1 ÍNDICE Introducción 2 Interacción ligando-afinante 2 Matrices 5 ...

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Cromatografía de afinidad 1 ÍNDICE Introducción 2 Interacción ligando-afinante 2 Matrices 5 Matrices de polisacáridos 6 Agarosa 7 Celulosa 8 Dextrano 9 Matrices sintéticas 11 Poliacrilamida 11 Vidrio 12 Otros soportes 13 Hidroxialquilmetacrilato 13 Copolímeros de etileno 14 Oxiranos acrílicos 14 Métodos de activación y acoplamiento 15 Matrices de polisacáridos 15 Halidas de cianógeno 16 Triazinas 18 Oxidación por periodato 18 Oxiranos 19 Bizaridinas 20 Divinil sulfonas 20 Benzoquinonas 21 Alógenos 22 Grupos tioles 23 Matrices sintéticas 24 Poliacrilamida 24 Modificación directa 24 Aminoetilación 24 Hidrazinación 24 Hidrólisis alcalina 25 Modificación indirecta 25 Copolimerización 25 Vidrio 26 Otras 27 Brazos espaciadores 27 Bloqueo de los sitios inactivos 28 Ligandos 28 Anexos 30 Ejemplos prácticos 34 Bibliografía 38

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Cromatografía de afinidad

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ÍNDICE

Introducción 2Interacción ligando-afinante 2Matrices 5

Matrices de polisacáridos 6Agarosa 7Celulosa 8Dextrano 9

Matrices sintéticas 11Poliacrilamida 11Vidrio 12

Otros soportes 13Hidroxialquilmetacrilato 13Copolímeros de etileno 14Oxiranos acrílicos 14

Métodos de activación y acoplamiento 15Matrices de polisacáridos 15

Halidas de cianógeno 16Triazinas 18Oxidación por periodato 18Oxiranos 19Bizaridinas 20Divinil sulfonas 20Benzoquinonas 21Alógenos 22Grupos tioles 23

Matrices sintéticas 24Poliacrilamida 24

Modificación directa 24Aminoetilación 24Hidrazinación 24Hidrólisis alcalina 25

Modificación indirecta 25Copolimerización 25

Vidrio 26Otras 27

Brazos espaciadores 27Bloqueo de los sitios inactivos 28Ligandos 28Anexos 30Ejemplos prácticos 34Bibliografía 38

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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

INTRODUCCIÓN

En 1906 Michael Tswett publicó un arículo donde describe la separación ypurificación de los pigmentos de una planta y estableció la cromatografía como unmétodo en el cual una mezcla es separada mediante un adsorbente en un sistemafluido. A partir de entonces y hasta ahora se han logrado separar una enorme cantidadde macromoléculas mejorando el sistema propuesto por Tswett hace más de 95 años.

Existen varios tipos de cromatografía desarrolladas para diversos propósitos(Oh-ishi y Maeda, 2002). La cromatografía de exclusión molecular se basa en lasdiferencias en pesos moleculares de los componentes para separarlos; lacromatografía de intercambio iónico toma en cuenta las cargas de las moléculas; la deinteracción hidrofóbica se basa en la hidrofobicidad de las partículas a separar; y lacromatografía de afinidad, tema principal de este trabajo, retrasa la elución de algunamacromólecula específica mediante la unión de ésta con un ligando particular

La cromatografía de afinidad se basa en la interacción, específica y reversible,que se presenta entre una partícula de interés (llamada genéricamente “afinante”) conalguna molécula particular que va a ser inmovilizada en un soporte sólido (a estapartícula se le conoce como “ligando”). La interacción de estas dos moléculas es similara la que se presenta entre una enzima y su sustrato. Durante finales de los 60s yprincipios de los 70s se escribieron los primeros trabajos que tomaban en cuenta estainteracción para separar proteínas específicas.

Cuatrecasas (1969, 1970) y Cuatrecasa et al. (1968) sentaron las bases que sonutilizadas hasta ahora para la purificación de diversos afinantes. En estos artículos sedescriben tanto las características que deben presentar los diferentes soportes comolas primeras metodologías de activación que se usaron para unir el ligando al soporte.

Como se verá a lo largo de este trabajo la cromatografía de afinidad ha sido unaherramienta de enorme importancia para el aislamiento, purificación y caracterizaciónde diversas macromoléculas. Además, se ha usado ampliamente para determinardiferentes parámetros que rigen la interacción de dos macromoléculas: constantes deasociación, de disociación, concentración máximas y mínimas de sustratos, entre otras(Baczek y Kaliszan, 2001, Dunn et al., 1983)

INTERACCIÓN LIGANDO-AFINANTE

La afinidad que tenga un ligando por algún afinante específico es una consideración deenorme importancia para la correcta selección del ligando a inmovilizar. Un modelomatemático simple para describir la adsorción de algún afinante a la columna en

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Cromatografía de afinidad

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términos de unos cuantos parámetros medibles puede ser úitl para evaluar el posibleuso de un ligando (Lowe, 1979)

Si la concentración de un afinante la denominamos como E y la del ligandocomo L entonces:

KD

E + L EL

Donde la constante de disociación (K D) del complejo enzima–ligando (EL) está dadapor

[E] [L] KD=

[EL]Sin embargo, tanto el término [E] como [L] se refieren a la cantidad absoluta de afinantey ligando inmovilizado respectivamente y por lo tanto la siguiente afirmación es cierta

[Eo – EL] [Lo – EL] KD = ec. 1

[EL]

Donde Eo y Lo se refieren a las concentraciones iniciales de afinante y ligandoinmovilizado. En la mayoría de los casos Lo >> Eo y por tanto Lo >> EL, por lo tanto:

[Eo] – [EL] KD = Lo

[EL]y rearreglando

[Lo]

[EL] KD

= ec. 2 [Eo] 1 + [Lo]

KL

La ecuación 2 define la fracción de afinante unido a la matriz a unaconcentración fija de afinante inicial (Eo) cuando la concentraciónd de ligando esvariable. Esta ecuación permite una estimación aproximada del valor máximo de KD

entre un ligando inmovilizado y un afinante a fin de que se efectúe una unión útil delafinante a la matriz.

Así si el adsorbente comprende un ligando inmovilizado cuya concentración es,típicamente, 5 µmol/g (o ml) de matriz, es decir, 5 mM y se pretende una adsorcióncuantitativa (98 %) del afinante a la matriz por lo tanto la KD del complejo afinante-ligando inmovilizado debe ser por lo menos de 0.1 mM siguiendo los parámetros de laecuación 2.

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A una Lo = 10 mM los cálculos basados en la ecuación 1 sugieren que paraefectuar una buena unión del afinante la KD debe ser al menos de 0.5 mM. Conligandos que exhiben valores de KD > 0.5 mM el problema se traduce en que esnecesario acoplar el ligando a una concentración suficientemente alta y para eso existeun límite práctico impuesto por la matriz.

Por lo tanto, basados en los datos anteriores se muestra que a unaconcentración típica de ligando inmovilizado de 5-10 mM se permiten constantes deafinidad de entre 0.1-0.5 mM. Los probables ligandos cuya KD sea mayor a 0.5 mMdeben descartarse y buscar otros con mayor afinidad. La figura 1 muestra como larelación [EL] / [Eo] es una función hiperbólica de [Lo] de la misma forma en que elporcentaje de saturación de una enzima esta en función de la concentración desustrato adicionado. En la figura 2 se muestra la importancia que tiene la constante dedisociación sobre la cantidad de enzima unida a la matriz.

Sin embargo se debe tener en cuenta que los cálculos basados en la ecuación 2deben utilizarse sólo como una guía ya que asumen que:

• La concentración absoluta del ligando (Lo) es equivalente a la concentraciónefectiva de ligando.

• La KL del complejo afinante-ligando inmovilizado es comparable a la del complejoafinante-ligando libre.

Figura 1 Efecto de la concentración de ligando sobre la unión de diferentes enzimas a una matriz de N6-(6-aminohexil)-AMP-Sefarosa. LDH, lactato deshidrogenasa

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600 700 800

LDH ratónLDH cerdoGlicerocinasa

Can

tida

d de

uni

ón (

%)

[Ligando] (nmoles/ml)

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Figura 2. Unión fraccional de enzima (EL/Eo) para bajas concentraciones de enzima calculado a partir de la ecuación2 a varios valores de Lo y KL

MATRICES

Las matrices o soportes utilizados en cromatografía de afinidad son genenralmentegeles que deben cumplir con una serie de requisitos a fin de lograr obtener el productodeseado en con menores dificultades y en mayor grado de pureza. La matriz idealdebería tener as siguientes propiedades (Cuatrecasas, 1970; Lowe, 1979; Turková,1983, Dean et al., 1978)

– Insolubilidad. Este punto es muy importante, no solo para prevenir la pérdida deladsorbente sino también para evitar la contaminación de la muestra.

– Gran permeabilidad y área específica. Si una matriz no posee la suficientepermeabilidad (referida como el tamaño del poro) no se permitirá la libre interaccióndel ligando con el afinante impidiendo una buena adsorción de este último a lacolumna y por tanto una buena purificación. Es muy importante hacer notar que elárea de superficie específica (aquella área que se encuentra en contacto directo conla molécula que se desea aislar) está directamente relacionada con la cantidad deafinante que se desea aislar, por lo tanto entre mayor sea el área específica de lacolumna se esperará purificar mayor cantidad de afinante.

– Rigidez. Esta propiedad, junto con la forma de la partícula de la matriz, estándirectamente relacionadas con el problema de la velocidad de flujo. En general,

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20

Frac

ción

de

enzi

ma

unid

a

Concentración total de ligando (Lo) mM

KL=10-4

10-3

10-2

10-1

1

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para cromatografía de afinidad se utilizan flujos lentos con el fin de dar oportunidadal afinante de penetrar los poros de la matriz y encontrar a su ligando. Altasvelocidades de flujo provocan que las partículas de la matriz se deformen porcompactación incrementando la resistencia al flujo. Como recomendación el tamañode la partícula debe estar entre los 5 y los 200 µm

– Adsorción inespecífica. Como es de imaginarse las matrices deben adsorber lomenos posible (idealmente cero) al afinante. La adsorción inespecífica del afinantea la matriz provoca cantidades sub-óptimas de recuperación y puede provocar ladesnaturalización de la molécula de interés. Es por esta razón que debe evitarse eluso de matrices que contengan grupos ionogénicos (p. ej. co-polimeros de etilenocon anhidrido maléico) principalmente cuando se trabaja a baja fuerza iónica (20mM NaCl).

– Reactividad y baja fuerza iónica. La matriz debe tener suficientes gruposquímicamente reactivos que puedan ser activados o modificados de tal forma quesean capaces de unir a la molécula de interés. La capacidad de una columna, esdecir, cuantas moléculas de afinante puede unir, esta en función directa del númerode grupos reactivos que existan en la matriz. La modificación o activación de lamatriz deben hacerse bajo condiciones que no alteren su estructura. De igual formaes importante que la matriz no se altere bajo las condiciones de trabajo así como adiferentes valores de pH, temperatura, fuerza iónica y bajo la presencia de agentesdesnaturalizantes.y caotrópicos. El hecho de poder reutilizar una columna dependede estas capacidades.

– Resistencia a biológicos. La matriz no debe ser degradada por microorganismos y/oenzimas. Este requerimiento lo cumplen muy satisfactoriamente las matricesinorgánicas como las de vidrio o polimeros sintéticos (poliacrilamida ohidroxialquilmetacrilato)

Las matrices más utilizadas en cromatografía de afinidad pueden ser de varios tipos.En este trabajo solo mencionaremos las más populares, las cuales se dividiran an tresgrandes grupos:

• Matrices de polisacáridos• Agarosa• Celulosa• Dextrano

• Matrices sintéticas• Poliacrilamida• Vidrio

• Otras matrices

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Cromatografía de afinidad

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MATRICES DE POLISACARIDOS

AGAROSA

La agarosa es un polímero lineal de 1,3-D galactopiranosa β1-4,3,6 anhidro L-galactosa

CH3OH O

O

OH O CH2 O O O

OH n

Se obtiene descomponiendo el agar en las dos moléculas que lo forman:agarosa y agaropectina. Esta descomposición puede llevarse a cabo medianteacetilación, extracción de la agarosa a un fase insoluble (cloroformo) con unasubsecuente regeneración del polisacarido por precipitación fraccional conpolietilenglicol, o bien por precipitación selectiva de la agaropectina con cloruro de cetilpiridino.

La agarosa (cuyo nombre comercial más común es Sefarosa) pura permiteutilizarla en concentraciones muy bajas (< 0.5%) y facilita la formación de poros detamaño muy grande. El agar como tal (agarosa + agaropectina) también permite laformación de poros muy grandes además de ser muy estable mecánicamente bajo lascondiciones que se requieren en cromatografía de afinidad. Sin embargo, laagropectina contiene grupos sulfato y, en menor número, grupos carboxilo que leproporcionan al agar características iónicas que no son deseables en el tipo decromatografía que nos atañe

La estructura de la matriz de agarosa no se mantiene por enlaces covalentes,como sucede en las matrices de dextrano, si no que se debe a puentes de hidrógenoentre cadenas vecinas (probablemente hélices triples). Sin embargo, cuando seadicionan agentes que destruyen estos puentes, como urea, cloruro de guanidino,iones y algunos detergentes utilizados para recuperar la muestra, no se aprecia unadisminución en la estabilidad de la matriz. Por lo tanto existen otras fuerzasinvolucradas en éste fenómeno pero aún no ha quedado claro la naturaleza de lasmismas. Una matriz de agarosa pierde su estabilidad cuando es expuesta a calor porperiodos prolongados. Se recomienda que no se les utilice por debajo de los cerogrados centígrados ni por arriba de los 40o C. La esterilización por calor debe evitarseen cualquier momento.

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Por otro lado, estas matrices son estables en un rango de pH de 4-9 y muestranuna tolerancia adecuada a la exposición de 0.1 M NaOH o 1 M HCl de 2-3 hrs.También se ha demostrado que estas matrices no se deforman durante la exposición a1-2 M NaCl, 8 M urea, 6 M cloruro de guanidino, 0.4% deoxicolato de sodio, 3% SDS y0.5% Triton X-100 aunque esta tolerancia no es indefinida. También toleran bajasconcentraciones de solventes orgánicos como etilén glicol, etanol, metanol, acetona,butanol, piridina (80% v/v) y dimetil formamida (50%), se sabe que el dimetil sulfóxidopuede perturbar la estructura del gel.

A fin de proporcionar una mayor estabilidad a la matriz se puede adicionarepiclorohidrína, 2,3 dibromopropanol o divinil sulfona. Estos agentes entrecruzan lascadenas vecinas de agarosa lo cual permite su utilización en un mayor rango de pH (3-12) e incluso el uso de solventes orgánicos como tetrahidrofurano, cloroformo,diclorometano, dicloroetano y dicloroetano:piridina (1:1).

Un parámetro para conocer la pureza de la agarosa implica conocer el contenidode sulfato orgánico de la matriz, este índice se basa en el hecho de que los grupossulfato le otorgan a la matriz ciertas propiedades iónicas no deseables. Las agarosascomerciales contienen cerca del 0.37% (w/v) de sulfuros y varian enormemente en elcontenido de grupos sulfato. Es recomendable dar un tratamiento previo a la matriz conhidroborato de sodio para remover esto grupos.

CELULOSA

Es un polímero linear de D glucosa β 1-4 con uniones ocasionales 1, 6.

OH CH2OH

O

O OH O

O OH

CH2OH OH n

Es una matriz que, debido a su naturaleza fibrosa y poco uniforme, no permite laformación de poros grandes impidiiendo el paso de grandes macromoléculas. Lasfibras de celulosa comprenden una agregación de cadenas glucosídicas unidas unas aotras por varios puentes de hidrógeno. Esta estructura da lugar a zonas “cristalinas” dealto grado de agregamiento y a zonas “amorfas” o desordenadas. La relación entre laszonas cristalinas y amorfas es particularmente sensible a las condiciones

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fisicoquímicas utilizadas en la preparación del ligando. Usualmente se utilizancondiciones que permitan la formación de un mayor número de zonas amorfaspermitiendo una micro heterogenenidad en la sustitución del ligando creando así unespectro de afinidades para la macromolécula de interés. Esta microheterogenenidadpuede generar efectos adversos en la capacidad del adsorbente y en la adsorción ysubsecuente elución de las macromoléculas.

A pesar de los inconvenientes antes mencionados las características de lacelulosa han permitido emplearla en varios protocolos de purificación. La celulosacomercial esta preparada en forma de microfibras o microcristales esferoides queexhiben buenas velocidades de flujo. Actualmente también puede conseguirse celulosaen forma de gotas. La celulosa en gotas es un producto en forma de partículasesféricas altamente porosas que se componen de celulosa pura (15%) y agua. Cuandolas partículas se inchan se produce una estructura macroreticular.

Cuando la celulosa se regenera a partir de soluciones de xantato se forma unaestructura microhéterogenea que consta de regiones microcristalinas conectadas porregiones amorfas. Debido a esta micro heterogeneidad las macropartículas esféricasde gotas de celulosa son mucho más rigidas que las partículas de otros geles depolisacáridos homogéneos. La introducción de grupos de entrecruzamiento u otrossustituyentes a las macromoléculas pueden reducir la formación de zonas cristalinas.Gracias a esto las gotas de celulosa son más estables mecánicamente que, porejemplo, los geles de dextrano de porosidad comparable. La celulosa en gotas es,teóricamente, una matriz muy útil para cromatografía de afinidad dada su estructuraesférica, alto grado de porosidad, buena estabilidad mecánica y fuerte caracterhidrofílico (ver Gemeiner et al., 1998).

DEXTRANO

Es un polímero de glucosa unidos por enlaces α 1, 6, que es producido por variascepas de Leuconostoc mesenteroides y comercialmente se prepara en solucionesacuosas con alto contenido de azúcar.

El dextrano soluble, preparado por precipitación fraccional con etanol dedextrano parcialmente hidrolizado contiene más del 90% de enlaces α 1, 6 y se ramificaen enlaces 1, 2-, 1, 3- y 1, 4. Cuando se entrecruza con 1-cloro, 2,3-epoxipropano ensolución alcalina el dextrano obtiene una conformación tridimensional parecida a la dela figura 3.

La forma comercial de las matrices de dextrano se conoce como Sephadex lacual se prepara entrecruzando las cadenas de glucosa con epiclrohidrína y se presentaen forma de gotas.

Esta matriz tiene una naturaleza altamente hidrofílica debido al gran número degrupos hidroxilo presentes lo cual permite que se hinche fácilmente en agua y ensoluciónes electrolíticas. El proceso de hinchado y secado es reversible y no afecta de

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forma significativa las propiedades cromatográficas de la matriz aún después de variosciclos.

O – CH2

O-CH2

O O – | CH2

| CHOH | CH2

| O

O –

– O – CH2Figura 3. Estructura del dextrano

El Sephadex es muy estable químicamente. Por ejemplo, resiste dos meses en0.25 M NaOH a 60o C, 6 meses en 0.02 M HCl o 1-2 hrs en 88 % ácido fórmico. Másaún puede ser calentado a 110o C por 40 min sin pérdida de propiedades, aunque alexponerlo a agentes oxidantes se forman grupos aldehído o carboxilo que le confierenciertas características de intercambiador iónico. Puede hincharse también, hasta ciertolímite, en etanol, etilénglicol, formamida, N, N’ dimetil formamida y dimetil sulfóxido..

Las características antes mencionadas hacen de esta matriz una de las idealespara cromatografía de afinidad, sin embargo tiene un grado de porosidad muy bajo.Comercialmente el Sephadex puede tener un rango de exclusión de hasta 800, 000(Sephadex G-200) aunque la activación de estas matrices por los métodosconvencionales da lugar a un considerable grado de entrecruzamiento lo cual baja surendimiento aún en la purificación de afinantes de bajo peso molecular.

El hecho de tener un poro de pequeño tamaño también puede ser tomado comouna ventaja. Dado que el afinante no va a penentrar los poros se puede unir el ligandoa la superficie de las partículas de la matriz a fin de permitir el mayor grado deinteracción. Esta idea ha sido particularmente explotada para purificar complejossupramoleculares como ribosomas, polisomas, virus, organelos, fragmentos demembrana o hasta células completas.

Para liberar al afinante suelen utilizarse dextranasas o bien puede adicionarseun puente de gelatina al momento de activar la matriz con bromuro de cianógeno paradespués digerirlo con colagenasa.

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MATRICES SINTÉTICASPOLIACRILAMIDA

La acrilamida es un polímero completamente sintético compuesto de un esqueletohidrocarbonado al que se unen grupos carboxiamida

CH2 =CH–CO–NH2

Para producir la poliacrilamida se mezcla acrilamida en diferentes proporciones,con el agente entrecruzante N,N’ metilen bis acrilamida

CH2=CH–CO–NH–CH2 –NH–CO–CH=CH2

Para dar lugar a una estructura de tipo:

Al variar la concentración de acrilamida y la proporción de bis acrilamida seobtienen geles de poliacrilamida de diversas porosidades que proporcionan diferentespropiedades a las matrices para cromatografía de afinidad.NOTA IMPORTANTE: la acrilamida en solución es altamente tóxica y debe utilizarsecon precaución.

--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ----

C=O

NH

CH2

NH

C=O

--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ----

--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ----

C=O

NH

CH2

NH

C=O

NH2

C=O

C=O

NH2

C=O

NH2

NH2

C=O

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Los geles comerciales más comunmente utilizados son los de Bio-Rad quellevan el nombre de Bio-Gel P. Se pueden conseguir matrices con poros de tamañosmuy variados con límites de exclusión que van desde 100-1800 (Bio-Gel P 2) hasta60000-400000 (Bio-Gel P300).

Las matrices Bio-Gel P son estables en rangos de pH de 2-10. El uso de lasmatrices fuera de éste límite puede provocar la hidrolisis de grupos amida dando lugara grupos cargados que pueden funcionar como intercambiadores iónicos. Tampoco serecomienda el uso de oxidantes fuertes como hipoclorito o peróxido de hidrógeno. Sontotalmente inertes a ataques biológicos y no sufren degradación enzimática. Por otrolado, estos geles se adhieren fuertemente a superficies de vidrio limpias así que paraevitarlo se recomienda el uso de silicón o polietileno

La falta de grupos cargados en la matriz evita la adsorción no específica delafinante. Sin embargo, las moléculas fuertemente ácidas o básicas así comocomponentes aromáticos pueden adsorberse al esqueleto de la matriz. El intercambioiónico que pueda presentar la matriz_no tiene significancia práctica a menos que setrabaje en fuerzas iónicas menores a 0.02 M.

Una ventaja de las matrices de poliacrilamida es el gran número de grupospotencialmente activables lo que, unido a una gran versatildad en las técnicas dederivatización permiten unirle covalentemente muchos posibles ligandos. Ésto resultaparticularmente útil cuando se desea purificar un compuesto que muestra baja afinidadpor el ligando inmovilizado. Al aumentar el número de sitios en los que el afinantepueda unirse se aumentan las probabilidades de obtener mayor cantidad de productopurificado.

Aún cuando han sido matrices muy útiles para aislar una gran cantidad decompuestos (anticuerpos, lisozima, peroxidasa, tripsina, linfocitos, células B, entreotros) su uso sigue restringido debido al bajo grado de porosidad que posee lo cualpuede provocar que el ligando inmovilizado se encuentre lejos del alcance del afinante.

VIDRIO

Las matrices de vidrio han sido ampliamente usadas para inmovilizar moléculasbiológicamente activas pero su uso en cromatografía de afinidad ha sido relativamentepoco explotado.

Éstas matrices se obtienen al calentar borosilicato de sodio de 700 a 800o Cpara posteriormente lixiviarlas con ácido. Durante el tratamiento se forman dos fases:una rica en silica y resitente al tratamiento con ácidos y una segunda fase formada,principalmente, por óxido bórico y fácilmente atacada por ácidos. La fase de silicacorresponde a cerca el 96% del total mientras que la de borato a cerca del 4% ademáspueden encontrarse trazas de otros óxidos inorgánicos. La fase de ácido bórico selixivia para dar lugar a una estructura porosa con canales interconectados cuyosdiámetros varían entre los 30 y 60 Å. El tratamiento posterior con NaOH remueve los

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silicatos que puedan haber quedado atrapados dentro de los poros, lo cual ayuda aacrecentar el diámetro.

La distribución del tamaño de poro en estas matrices es muy restringida (45-2500 Å) lo que la convierte en la matriz más uniforme de todas las disponibles ypermite una buena resolución y excelente reproducibilidad. El rango de porosidad essuficientemente bueno para incluir la mayoría de las biomoléculas desde sustratoshasta células completas. En cuanto a las características mecánicas, son matricescompletamente insolubles y no se ven afectadas por cambios en el eluyente, presión,velocidad de flujo, pH o fuerza iónica. No son atacadas por microorganismos y puedenser esterilizadas tanto por autoclave como mediante el uso de desinfectantes.

Como ya se había mencionado, estas matrices contienen cerca del 4% deborato, de éste alrededor del 30% se encuentra en la superficie del vidrio. Losnumerosos sitios que pueden formar un ácido de Lewis, dado por los grupos boro,pueden adsorber inespecíficamente nucleófilos tales como las aminas de las proteínasy/o grupos amonio, que dan lugar a centros cargados positivamente. Adicionalmente, aligual que todos los vidrios de silica, las superficies de las partículas de estas matricescontienen grupos silanol (Si-OH) que exhiben una superficie ligeramente negativa ensoluciones acuosas aumentando la adsorción no específica

Sin embargo se han desarrollado ciertas estrategias para evitar la adsorción noespecífica. Por ejemplo, se pueden cubrir las partículas de la matriz con dextrano locual inactiva los grupos ionizables y, teóricamente, permite su activación con bromurode cianógeno y otras técnicas usualmente reservadas para matrices de polisacaridos.

OTROS SOPORTES

HIDROXIALQUILMETACRILATO

Los grupos hidroxilo de la matriz exhiben propiedades similares a los de lasmatrices de polisacaridos y son potencialmente activables por bromuro de cianógeno.El número de grupos reactivos, la porosidad y el tamaño de la partícula de éstos gelespuede variar significativamente durante su producción. Los rangos de exclusión deestas matrices van de 105 a 108 y han sido usados para aislar moléculas comoinhibidores de tripsina y quimotripsina, proteasas, y otros mas.

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CO-POLIMEROS DE ETILENO

Se utilizan particularmente por la unión del grupo amino de las proteínas a losgrupos anhídrido de la matriz. Sin embargo, durante la unión de las proteínas existeuna liberación concomitante de grupos carboxilo y la matriz adquiere un caracterpolianiónico.

OXIRANOS ACRÍLICOS

Se obtienen de la co-polimerización de metacrilamida, metilen-bis-metacrilamidaglicidil- metacrilato y/o alil-glicidil-eter. Se conocen bajo el nombre comercial deEupergit C, son hidrofílicas, químicamente estables en un rango de pH de 0 a 12 porvarias horas a temperatura ambiente en suspensión acuosa, en polvo son estables

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C -

C=O C=O C=O

O

CH2

CH2O

C=O C=O

O

CH2

CH2

O

C=O

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C -

C=OC=OC=OC=O

CH3 CH3 CH3 CH3

CH3CH3

(CH2)2OH (CH2)2OH

(CH2)2OH(CH2)2OH

CH2 - CH2 CH2 - CH2 - CH -CH -

O O O

O=C COOH

NH

(CH2)n

NH

C=O

CH2 - CH2 CH2 - CH2 - CH -CH -

O O O

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durante meses a –30o C. Dada la naturaleza química de la unión matriz-ligando, losligandos se inmovilizan irreversiblemente a la matriz en un rango de pH de 1 a 10.

MÉTODOS DE ACTIVACIÓN Y ACOPLAMIENTO

La activación de la matriz consiste en unir covalentemente el ligando a la matriz.En algunas ocasiones resulta muy útil introducir moléculas que alejen el ligando de lamatriz (estas moléculas son conocidas como brazos espaciadores), a fin de aumentarla adsorción del afinante (ver sección sobre brazos espaciadores). Algunos autorespiensan que es mejor acoplar el ligando al brazo espaciador antes de unirloscovalentemente a la matriz. Este método es recomendable dado que se conoce bien lanaturaleza química del ligando lo cual es de enorme importancia para el diseño einterpretación de los datos de purificación. Otros autores prefieren acoplar el ligandocuando el brazo espaciador ya está unido a la matriz activada. Este método permitecierta flexibilidad en la síntesis de derivados para un problema en particular(Cuatrecasas, 1969, 1970; Lowe, 1979; Turková, 1983, Dean et al., 1978, AmershamPharmacia Biotech, 2001; Nisnevitch y Firer, 2001).

Sin importar que método se utilice, las condiciones bajo las cuales se va aacoplar el ligando a la matriz deben ser lo suficientemente suaves para no dañar aninguno de los componentes.

Matrices de polisacáridos

En términos químicos estas matrices (agarosa, celulosa y dextrano) sonactivadas introduciendo grupos electrofílicos al gel a fin de hacerlos más reactivos a losgrupos nucleofílocos presentes en el ligando o la molécula espaciadora. Los siguientesgrupos son algunos de los más importantes.

Imidocarbamato

Oxirano

Aziridina

C=NHO

O

- CH - CH2

O

NH

- CH - CH2

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Doble enlace activado

Alógenos activados

En casi todos los casos la derivatización de la matriz sigue dos pasos:

• Una activación preliminar en la que se introduce un grupo electrofílico• Un paso de acoplamiento en el que se une el ligando

Halidas de cianógeno

Es el método más utilizado para unir ligandos a las matrices de polisacáridos. Involucrala activación de la matriz con halidas de cianógeno seguida del acoplamiento deaminas primarias alifáticas o aromáticas.

La naturaleza química de esta activación esta sólo parcialmente dilucidada. Elpaso inicial de la activación involucra la formación de un intermediario de cianato quepuede interactuar con los hidroxilos adyacentes para formar imidocarbonatos cíclicos yacíclicos. Esta activación da lugar a un decremento en la capacidad de hinchamientode la matriz y le proporciona mayor estabilidad térmica debido a que el imidocarbonatoreacciona con los hidroxilos de las cadenas vecinas aumentando el entrecruzamientoentre ellas

- S - CH = CH2

O

O

- CH2 - C - Br

O

- CO - CH2 -Br

- OH

- OH

CNBr- O - C = N

- OH

- O - CO - NH2

- OH

- O

- OC = NH

H20 Carbamato(inerte)

Imidocarbamato

Activación

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Cromatografía de afinidad

17

Como puede verse en la figura anterior el intermediario de cianato puedehidrolizarse a una forma completamente inerte de carbamato. La hidrólisis alcalinaprolongada bajo condiciones suaves convierte un gel activo en un polímerocarbamilado inactivo. Por esta razón es muy importante llevar a cabo la activacióndentro de un periodo muy corto, usualmente de 8 a 12 min.

NOTA IMPORTANTE: El bromuro de cianogeno (CNBr) se vende en forma depolvo blanco que a temperatura ambiente se volatiliza generando un vapor irritante yvenenoso. Más aún, lotes viejos de CNBr presentan coloraciones amarillo-anaranjadasque tienden a explotar con el tiempo. Estas preparaciones deben destruirseadicionando sulfato ferroso alcalino para dar lugar a ferrocianídas que soncompletamente inofensivas y fáciles de desechar. Alternativamente el CNBr puederecuperarse por sublimación.

Como regla general las matrices de cromatografía de afinidad puedenreutilizarse varias veces sin una pérdida considerable de capacidad de unión. Sinembargo, se han detectado ciertas “fugas”, significativas y continuas, del ligando enalgunas aplicaciones. Tal solubilización no interfiere con la interacción entre el ligandoacoplado y el afinante sobre todo si la unión entre ellos no es muy fuerte.

En sistemas donde la afinidad entre el ligando y el afinante es muy alta (Kdcercana a 1 nM) y el ligando libre resulta ser más efectivo para formar el complejo conel afinante se provoca la pérdida por elución de la molécula de interés. Este fenómenopuede hacer pensar que el afinante ha quedado irreversiblemente unido a la matriz sincapacidad de recuperarse (dado que el complejo ligando-afinate no puede detectarse)cuando en realidad nunca fue adsorbido por la matriz. Problemas de este tipo sonparticularmente frecuentes en la purificación de esteroides unidos a proteínasreceptoras.

C = NH- O

- O

- O - C- NH-proteína

- OHNH2

- O

- OC = N - proteína

- O - C - CO - NH - proteína

- OH

NH2-proteína

Derivado de isourea

N - Imidocarbamato

N - Carbamato

Acoplamiento

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El problema de la “fuga de ligandos” puede evitarse mediante lavadosexhaustivos y la manipulación de variables como el grado de sustitución del ligando,velocidad de flujo, temperatura, pH, etc. Otros métodos incluyen el uso deespaciadores o el uso de métodos alternativos para la activación de la matriz.

Triazinas

La matrices polihidroxiladas también pueden ser activadas con dicloro-sym-triazinas obien con tricloro triazinas (cloruro de cianógeno). Para hacerlo las triazinas se preparansustituyendo algunos grupos con funciones carboximetoxi o carboximetilamino lascuales reaccionan rápidamente con las matrices adecuadas a pH de 9-11 y a 20o Cpara dar lugar a un complejo monocloro-sym-triazinil-polisacárido. Cuando la matriz hasido activada reacciona muy lentamente con aminas primarias.

El cloruro de cianógeno (tricloro triazina) reacciona con las matrices hidroxiladaspara dar lugar a un derivado dicloro-sym-triazinil-polisacárido muy adecuado paraacoplar proteínas a pH alrededor de 7.

Oxidación por periodato

En este método se oxidan los grupos dioles vecinos con metaperiodato de sodio(NaIO4) para generar funciones aldehído.

La función aldehído reacciona con las aminas primarias a pH 4-6 para formarbases de Schiff. A fin de estabilizar este producto se pone a reaccionar con hidroboratode sodio o, de preferencia, ciano hidroborato de sodio que favorecen el completoacoplamiento del grupo amino (especialmente el ciano hidroborato cuando la cantidadde ligando es muy pequeña). Así mismo también es útil cuando el ligando es lábil en unrango de pH de 9-10 (valores requeridos para la reducción con NaBH4)

El metaperiodato de sodio es soluble en agua y puede removerse rápidamenteal terminar la reacción. El gel activado puede guardarse, durante un mes, a 4o C sinpérdida de potencial de acoplamiento.

- OH

- OH

NaIO4 - CH = O - O - CH2 - N H- R- O - CH = N - RNH2 - R NaBH4

NaBH3CN

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Cromatografía de afinidad

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Oxiranos

Los bisoxiranos (bisepóxidos) o las halohidrínas son compuestos que puedenformar cadenas largas y cuya característica principal es tener anillos electrofílicos detres miembros que pueden ser muy útiles para introducir ligandos de bajo pesomolecular que contengan funciones amino o hidroxilo. La reacción tiene lugar en dospasos:• Activación: Uno de los oxiranos de la molécula (bisglicidil éter o 1, 4 dihidroxi-n-

butano) reaccionan con el hidroxilo de la matriz

• Acoplamiento: Los grupos funcionales restantes reaccionan con el ligando. Elpolímero intermediario, con el grupo oxirano, es atacado por nucleófilos cuyareactividad sigue el orden SH > NH > OH (el pH óptimo de acoplamiento sigue elórden OH > NH > SH de más alcalino a más ácido). El acoplamiento de una aminaprimaria genera una alquil amina.

Mientras que los grupos hidroxilo y tioles generan enlaces éter y tioéter,respectivamente

- OH + CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2

O O

OO

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2

OHOH

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2-NH2-R

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2

-O-R

-O-S

OH OH

OH OH

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Los polímeros hidroxilados (por ejemplo las matrices de polisacáridos) puedenconvertirse en derivados de oxiranos reaccionandolos con epiclorhidrína en solucionesalcalinas. En soluciones demasiado alcalinas estas matrices se pueden entrecruzar

El entrecruzamiento provoca la insolubilidad de la matriz en agua hirviendo y lahace mucho más estable en medio ácido.

Este tipo de activación ofrece ciertas ventajas sobre otros procedimientos yaque, por ejemplo, los enlaces O-C, N-C y S-C generados al acoplar el ligando sonextremadamente estables. Esta característica es de vital importancia cuando esnecesario tratar a la matriz bajo condiciones demasiado alcalinas. Además el uso debisoxiranos de cadenas largas introduce un brazo espaciador bastante amplio(equivalente a 12 átomos de carbono) acoplado a la matríz vía un enlace éter.

Bizaridinas

Son agentes bifuncionales que pueden utilizarse para unir ligandos con grupos amino ohidroxilo a la matriz. Desafortunadamente estos agentes son ionogénicos pues formanaminas al acoplar el ligando a la matriz y por tanto la convierten en un intercambiadoriónico.

Divinil sulfonas

Estos compuestos reaccionan con polímeros hidroxilados para dar lugar a grupos divinilsulfona reactivos

El ataque nucleofílico por los ligandos con grupos tioles, amina o hidroxilo sigueel mismo orden que en el caso de los oxiranos excepto proque la reacción se lleva acabo en una unidad de pH menor. La reacción con una amina primaria produce unaunión alquil amino.

HO-

O

--O-CH2-CH-CH2 + -- O - CH2 - CH - CH2 - O -

O

- OH + CH2=CH-S-CH=CH2

O

O

O

-O-CH2-CH2-S-CH=CH2

O

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Cromatografía de afinidad

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En pHs mayores a 8 se puede presentar cierta liberación de ligandos de bajo pesomolecular. Las proteínas, por otro lado suelen pegarse más fuertemente en el mismorango de pH.

Benzoquinona

Es una quinona que es mucho más reactiva que la divinil sulfona para atacar matriceshidroxiladas.

Activación

Acoplamiento

El bloqueo de los grupos residuales se lleva a cabo mediante la adición de glicina

O

-O-CH2-CH2-S-CH=CH2

O

O

-O-CH2-CH2-S-CH-CH2-

O

NH-R+ NH2-R

-OH + -O-

O

O

O

O

-O- -O-

O

O

O

O

+ NH2-R

_NH-R

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Alógenos

Los hidroxilos de las matrices de polisacáridos pueden acilarse con bromuro debromoacetilo seguido de la activación de un grupo amino adecuado

Activación

Acoplamiento

La reacción con el ligando puede generar altos niveles de sustitución de acoplamiento.Sin embargo, la sensibilidad del enlace éster a pH neutro puede ser una desventaja.

También pueden utilizarse dicloruros de ácidos dibásicos, como el dicloruro de ácidoglutárico, para inmovilizar los ligandos.

Activación

Acoplamiento

+ NH2-R-O-C-CH2-Br

O

-O-C-CH2-NH-R

O

- OH + Cl-C-X-C-Cl

O

-O-C-X-C-Cl

OO O

+ NH2-R -O-C-X-C-NH-R

OOO

-O-C-X-C-Cl

O

- O-C-CH2-Br

O

- OH + Br-C-CH2-Br

O

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Cromatografía de afinidad

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Grupos tioles

El método de intercambio de de tioles-disulfuros ha sido un procedimiento muyatractivo para acoplar ligandos a matrices ya activadas. Los grupos tioles puedenintroducirse a la matriz acoplando cisteína o glutation a agarosa activada con CNBr oreaccionando derivados ω-aminoalquil [NH2(CH2)nR] con N-acetil homocisteínatiolactona con una pequeña cantidad de imidazol como catalizador.

Cualquier ligando que contenga algun grupo tiol puede acoplarse a la matriz enpresencia de ferrocianuro alcalino. L unión resultante puede romperse rápidamentemediante la exposición a L-cisteína, b-mercaptoetanol o ditiotreitol

De forma alternativa la tiol-agarosa puede activarse con 2, 2` dipiridin disulfuro o5, 5`ditiobis (2 acido nitrobenzoico) a pH ≥ 8 para, posteriormente, reaccionarlo con unligando que contenga un grupo tiol.

Por otro lado, los ligados con grupos tioles también pueden acoplarse aderivados ω-carboxialquilosmediante condensación por carbodiimida. El enlace tiol-ester resultante puede romperse específicamente a través de la exposición a pHalcalino o hidroxilamina neutra 1 M. En contraste, con alquil halidas, como losderivados de bromoacetamidoalquil de la agarosa, se forma un enlace tiol-eter muyestable.

- SH + SH - R - S - S - R

- NH-(CH2)n-NH +

S= O

NH-CO-CH3

- NH-(CH2)n-NH-C-CH-CH2-CH2-SH

O

NH-CO-CH3

pH 9.7

4o C

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Matrices sintéticasPoliacrilamida

Como se mencionó anteriormente, la poliacrilamida consiste básicamente ensegmentos lineares de polietileno con esqueletos alternados de carbono que poseengrupos amida (-CONH2). La gran cantidad de estos grupos le proporciona un fuertecarácer hidrofílico y son responsables de la baja adsorción de macromoléculas. Laderivatización (activación y acoplamiento) puede llevarse a cabo de dos formas:

• Modificación directa de la matriz• Co-polimerización de la acrilamida/bisacrilamida con un monómero acrílico o vinílico

que posea los grupos funcionales.

Modificación directa de la matriz

Tiene la ventaja de permitir la preparación directa de la matriz seleccionando los gruposfuncionales, el grado de sustitución, la porosidad y el tamaño de la partícula. Losgrupos carboxiamida son resistentes a hidrólisis en un rango de pH bastante amplio.Sin embargo, el nitrógeno de la amida es desplazado rápidamente por ciertoscompuestos nitrogenados dando lugar a amonio

• Aminoetilación

Se adicionan lentamente algunas gotas de etilendiamina anhidro precalentado a90o C

La incorporación de grupos aminoetilo a la matriz está directamente relacionadacon el tiempo de calentado, a 90o C. En un periodo de 7 hrs pueden obtenersedensidades de sustitución cercanas a 1.2 mmol/g de polímero. La velocidad de lareacción depende directamente del contenido de agua de la etilendiamina. Se puedengenerar grupos carboxilo en proporción directa y creciente a la formación de gruposaminoetilo.

• Hidrazinación

Se adicionan las gotas secas de la matriz a una solución de hidrazina (1-6 M) yse agita levemente a temperatura constante durante el tiempo deseado.

- CO - NH2

NH2-CH2-CH2-NH2

- CO-NH-CH2-CH2-NH290o C

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Cromatografía de afinidad

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El grado de hidrazinación puede regalarse por medio de la concentración dehidrazina en el tiempo y temperatura de la reacción. La proporción de grupos carboxilogenerados durante la hidrazinolisis (2-3 %) es menor que la generada durante la aminoetilación (8 %)

– Hidrolisis alcalina

Sucede por la desaminación de la matriz. Las gotas secas de la amtríz seadicionan a buffer carbonato/bicarbonato 0.5 M pH 10.5 y el grado de hidrólisis secontrola mediante el tiempo de calentado a 60o C (tambien se puede controlar variandolos valores de pH a temperatura constante)

Los grupos que se obtienen de las diferentes reacciones pueden convertirsesubsecuentemente en una gran variedad de otros derivados con las reaccionesadecuadas antes de acoplar el ligando. Cuando el ligando es una proteína, ésta puedeacoplarse directamente a la matriz con glutaraldehído.

Modificación indirecta

• Co-polimerización acril-bisacril-ligando

Se obtiene acoplando ácido acrílico al amino terminal del ligando para entoncescopolimerizarlo con acrilamida y N, N’ metilen bisacrilamida. Esta metodología permiteun fácil control tanto de la porosidad del gel como del nivel de sustitución del ligando.

Lamentablemente la necesidad de sintetizar ligandos con dobles ligaduras hacemuy poco útil la aplicaci¤on de etse método. Sin embargo, la aplicación de N-hidroxiftalmida permite una rapida reacción con ligandos que contienen funcionesamina primarias.

- CO - NH2 NH2-NH2

- CO-NH-NH247-50o C

OH-

- CO - NH2 - C

O

O-

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Donde

Vidrio

La derivatización se basa en utilizar compuestos que reacciones con agentesacopladores de silanos. Estos compuestos cuentan con dos grupos funcionales dentrode la misma molécula: un grupo órganico en un extremo y; un grupo silil alcoxi en elotro. Los organo-silanos comerciales incluyen epoxi-, vinil-, tiol-, alquilamina-,alquilcloro-, y fenil-silanos. El γ-aminopropil-trietoxisilanose usa comunmente paraintroducir aminas primarias a las matrices de vidrio. Subsecuentemente, el productopuede derivarse a una variedad de grupos funcionales.

- CH2-CH-CO-NH2

Acrilamida

- CH2-CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH-CH2 Poliacrilamida

- CH2-CH-CO-R Acriloil éster

Co-polimerización

-CH2-CH2-CO-R

NH2-R´

-CH2-CH2-CO-NH-R´

R = - O -

O

O

- O -

O

O

o

N-Hidroxisuccinimida N-hidroxiftalmidina

O-Si-OH

O

O

O-Si-OH

O

+ CH3-CH2-O-Si-CH2-CH2-CH2-NH2

O-Si-O-Si-CH2-CH2-CH2-NH2

O O

O OH

O-Si-O-Si-CH2-CH2-CH2-NH2

O OH

O-CH2-CH3

O-CH2-CH3

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Cromatografía de afinidad

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Por otra parte, los residuos de silanol en la superficie se encuentran disponiblespara la activación con CNBr. El procedimiento es idéntico al que se usa con matricesde polisacáridos.

Otras

Los soportes de hidroxialquil metacrilato contienen grupos hidroxilo que sonsuceptibles a la activación por CNBr además de los otros procedimientos de que sehabló para las matrices de polisacáridos. Por otro lado, los geles pueden formarse co-polimerizandolos con monómeros que contengan grupos reactivos de una formaanáloga a la que se usa para las matrices de poliacrilamida.

BRAZOS ESPACIADORES

Son molécualas que alejan al ligando de la matriz permitiendo que el afinante loencuentre con mayor facilidad. Son particularmente importantes cuando el ligando espequeño, la afinidad de ligando por el afinante es baja (Ki ≥10-4 M) y en aquellos casosen los que el ligando involucra proteínas de pesos moleculares muy altos. Existenvarios tipos de brazos espaciadores que pueden utilizarse

– Hidrofóbicos. Un ω-aminoalquil del tipo NH2(CH2)nR, donde n=2-12 y R puede seruna función amino o carboxilo, se acopla a una matriz activada. Dos de lascombinaciones más usuales se dan combinando Sefarosa con α. ω-aminoalcanos(conocido comercialmente como AH Sefarosa 4B) o bien con un α-amino, ω-carboxialcano (cuyo nombre comercial es CH Sefarosa 4B). También sueleutilizarse 3. 3’ diamino dipropilamina mediante a activación con CNBr.

– Hidrofílicos. Usualmente se preparan acoplando 1, 3 diamina-2 propanol amatricesde agarosa activadas con CNBr. Pueden adicionarse brazos de oligopéptidos comooligoglicina, glicil-glicil-tirosina, glicil-glicil-serina o glicil-glicil,ácido glutámico queproveen a la matriz con grupos fenólicos, tiólicos, hidroxilos o carboxilos con lo cualse introducen nuevos grupos reactivos a la matriz.

– Macromoléculas multivalentes. Bajo este rubro se utilizan polipetidos o proteínascomo espaciadores hidrofílicos con multiples uniones que reducen tanto la fuga delcomplejo ligando-espaciador como las interacciones hidrofóbicas no específicas.Las moléculas más comunmente usadas son poli-(L-lisil)-, poli-(DL-alanil)-, poli-(lisil)-agarosa. También se ha podido acoplar albúmina sérica bovina a agarosaactivada con CNBr en presencia de una alta concentración de urea para evitar quese despliegue y ayudar a que se una en más sitios.

– Moléculas libres de carga. Como ya se mencionó, al acoplar aminas primarias a unamatriz activada con CNBr se forman N-isoureas que le dan a la matriz fuertespropiedades de intercambiador iónico. Este problema se puede solucionaradicionando dihidrazida de ácido adípico, dihidroazida de ácido succínico, hidrazidade ácido poliglutámico o hidrazida de ácido poliacrílico a una matriz activada con

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CNBr. Aunque por un lado éstos compuestos evitan la aparición de cargas en lamatriz por otro lado presentan cierta “fuga” del brazo espaciador.

BLOQUEO DE LOS SITIOS INACTIVADOS

Después que el ligando ha sido unido a la matriz es recomendable bloquear lossitios remanentes que puedan tener la capacidad de unirlo. En los casos en los que seutilizan grupos amino para unir al afinante las moléculas más comunmente utilizadaspara bloqueo son aminas primarias de bajo peso molecular (por ejemplo 2-amino-etanol o glucosamina).

En geles que contienen éster como grupos reactivos los sitios inactivos suelenbloquearse adicionando Tris 0.1 M pH 8. En los casos en los que los grupos reactivosson funciones aldehído los sitios inactivos se bloquean con borohidruro de sodio justodespués de la unión. Este tratamiento no sólo ayuda a la reducción de los adehídosremanenetes sino también a la estabilización de las uniones entre el afinante y lamatriz.

Si el ligando se ha unido a un espaciador puede suceder que una región delespaciador, casi siempre en los extremos amino o carboxilo, permanezca activa. En elcaso de ser grupos carboxilo pueden bloquearse con Tris (2-amino,2-hidroximetilpropano- 1,3-diol) y con N-ciclohexil N’ [2 (4-morfolinil) etil-carbodiimidametap-tolueno sulfonato. Cuando el ligando se ha unido a una CH Sefarosa 4Bmediante unión con carbodiimida se puede bloquear con glucosamina o 2-aminoetanol.En el caso de una AH Sefarosa 4B se utiliza ácido acético o anhídrido acético paraloquear los grupos amino.

Otro paso importante en la preparación de alguna matriz aprticular para realizar lacromatografía propiamente dicha consiste en el lavado exhaustivo de todas lassustancias que no se unieron covalentemente a la superficie de la matriz. Se obtienenmejores resultados si el lavado se lleva a cabo alternando buffers ácidso y alcalinos obajo alta fuerza iónica.

LIGANDOS

Una molécula puede ser utilizada como ligando siempre y cuando se unaespecífica y reversiblemente a un afinante de interés. Al escoger un afinante debetenerse en cuenta la naturaleza de la interacción afinante-ligando y la naturaleza delligando mismo para saber si tiene o no (y cuantos) sitios potenciales para para acoplara la matrizasí como la albilidad que pueda presentar bajo las condiciones deacoplamiento.

Cuando la macromolécula que se pretende aislar es una enzima los ligandosque suelen utilizarse pueden ser inhibidores competitivos, sustratos y sus análogos,productos, cofactores, efectores alostéricos, anticuerpos y hasta compuestos que

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Cromatografía de afinidad

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contengan iónes metálicos o grupos SH-. Para enzimas DNA específicas se puedenutilizar fragmentos de DNA de cadena sencilla.

Una rama muy explotada de la cromatografía de afinidad es la purificación demacromoléculas mediante el uso de anticuerpos o antígenos. La constante dedisociación de una interacción antígeno-anticuerpo cae en un rango de 10-5-10-8 M.Para la purificación de anticuerpos se utilizan los mismos antígenos o haptenos usadospara su producción.

Si la molécula que pretende aislarse es un carbohidrato suelen utilizarse lectinascomoligandos. Las lectinas son proteínas o glicoproteínas que presentan ciertaselectividad por carbohidratos. Cuando la molécula a aislar es una glicoproteína esrecomendable conocer la naturaleza del carbohidrato terminal para poder seleccionaruna lectina específica. Las lectinas, en la mayoría de los casos no son específicos paraun azúcar en particular aunque existen grandes diferencias en los grados deespecificidad.

Otras macromoléculas que pueden aislarse por cromatografía de afinidad sonalgunos receptores membranales utilizando sus correspondientes hormonas comoligandos. La cantidad de receptores membranales específicos en una célula cualquieraes muy pequeña (por ejemplo, la concentración del receptor de glucagón en una célulapancreática es de 26 pmol/mg de proteína), es por eso que la interacción hormona-receptor debe ser muy fuerte (Kd entre 10-6-10-11 M) para asegurar la unión en unsistema que incluye varios fragmentos de membrana. Aunque las dificultades técnicasque se deben sladar en este tipo de purificaciones son muy variadas se han podidoobtener fragmentos membranales con receptores específicos (por ejemplo, el recptorpara la α-bungarotoxina del órgano eléctrico de Torpedo californica).

Para la purificación de transportadores específicos o proteínas de unión se hanutilizado diversas vitaminas y hormonas. La constante de disociación de algunos deestos complejos andan entre 10-7-10-16 M. Debido a la baja concentración a la cualpueden encontrarse es necesario modificar lso esquemas convencionales depurificación, sin embargo, se pueden obtener buenas cantidades del afinante.

El uso de ligandos de ácidos nucleicos como mononucleótidos, oligonocleótidosy ácidos nucleicos ha sido de enorme importancia tanto para el aislamiento como parala caracterización de enzimas que participan en seintesis o degradación de éstoscompuestos. Resulta fácil pensar que inmovilizarse bases nuclotídicas, nucleósido uoligonucleótidos para separar, fraccionar y determinar la estructura de varios ácidosnucleicos.

La dodecil amina ha sido un ligando muy útil para separar lípidos y parahormonas se pueden utilizar anticuerpos, proteínas transportadoras o lectinas.

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ANEXOS

Activación de matrices de polisacáridos por CNBr

Antes de la activación o derivatización la matriz debe lavarse exhaustivamente pararemover agentes bacteriostáticos y otros preservativos presentes.

Método de activación-titulación

• Adicionar 20 g de agarosa (peso húmedo) a 20 ml de agua destilada• Agitar lentamente con agitador magnético a una temperatura de 10-15o C• Ajustar el pH a 10.8 ± 0.1 adicionando NaOH 4N• Adicionar CNBr (10 mg/g gel húmedo) y mantener el pH a 10.8 ± 0.1 con

NaOH 4N• Lavar

Método de activación por carbonatos

• Una cantidad adecuada de gel se suspende en un volumen igual de buffercarbonato/bicarbonato 2M pH 10.9. Amntener la mezcla de 4-5o C

• Agregar CNBr (100 mg/g de gel húmedo disuelto en acetonitrilo)• Incubar 10 min de 4-5o C• Lavar

0

20

40

60

80

100

0 40 80 120 160

µmol

es d

e gl

icin

a un

idas

/ml d

e ag

aros

a

mg CNBr adicionados /ml de agarosa

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Cromatografía de afinidad

31

Fig. 4 Relación entre la concentración de CNBr utilizada para activar una matriz de agarosa y la cantidad de ligandounido (glicina)

En casos en los que la cantidad de ligando sea muy alta suelen utilizarseconcentraciones de CNBr de 50 y 200-300 mg/g de gel húmedo titulándose,respectivamente con 2 M y 8 M NaOH. La cantidad de un ligando pequeño, glicina,unido a agarosa activada fue linealmente proporcional a la concentración de CNBrutilizada hasta los 80 mg/g. Los ligandos protéicos pueden mostrar comportamientossimilares.

Lavado de las matrices activadas

Una vez que se ha activado una matriz con CNBr debe lavarse rápidamente ytransferirse al medio de acoplamiento puesto que el intermediario de cianato es pocoestable.

Al final de la activación el gel debe enfriarse rápidamente colocándolo en hielo ydebe transferirise a un tubo de vacío. La suspensión se filtra rápidamente a unrecipiente que contenga sulfato ferroso para remover el CNBr y las cianidas que noreaccionaron a fin de formar ferrocianidas inofensivas. El gel se lavasubsecuentemente bajo succión con agua fría y el buffer que va a ser utilizado para elacoplamiento.

Acoplamiento

Las aminas primarias no protonadas pueden acoplarse con considerable eficiencia alas matrices activadas con CNBr . Aún cuando no se conoce la naturaleza exacta delos productos acoplados, existe evidencia de la formaciónde N-isoureas

Para evaluar la capacidad de acoplamiento de un compuesto a matricesactivadas por CNBr se utilizan moléculas como la alanina que posee un grupo a-aminoy que presenta un rango óptimo de acoplamiento en un pH entre 9.5 y 10

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.Figura 5. Efecto del pH en el acoplamiento de [14C] alanina a una matriz de agarosa activada con CNBr

Este comportamiento es el reflejo de dos fenómenos: la carga del a-amino y laestabilidad del complejo activado. El extremo ascendente que se muestra en la figuraesta determinado por la forma reactiva desprotonada del ligando, el pH deacoplamiento debe escogerse por arriba del pKa del ligando pero no debe rebasar elvalor de 10. De hecho se calcula que debe ser: 7-8 para aminas aromáticas (pKacercano a 5); 9.5-10 para aminoácidos (pKa del a-amino cercano a 8) y; 10 paraaminas alifáticas (pKa entre 9 y 10).

Se debe evitar el uso de buffers que contengan grupos amino, como el tris, yaque estos grupos competirán con las funciones amino del ligando por los gruposactivados. Los buffers más comunmente utilizados son el borato y el bicarbonato.

El decremento en el acoplamiento que se muestra en la figura anterior muestrauna fuerte caida en la estabilidad del complejo activado. La sefarosa actvada con CNBrtambién es inestable a temperatura elevadas, es por eso que las reacciones debenllevarse a 4o C.

Como se mencionó anteriormente, la matriz recién activada se poneinmediatamente en contacto con el ligando, la reacción de acoplamiento se lleva a cabode 2-3 hrs usualmente. Sin embargo, es conveniente que se permita que la reacción selleve a cabo durante toda la noche a 4o C para asegurar la completa pérdida de grupos

0

2

4

6

8

10

12

14

5 6 7 8 9 10 11 12

Ala

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a (

µmol

es/m

lde

agar

osa)

pH

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Cromatografía de afinidad

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reactivos en la matriz. Aún bajo estas condiciones algunos grupos reactivospermanecen en la matriz (especialmente con ligandos muy grandes). Estos gruposresiduales pueden bloquearse reaccionandolos con 1-amino-2,3-propanodiol, D-glucosamina o etanolamina

La cantidad de lligando unido a una matriz activada con CNBr está en función dela cantidad adicionada durante el acoplamiento

La gráfica de la Fig. 6 es reflejo del comportamiento de la adición de ligando a lamatriz y se ha demostrado que las matrices de polisacáridos tienen una marcadatendencia a unir proteínas (covalentemente) bajo condiciones ligeramente alcalinas, esdecir, siguen un comportamiento muy parecido al que se muestra en la gráfica ypueden ser utilizadas como ligandos específicos. Por ejemplo, la quimotripsina y lapapaina pueden unirse a matrices de dextrano, agarosa o celulosa para dar lugar aconjugados que contienen hasta 30% de proteína. Sin embargo, la exposición de estasenzimas a polímeros activados bajo un pH donde la amyoría de los grupos amino de laproteína esten desprotonados puede provocar uniones en más de un punto del ligandoprovocando un descenso de actividad. Este problema puede resolverse acoplando envalores por debajo del pH óptimoa fin de que sólo algunos residuos esténdesprotonados.

20

40

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0 20 40 60 80 100 120

µmol

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ml d

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µmoles de glicina adicionada/ml de agarosa

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Figura 6. Efecto de la concentración de glicina en la unión de glicina e una matriz de agarosa activada con CNBr.

Activación y acoplamiento con metaperiodato de sodio

Activación

• El gel se mezcla con un volumen igual de NaIO4 0.2 M suavemente por 2 hrs atemperatura ambiente

Acoplamiento con hidroborato de sodio

• La matriz oxidada se filtra y se lava exhaustivamente con agua destilada• Se introduce el ligando. El pH se lleva a 9 adicionando Na2CO3 sólido. Una vez

alcanzado este valor se adicionan 10 ml de NaBH4 5 M y se mezcla por agitacióndurante 12 hrs.

• El gel se lava exhaustivamente con NaCl 1M hasta que se eliminen por completo lasdiaminas libres

Acoplamiento con ciano hidroborato de sodio

• Lavar el gel con buffer fosfato 0.5 M pH 6• Adicionar buffer fosfatos 0.5 M pH 6 + 1-50 mM ligando + 0.5 mM NaBH3CN y

mezclar suavemente por volteo durante 3 días a temperatura ambiente• Lavar exhaustivamente. Adicionar 1 ml/ml de gel de NaBH4 1 M para reducir los

grupos aldehído que no reaccionaron. Se dejan reaccionar durante 15 hrs a 4o C• Lavar exhaustivamente

EJEMPLOS PRÁCTICOS

En este apartado se encontrarán algunos ejemplos de la utilización de las metodologíasantes revisadas y las fromas en las que se recuperaron algunas macromoléculasimportantes.

Ejemplo 1. Expressing an purifying membrane transport proteins in high yieldsHale C. C., Hill. C. K., Price E. y Bossuyt J. 2002. J. Biochem. Biophys Methods.

Los autores proponen una metodología que resulta en mayor cantidad deproteína nativa purificada expresando el gen recombinante en células de insectoutilizando baculovirus como vector de expresión. Éste vector le adiciona 6 residuos dehistidina en el extremo carboxilo terminal del gen permitiendo su posterior recuperaciónen una columna Níquel. Esta metodología explota la gran afinidad que presentan elniquel por los residuos de histidinas (y de cisteína). Para recuperar la muestra se utilizóun buffer que contenía imidazol 500 mM

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Cromatografía de afinidad

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His-tagged recombinant NCX protein from Trichoplusia ni larvae vesicles was subjected to Ni2+ affinitycolumn chromatography. Eluted NCX protein was reconstituted into proteoliposomes. Column proteinrecovery (n=3) and affinity purified NCX activity (n=4) are compared. Activity of reconstituted affinitypurified NCX is compared to activity of NCX reconstituted directly from larvae vesicles. Conclusion: 5% oflarvae vesicle protein was recovered with a 13.4-fold increase in NCX specific activity.

Ejemplo 2. Overexpression and reconstitution of a Rieske iron-sulphur protein from thehigher plant. Gubernator B., Seidler A., Rogner M. y Szczepaniak A.2003. Prot.Expression. Pur. 29 (1): 8-14.

El objetivo principal de este artículo es conocer la estructura de una proteína queparticipa activamente en la cadena de transporte de electrones en células de plantas.Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo es clonar el gen en unvector de expresión que le añade la proteína de unión a maltosa (MBP) a su proteínade interés. La columna que utilizaron fue de amilosa y eluyeron la proteína de interéscon maltosa que compite con la amilosa por la unión con la MBP.

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Fig. 3. Para conocer la estructura de una proteína que participa activamente en la cadena de transportede electrones en células de plantas. Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo esclonar el gen en un vector de expresión para purificar por afinidad la proteína de fusión.

Ejemplo 3. Purification and physicochemical characterization of a cotyledonary lectinfrom Luetzelburgia auriculata. Oliveira A. T., Melo V. M., Camara M., Vasconcelos I.,Beltramini L., Machado O., Gomes V., Pereira S., Fernandes C., Nunes E., CapistranoG. y Montero-Moreira A. 2002. Phytochemistry 61 (3):301-310

En este caso lo que buscan los autores es no sólo purificar sino tambiéncaracterizar lo mejor posible una lectina de plantas. La cromatografía de afinidad sirvesólo como uno de muchos pasos que siguen para lograrlo. Una vez que los cotiledonesde la planta habían crecido lo suficiente hicieron un homogenado seguido de uncentrifucación para eliminar la mayor parte de los restos celulares. Luego de éstofraccionaron el sobrenadante con diferentes concentraciones de sulfato de amonio y losprecipitados resultantes los dializaron contra agua. Las fracciones dializadas sepasaron a través de una columna de agarosa-N-acetyl D galactosamina. Las lectinasson proteínas que unen diversos tipos de azucares. Para eluir la muestra utilizaron unbuffer que contenia 200 mM galactosa.

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Cromatografía de afinidad

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Fig. 1. Agarose-N-acetyl--galactosamine affinity chromatography. The 40–60% ammonium sulfate fractionwas applied to the agarose-N-acetyl-D-galactosamine column (2.5 X 5.0 cm) equilibrated with 0.05 Msodium acetate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M NaCl. The lectin was eluted with 0.2 M D-galactoseincluded in the above buffer at a flow rate of 30 ml h-1. Fractions (2.5 ml) were collected and monitoredfor protein content at 280 nm.

Ejemplo 4. Novel ligands for the affinity chromatographic purification of antibodies.Fassina G., Ruvo M., Palombo G., Verdoliva A. y Marino M.J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. 49 (1-3): 481-490

Si bien el uso de la cromatografía de afinidad en la purificación de anticuerpos ha sidoampliamente requerido, en muchas occasiones se ve un poco frenado por la pocadisponibilidad de ligandos. En este artículo los autores hacen una revisión de distintosligandos sintéticos que podrían utilizarse a fin de purificar distintos tipos deinmunoglobulinas

a Depending on the type of support.b No binding or very weak binding.c Depending on IgG isotype (in mg Ig/g wet gel: IgG1 12.3, IgG2 10, IgG3 4.8, IgG4 8.7).d Only for rat and mouse IgG.e Selective for IgM with buffers at high ionic strength.

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f Not determined.g For monoclonal antibodies.

Table 1. Capacities (mg Ig/ml support) of different ligands for various immunoglobulin classes

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