas, no a mezclas; si se tiene una mezcla, debe separarse). Entre mayor sea la absorbancia, mayor es la concentración de proteínas y debe medirse constantemente en técnicas de purificación para verificar que se esté obteniendo la proteína de interés.

Clasificación de Aminoácidos:

Debido a que los grupos R confieren propiedades específicas a los aminoácidos, éstos se han clasificado de acuerdo a dichas propiedades en los siguientes grupos (la ornitina y la citrulina, dos aminoácidos intermediarios del clico de la urea, no se encuentran en las proteínas):

Grupos R apolares alifáticos (apolares): Se caracterizan por ser apolares e hidrofóbicos. Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile) y Alanina (Ala) se agrupan entre sí en las proteínas,

formando interacciones hidrofóbicas. La glicina es el aminoácido más simple del grupo, y su pequeña cadena no contribuye mayormente a interacciones hidrofóbicas. La metionina tiene un grupo apolar tioéter en su estructura (aminoácido azufrado).

La prolina tiene una cadena lateral alifática con estructura apolar cíclica y su grupo amino secundario (imino) forma estructuras rígidas que le restan flexibilidad a los residuos polipeptídicos que la contienen. Asimismo, no puede formar puentes de hidrógeno y desestabiliza las estructuras proteicas.

Figura 3. Estructura química de los 7 aminoácidos alifáticos con carga (apolares). Obsérvese que la glicina es la estructura más simple, la prolina forma un ciclo con un grupo amino secundario y la metionina es un aminoácido azufrado con un grupo tioéter apolar. Leucina e Isoleucina se diferencian por la configuración iso de la segunda. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Grupos R aromáticos (aromáticos): Forman aminoácidos relativamente apolares (por sus cadenas aromáticas) y todos participan en interacciones hidrofóbicas. La tirosina (Tyr) y el Triptófano (Trp) son más hidrofílicos que la Fenilalanina (Phe) por el grupo hidroxilo del primero y el anillo indólico del segundo (que contiene un grupo NH), por lo que éstos dos últimos pueden formar puentes de hidrógeno. Estos aminoácidos absorben la luz ultravioleta de 265 a 285 nm (por lo general, a 280 nm), propiedad utilizada para caracterizar proteínas (en su orden: Triptófano y Tirosina, y en menor medida, Fenilalanina).

Figura 4. Aminoácidos aromáticos. En orden de hidrofobicidad (del mayor al menor) están Fenilalanina, Triptófano y Tirosina. Obsérvese que el hidroxilo de la Tirosina (Tyr) y el anillo indólico del triptófano (Trp) ayudan a que sean más hidrofílicos (o menos hidrofóbicos) que la fenilalanina (Phe), puesto que éstas estructuras les ayudan a formar

posibles puentes de hidrógeno. Todos absorben luz UV (en menor medida Phe) de 265 a 285 nm (generalmente 280 nm). Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Grupos R polares sin carga (polares): Son aminoácidos que son capaces de formar puentes de hidrógeno gracias a sus grupos hidroxilo (para Serina y Treonina), sulfhidrilo (Cisteína) o amidas (Asparagina y Glutamina). Tanto Asparagina como Glutamina se hidrolizan por ácidos o bases a Aspartato y Glutamato (sales).

Figura 5. Aminoácidos polares sin carga. Obsérvense los grupos OH de Serina (Ser) y Treonina (Thr), el grupo sulhidrilo de la Cisteína (Cys) y los grupos amida de Asparagina (Asn) y Glutamina (Gln), los que les confieren el carácter hidrofílico a éstos aminoácidos. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

La cisteína se oxida hacia un aminoácido dimérico unido covalentemente llamado Cistina, que es la responsable del puente o enlace disulfuro, que forman uniones fuertemente hidrofóbicas entre dos polipéptidos o dos secciones de una proteína.

Figura 6. Oxidación de dos moléculas de Cisteína (Cys) a Cistina, conformando así una unión hidrofóbica dimérica conocida como puente disulfuro. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Grupos R cargados positivamente (básicos): Son los más hidrofílicos entre todos los aminoácidos. Lisina se caracteriza por tener un grupo amino primario en su carbono ε, Arginina por tener un grupo guanidino cargado positivamente y la Histidina por tener un anillo imidazol. La Histidina tiene un pKa del anillo cercano a la neutralidad (6,0) , lo que le da

capacidad para actuar como dador o aceptor de protones en reacciones catalizadas por enzimas.

Figura 7. Aminoácidos con grupos R cargados (básicos). Se observa el grupo guanidino positivamente cargado de la Arginina y el anillo de Imidazol de la Histidina. Estos aminoácidos tienen carga neta positiva significativa a pH 7. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Aminoácidos con grupos R cargados negativamente (ácidos): Tienen carga neta negativa a pH 7. Está conformados por el Aspartato (ácido aspártico o Asp) y el Glutamato (ácido glutámico o Glu), que tienen un segundo grupo carboxilo.

Figura 8. Aminoácidos ácidos o con grupo radical cargado negativamente (a pH 7). Ambos tienen un grupo carboxilo adicional en su radical. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Concluyendo, de todos los grupos de aminoácidos se pueden extraer las siguientes particularidades:

CARACTERÍSTICA GENERAL AMINOÁCIDOSAminoácidos Azufrados Metionina (Alifático apolar) Met

Cisteína (Polar, sin carga) CysAminoácidos con grupo OH Tirosina (Aromático) - Tyr

Serina (Polar, sin carga) - Ser Treonina (Polar, sin carga) - Thr

Aminoácidos que pueden formar puentes de hidrógeno (que tengan OH, SH o NH)

Tirosina (Aromático) – Tyr (por su OH) Triptófano (Aromático) – Trp (por si NH

del anillo indólico) Cisteína (Polar, sin carga) - Cys (por SH) Serina (Polar, sin carga) – Ser (por OH) Treonina (Polar, sin carga) – Thr (por OH)

Asparragina (Polar, sin carga) – Asn (COO) Glutamina (Polar, sin carga) – Gln (COO) Lisina (Polar, con carga) – Lys (NH3) Arginina (Polar, con carga) – Arg (NH2) Histidina (Polar, con carga) – Hys (NH)

Aminoácido que forma parte de una cadena cíclica Prolina (Alifático, apolar) – ProAminoácido más simple Glicina (Alifático, Apolar) - GlyAminoácidos que absorben luz a 280 nm Aromáticos (Trp, Phe, Tyr)

Propiedades Ácido-Base de los aminoácidos:

Cuando los aminoácidos se introducen en agua, están en forma de ión dipolar o zwitterión (“ión híbrido” en alemán), por lo que estando así puede actuar como dador de protones (ácido) o aceptor de protones (base):

(a) (b)Figura 9. Aminoácido en su forma de zwitterión, como dador de protones o ácido (a) o como aceptor de

protones o base (b). Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Cuando una sustancia de comporta de forma dual como ácido o base es una sustancia anfótera (conocida como anfolito o electrolito anfótero).

Figura 10. Gráfico del comportamiento de un aminoácido en su forma de zwitterión en relación a las concentraciones de las formas protonadas y desprotonadas de sus grupos ionizables. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Dependiendo de éste comportamiento, es posible calcular el pKa de un aminoácido, es decir, el valor de pH al cual el 50% se encuentra en la forma disociada y el otro 50% en la forma no disociada (equilibrio entre ambas formas). Asimismo, los cálculos de pKa ayudan a determinar el punto isoeléctrico (pI), que se refiere al pH al cual la carga neta del aminoácido es cero (0). En

general, se puede establecer que cuando el pH es alto (hacia la alcalinidad), el grupo amino tiene una carga de cero mientras que el hidroxilo una carga neta de -1. Los aminoácidos Lisina (Lys), Arginina (Arg) e Histidina (Hys) pueden ser desprotonados.

Como ejemplo, se ilustrará el cálculo del pI para el ácido aspártico (Asp), cuyos pKa se encuentran registrados en tablas:

Tabla 1. Valores de pKa para diferentes aminoácidos. Algunos de ellos tienen 3 como consecuencia de la cadena lateral. En la realización de los ejercicios, los valores se ordenan del menor al mayor.

Y la solución del ejercicio, con la curva de titulación, es la siguiente:

Obsérvese en el ejercicio anterior que el Ácido Aspártico tiene 3 pK a. Asimismo, que la curva de titulación se grafica primero en 0,5; luego 1,5; 2,5 y así sucesivamente, para cada pK a. Y el valor del punto isoeléctrico, en el gráfico, se ubica entre el pKa de la carga neta -1 y el pKa de la carga +1 (puesto que en el punto Isoeléctrico la carga neta es 0). Del mismo modo, en cada pKa siempre hay 50% de la forma disociada y 50% de la forma no disociada (como se explicó anteriormente en el concepto). Con esos porcentajes, se pide solucionar las siguientes preguntas:

Indique el pH al cual hay 75% de la forma 3:

Como se observa en el gráfico, en el pK3 (10) y pK2 (3.9), hay 50% de la forma 3. Asimismo, se sabe que a medida que sube la gráfica, la forma 3 se va formando. Por lo tanto:

p H(100%3)=3.9+10−3.92

=6.95

pH (75%3−caso1)=3.9+6.95−3.9

2=5.425

pH(75%3−caso 2)=6.95+10−6.95

2=8,475

Indique el pH al cual hay 25% de la forma 4: Ya se sabe que al 75% de 3, en el caso 2, se forma el 25% de la forma 4, por lo que 8.475 es la única respuesta (no hay más casos del 25% de 4).

Péptidos:

Los péptidos son secuencias de dos hasta 99 (dependiendo de la bibliografía, se encuentra que hasta 20 o 50 aminoácidos) mediante una unión conocida como enlace peptídico. Cuando se unen dos aminoácidos se llama dipéptido, tres es un tripéptido y más de 3 se considera un oligopéptido (cuando son pocos aminoácidos) y polipéptido (cuando son muchos aminoácidos). El enlace peptídico es la unión covalente del grupo carboxilo terminal de un aminoácido con el grupo amino inicial de otro aminoácido, en un proceso de deshidratación que libera 1 molécula de agua (reacción de condensación). Se considera proteínas a las masas de más de 10.000 daltons (10 KD).

Figura 11. Esquema de un enlace peptídico (una reacción de deshidratación). La rotura del enlace peptídico se denomina hidrólisis e implica un rompimiento con participación de moléculas de agua. Cuando no hay un rompimiento, se denomina hidratación. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Al final, se dice que el péptido resultante tiene un extremo amino terminal (N-terminal) y un extremo carboxilo terminal (C-terminal), como se observa en el siguiente gráfico:

Figura 12. Esquema de un seril-glicil-tirosil-alanil-leucina o Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

El enlace peptídico tiene unas propiedades:

Es rígido y planar: Tiene un comportamiento parcial de doble enlace (40%), presenta equilibrio en sus formas resonantes y generalmente se encuentra en la configuración trans.

Figura 13. Resumen de las estructuras resonantes del polipéptido. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Participa en la formación de puentes de hidrógeno: Los grupos de doble enlace C-O y enlace sencillo N-H son polares.

Así como se realizaron anteriormente ejercicios de pKa de aminoácidos, igualmente pueden hacerse para proteínas. Para ello, se ilustrará el siguiente ejercicio:

Estructura de las Proteínas:

La conformación de los diferentes niveles de las proteínas exige del conocimiento del comportamiento químico de diferentes tipos de enlaces que se dan entre las mismas:

Enlaces covalentes: Se presenta cuando un par de átomos comparte electrones. Enlaces de Hidrógeno: Es la atracción electrostática entre un átomo de hidrógeno de una

molécula de agua con un átomo de oxígeno de otra molécula de agua. O, en el caso de los péptidos, entre el oxígeno del carboxilo y el hidrógeno del amino, ambos de un enlace peptídico.

Interacciones van der Waals: Son interacciones electrostáticas débiles que se dan cuando dos dipolos se atraen entre sí.

Enlaces disulfuro: Es un enlace covalente entre dos grupos tiol de dos cisteínas. Es la clave para la conformación de la estructura terciaria y su rompimiento se denomina desnaturalización.

Interacciones Iónicas: Es aquella interacción en el que uno de los átomos capta los electrones del otro, por una diferencia grande de electronegatividad.

Interacciones Hidrofóbicas: Son fuerzas que mantienen juntas las regiones hidrófobas de las moléculas, sin interactuar con el agua.

Los niveles de estructura proteica son los siguientes:

Estructura Primaria: Es la secuencia lineal de aminoácidos, caracterizada por el enlace peptídico, un tipo de unión covalente entre dos aminoácidos. Dentro del enlace peptídico se origina un pequeño dipolo eléctrico porque se reparte la carga en parcialmente positiva para el nitrógeno y parcialmente negativa para el oxígeno. Casi todos los enlaces peptídicos se encuentran en configuración trans, aunque hay muy pocas excepciones en configuración cis. Los ángulos de giro del enlace peptídico se denominan phi (φ) para el enlace N-C y psi (ψ) para

el enlace entre el carbono alfa y otro carbono (los valores permitidos de ángulos de este tipo se expresan mediante las gráficas de Ramachandran). Los enlaces covalentes necesitan mucha energía para separarse (200-460 KJ/mol). La rotura de un enlace peptídico se realiza a un pH>2 y con ácidos (HF a 6.0 M o 6.0 N), en un proceso que se denomina hidrólisis.

Estructura Secundaria: Corresponde a la segunda estructura proteica que se produce cuando las cadenas primarias se juntan gracias a que se unen sus aminoácidos más cercanos (vecinos) por medio de enlaces puente de hidrógeno. Dependiendo de la forma como se unan, se conocen dos tipos de estructura secundaria:

o Hélice alfa (α): El esqueleto polipeptídico se encuentra totalmente enrollado alrededor de un eje imaginario longitudinal de la molécula, sobresaliendo los residuos R de los aminoácidos que la conforman. En la hélice, cada 3.6 aminoácidos se produce un giro. En la hélice se unen el hidrógeno del grupo nitrógeno de un aminoácido del enlace peptídico con el oxígeno electronegativo del grupo carbonilo del cuarto aminoácido siguiente (o entre dos amidas). Cuando hay muchos grupos carboxílicos cargados negativamente se desestabiliza la hélice (como sucedería con los grupos Lisina y Arginina cargados positivamente a pH 7). En cambio, los residuos de Asparagina, Serina, Treonina y Cisteína contribuyen a estabilizar la hélice. La restricción a la formación de la hélice es la presencia de residuos de prolina (porque existe un átomo de nitrógeno unido al carbono alfa, por lo que el giro C-N no es posible y dicho N no tiene hidrógenos libres para formar puentes de hidrógeno con otro aminoácido) y la glicina (es rara su presencia en alfa hélices puesto que tiene mucha flexibilidad conformacional).

Los cinco tipos de restricciones que afectan una hélice α son:

Repulsión o atracción electrostática entre los grupos R cargados de los aminoácidos presentes.

Volumen de los grupos R adyacentes. Interacciones entre cadenas separadas 3 o 4 residuos. Presencia de residuos de Glicina y Prolina. Interacción entre residuos de aminoácidos de la hélice α y el dipolo eléctrico

formado.

o Lámina beta (β): Conformación simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas paralelas o antiparalelas, unidas estrechamente por puentes de hidrógeno.

Paralelas: Reaccionan dos hebras del mismo sentido (cadenas 1-3) Antiparalelas: Reaccionan dos hebras de sentidos opuestos (cadenas 1-2 ó 2-

3).

Figura 14. Láminas beta paralelas y antiparalelas. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Algunas proteínas globulares, en su empaquetamiento, constan de unos giros en los que la estructura de lámina beta cambia de sentido, denominados giros beta, y conectan los extremos de dos segmentos de hojas β antiparalelas. La estructura forma un giro cerrado de 180° implicando cuatro residuos de aminoácidos que pueden formar un puente de hidrógeno. Glicina (por su pequeño tamaño) y prolina (por la facilidad con que su nitrógeno imino forma configuraciones cis) se encuentran involucradas en los giros. Los giros hacen conexiones αα, ββ, αβ o βα.

o Superestructuras Secundarias: Se refiere a los motivos, que es la combinación estructural de varias estructuras secundarias. Cuando estos motivos son repetitivos en una misma proteína, pero no necesariamente con la misma función, reciben el nombre de dominios.

Estructura Terciaria: Es un nivel superior de conformación proteica (estructura) en la que se forman los puentes disulfuro entre cadenas secundarias, por medio de la oxidación de residuos de cisteína. Las interacciones presentes en la estructura terciaria pueden ser los puentes salinos (interacciones carga-carga o +/- entre cadenas laterales), enlaces puente de hidrógeno internos (contribuyen a estabilizar, son débiles), interacciones van der Waals (interacciones intramoleculares que dan buena estabilidad), interacciones hidrofóbicas (entre

los grupos hidrófobos por el plegado) e interacciones covalentes (por el puente disulfuro cuando hay dos Cys cercanas).

Los aminoácidos hidrofóbicos van hacia el interior y los hidrofílicos hacia el exterior. De acuerdo a la forma como se establezcan los puentes disulfuro, éste tipo de estructura puede ser (estas dos clases de proteínas se denominan holoproteínas o proteínas simples, que sólo están formadas por aminoácidos):

o Fibrosa: Sus cadenas polipeptídicas se encuentran en forma de hebras u hojas (un único tipo de estructura secundaria). Generalmente forman estructuras en los seres vivos como la quitina, queratina, pelo y uñas (colágeno, queratinas, elastinas y fibroínas)

o Globular: Sus cadenas polipeptídicas se encuentran en forma de glóbulos o esferas. Pueden ser prolaminas (zeína del maíz), glutelinas (gluten del trigo), albúminas (lactoalbúmina y ovoalbúmina), hormonas (insulina, prolactina) y enzimas (hidrolasas, liasas, ligasas, transferasas, etc.).

Hay otra clase de proteínas, las heteroproteínas (proteínas conjugadas) que pueden ser las glicoproteínas (anticuerpos), lipoproteínas (HDL, LDL), nucleoproteínas (ribosomas) y cromoproteínas (citocromos, hemoglobina).

Estructura Cuaternaria: Son conformaciones estructurales proteicas de más de 1 monómero (o más de una cadena polipeptídica en forma simétrica). Los monómeros se unen por puentes salinos, interacciones hidrofóbicas, enlaces van der Waals, enlaces puente de hidrógeno y enlaces covalentes (puentes disulfuros) (éstos últimos no son muy comunes; se presentan generalmente en las inmunoglobulinas y la insulina). En la desnaturalización, se pierde la estructura cuaternaria, terciaria, secundaria pero no la primaria y puede ser total o parcial dependiendo del agente al que se exponga la proteína.

En la reversible, se agregan agentes (urea y β-mercaptoetanol) y si luego se retiran, se produce un plegamiento de la proteína (por la nueva formación de puentes disulfuro, en un proceso conocido como renaturalización, donde se reestablecen los puentes disulfuro de forma correcta y la proteína vuelve a su anterior plegamiento o conformación). En la irreversible, se utilizan agentes como el calor (que rompe todas las interacciones débiles) o los pH extremos (que cambian la carga de los aminoácidos ionizables, alterando los enlaces en los que participan).

TEMA 2: PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

La purificación de proteínas va ligada a tres conceptos importantes:

Actividad Específica (AE): Es la sección de proteínas del total que tienen determinada actividad.

AE= Unidades totales en lafraccióniTotalde proteínas en la fraccióni

Rendimiento (R): Es la cantidad de proteína realmente extraída de la sección previamente seleccionada:

R= Unidades totales en la fraccióniUnidades totales en la fracción original

Porcentaje de Purificación (P): Es la relación que hay entre la actividad específica de una proteína frente a la actividad específica total de la fracción.

P= AEen la fraccióniAE en lafracción original

En la purificación no se hace identificación de proteínas sino extracción de las mismas. Los pasos para hacer una purificación son (en cada paso debe hacerse un seguimiento para determinar si lleva las proteínas de interés):

Obtener el extracto crudo: Por medio de métodos físicos o mecánicos. Pueden usarse métodos abrasivos (no recomendados porque puede liberar a proteína y dejarla ir), homogeneización o extrusión a alta presión.

En los métodos químicos pueden usarse sustancias como álcalis, solventes, detergentes (sólo con membranas) o sustancias caotrópicas. Para extracción de organelos por diferencia de densidad se puede utilizar la centrifugación diferencial. A veces se utilizan enzimas que degradan a las células.

Fraccionamiento de la proteína por precipitación (precipitación con sulfato amónico y diálisis): Se puede usar:

o Desnaturalización de proteínas (uso de diferentes temperaturas para precipitarlas o uso de pH extremos, teniendo en cuenta los pI proteicos).

o Uso de solventes orgánicos: Se modifica la constante dieléctrica de las proteínas, estimulando formación de puentes de hidrógeno y la posterior precipitación.

o Adición de sales (salting out): Se pueden usar sales como sulfato de amonio [(NH4)2SO4] para precipitar las proteínas. Las sales se eliminan por centrifugación. La proteína de interés queda en el sobrenadante al centrifugarse (o en el precipitado). Las sales actúan evitando las interacciones agua-proteína (son secuestrantes de agua), obligando a las proteínas a interactuar entre sí y precipitarse.

Posteriormente, se puede utilizar la diálisis, que es el uso de membranas de diálisis de tamaños de poros variados para separar las proteínas de los disolventes. Primero se hidrata la

membrana (hasta que alcance la textura elástica) y luego se llena con el contenido (debe quedar ajustado) y posteriormente se sumerge en agua destilada (al menos 1L). La membrana se suspende sin tocar las paredes del recipiente. La diálisis se hace a temperaturas de refrigeración.

Hacer cromatografía en columna: Se basa en el principio de cromatografía, donde una fase móvil fluye sobre una estacionaria, permitiendo la separación de una mezcla. Puede ser de tres tipos:

o Cromatografía de intercambio iónico (separa por cargas): Hace separación de acuerdo a la carga eléctrica de las proteínas donde la fase estacionaria es un soporte insoluble que contiene grupos cargados (carboximetilos si es carga negativa; dietilaminoetil si es positivo) y la fase móvil es un gradiente de sal o pH (a bajas concentraciones de sal salen las proteínas menos electronegativas y a altas concentraciones de sal salen las más electronegativas). Las perlas están cargadas positivamente, y van diluyendo la muestra hasta dejar eluir las proteínas más negativas (o las más positivas; primero salen las menos afines). La extracción se puede ayudar de una bomba peristáltica. Las proteínas pueden medirse a 280 nm y la concentración debe ir aumentando. Al final, la columna se lava.

o Cromatografía de exclusión molecular (separa por masas): Las proteínas de mayor tamaño emergen antes que las pequeñas. Se tienen unas perlas que no dejan pasar las proteínas más grandes, por lo que estas toman el camino más corto y rodean a las partículas por el exterior, mientras que las más pequeñas sí pasan por todas las cavidades y se demoran más. No se considera un método muy efectivo porque su separación no es tan precisa (es muy “gruesa”).

o Cromatografía de afinidad (separa por sus propiedades biológicas): Es un método de alta pureza donde las proteínas tienen un grupo químico unido covalentemente, por lo que las más afines a las partículas de la columna saldrán más tardíamente. Por ello, las proteínas no deseadas son las que saldrán al principio, y las de interés (atrapadas en la columna) serán eluídas al lavar la columna con una solución de ligando (solución competitiva).

o HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución): Utiliza bombas de alta presión que aceleran el movimiento de las moléculas proteínicas en la columna.

Hacer electroforesis (para separar e identificar, posteriormente): Realiza una separación de proteínas por peso molecular. Utiliza geles de acrilamida (redes o estructuras lineales) o biacrilamida (estructuras transversales). Generalmente se utilizan dos geles:

o Gel separador: Se prepara y gelifica primero. Se forma una estructura de peine (en caso de dejar residuos, se limpia con buffer) y se coloca muestra en cada pozo (en el caso de que un pozo quede contaminado por otro, se puede adicionar buffer y succionar los poros ensuciados).

o Gel concentrador: organiza las muestras, permitiendo que corran al mismo tiempo.

EL gel es poroso, y va atrapando en las capas superiores las proteínas de mayor peso molecular, y en las capas más inferiores las de menor peso molecular. Se recomienda hacer el ensayo hacia el centro del gel (puesto que en los extremos se distorsionan las proteínas) y se hace pasar una carga eléctrica para estimular el movimiento proteico a través del gel. Si el gel debe guardarse, para evitar su deshidratación se coloca en una bolsa con agua en el fondo, se cierra la bolsa y se refrigera.

o Electroforesis en poliacrilamida – SDS: Se utiliza el detergente dodecil sulfato sódico (SDS), puesto que se une a las proteínas en forma proporcional a la masa de las mismas, aportando una alta carga negativa y hace que los polipéptidos pequeños se desplacen más rápidamente. Luego de la separación, se añade Azul de Coomassie para visualizar las proteínas (el colorante se adhiere a las proteínas más no al gel).

o Enfoque isoeléctrico: Determina el punto isoeléctrico de una proteína. Un conjunto de ácidos y bases se distribuye a lo largo del gel (gracias a una corriente eléctrica) y luego se adiciona la mezcla de proteínas, que se desplazan hasta que su pH alcanza el punto isoeléctrico.

o Electroforesis bidimensional: Es la combinación de los dos métodos anteriores y es el método más sensible que hay. Separa proteínas de diferentes masas moleculares pero pI similares o de diferentes pI pero masas moleculares similares. Entonces, se forman columnas con el mismo pI (pero sus pesos moleculares son diferente).

TEMA 3: INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS

Es la utilización de anticuerpos que se unen a determinas proteínas y luego, mediante la identificación de dichos anticuerpos, se identifican las proteínas enlazadas. Los anticuerpos pueden ser de dos tipos:

Anticuerpos primarios: El anticuerpo sólo lleva consigo una enzima. Cada proteína lleva 1 anticuerpo primario.

Anticuerpos secundarios: El anticuerpo lleva consigo un sistema de detección (pero no lleva la enzima). Cada método lleva 1 anticuerpo secundario (por lo tanto, si se corren todas las proteínas con un anticuerpo primario por cada una, con el mismo secundario por método, hay un ahorro de anticuerpos).

Como ejemplo, por ejemplo se introduce determinada proteína en un animal, por lo que éste reacciona formando un anticuerpo de dicha proteína (llámese Anticuerpo X, al reconocer el

antígeno extraño o la fracción de la proteína que es extraña). Esos anticuerpos X se introducen en otro animal, por lo que el animal forma nuevos anticuerpos (llámese anticuerpos Y, o anti anticuerpos X). Se busca que los anticuerpos utilizados reconozcan secciones proteicas específicas (epítopes); los anticuerpos más caros son los mononucleales (reconocen un único epítope) mientras que los polinucleales (reconocen varios epítopes) son más baratos.

Las formas de detección de proteínas son:

Métodos colorimétricos: Genera una señal en forma de color. Por ejemplo, en la unión de peroxidasa con un sustrato (DH2) para generar agua y un color. El Test de Elisa se basa en un principio colorimétrico.

Métodos fluorimétricos: Utiliza fluorescencia para la identificación. Métodos quimioluminiscentes: Utiliza reacciones químicas que emiten luz. Métodos electroquímicos: Puede ser potenciométrico, voltamétrico o amperométrico.

Las técnicas más usadas de Inmunodetección de proteínas son:

Test de ELISA (método colorimétrico) (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay): Es un método que sólo cuantifica mediante la apertura de células o tejidos. Se basa en utilizar un pocillo que tiene un anticuerpo, el cual se une a la proteína (primer sustrato). Se hace un lavado (para eliminar el exceso de sustancias, con buffer o mezclas buffer-detergente) y luego se adiciona un segundo anticuerpo a la unión anticuerpo-proteína que ha quedado en el pocillo. Posteriormente, se adiciona un segundo sustrato que provoca el cambio de color, el cual se mide por espectrofotometría. A veces se mide la actividad del anticuerpo o la actividad del antígeno (en este caso, se llama Indirecto).

Utiliza peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Método Western-Blot: A diferencia de Elisa, se hace sobre medio sólido y requiere de una electroforesis inicial. No es un método de cuantificación sino de detección (técnica cualitativa, pero con posibilidad de cuantificación). Utiliza luminol y peróxido de hidrógeno. Los pasos son:

o Primero se hace una electroforesis en gel SDS. o Posteriormente, las proteínas se pasan a una membrana (por el uso de corriente) y se

tiñe la membrana con Rojo de Ponceau (si se desea saber si tiene proteína).o Se incuba con anticuerpos. Se agrega un anticuerpo primario que reconoce a la

proteína y se une a ella. Luego, un anticuerpo secundario que reconoce al primario (el secundario lleva un indicador, la Hot Raddish Peroxidase o HDR).

o Se adiciona un sustrato que produzca luz y se detecta la luz con placa de rayos X.

Al final sólo debe salir 1 mancha negra que indica la proteína de interés; si salen varias indicaría que la proteína se degradó en secciones o que sufrió reacciones inespecíficas.

Inmunoprecipitación: Es una técnica utilizada para estimular precipitaciones de proteínas. No se utiliza para cuantificar o detectar, sino para reducir la cantidad de proteínas de la muestra. En primer lugar, se adiciona un anticuerpo que reconoce la proteína. Luego, se estimula la formación de complejos agregando más proteínas (A o G) u otros anticuerpos, se centrifuga y se retira el sobrenadante; el precipitado se mide con Western o Elisa.

Pruebas inmunohistoquímicas: Se utilizan específicamente para localizar en tejidos o células a las proteínas. Los pasos son:

o Se coloca el tejido en un medio de conservación (formalina o formaldehído) y se congela en un criostato.

o Se pasan los tejidos a parafina y se hacen rebanadas celulares con micrótomos.o Se recuperan las rebanas en portaobjetos. o Se incuba la muestra con un anticuerpo primario que identifica a la proteína de interés

(lleva una enzima), emitiendo una señal (cambio de color o fluorescencia).

TEMA 4: SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

La secuenciación de proteínas se utiliza para determina la secuencia específica de ácidos (su orden) dentro de un polipéptido o proteína. Los pasos para realizarla son:

Determinar composición de aminoácidos: Por hidrólisis ácida (completa o parcial) y luego cromatografía.

Identificar grupos terminales:

o Amino N terminal: Con otra muestra distinta, se marca el aminoácido N-terminal utilizando:

Método de Sanger: 1-F-2,4-dinitrobenceno (color amarillo) Método del cloruro de dansilo (ClDNS): Sustancia fluorescente, por lo que se

debe tener un detector de fluorescencia). Degradación de EDMAN: Se utiliza hasta 50 aminoácidos y sólo hidroliza el

grupo amino terminal. Marca amino terminal con fenil tiocianato. Va liberando poco a poco los aminoácidos, permitiendo ver el orden.

o Identificar Carboxilo terminal: Por medio de estándares, se detecta el aminoácido utilizando Hidrazina (NH2-NH2), carboxipeptidasas o borohidruro de litio.

Reducción (ditioeritriol o β-mercaptoetanol) u oxidación (ácido perfórmico) de puentes disulfuro:

Hidrólisis parcial. Secuenciación de péptidos. Establecimiento de secuencia.

Localización de puentes disulfuro.

TEMA 5: ENZIMAS: