1. колоквијум ПОГЛАВЉЕ 6: МЕТОДЕ СТАНДАРДИЗАЦИЈЕ ·...

Вежбе: Математичке методе у физичкој хемији 1. колоквијум

Александра Ракић 1

ПОГЛАВЉЕ 6: МЕТОДЕ СТАНДАРДИЗАЦИЈЕ

Приликом анализе материјала као последица хемијских или физичких процеса настаје сигнал, тј.

експериментално мерење чија је величина пропорционална количини аналита у испитиваном

материјалу. Сигнал може бити било шта што се може експериментално измерити (маса, запремина,

апсорбанција...). Анализирани материјал се састоји од супстанције коју желимо одредити (аналит) и

матрикса (растварач, реактант, интерференти...). Постоје две класе аналитичких метода зависно од

тога да ли је сигнал пропорционалан апсолутној или релативној количини аналита.

1. Укупне (класичне) аналитичке методе су методе чији је сигнал пропорционалан апсолутној

количини аналита:

SA = kА·nA (1)

SA је сигнал пореклом од апсолутне количине супстанце (nA) са константом пропорционалности kА.

Константа kА представља осетљивост методе, тј. могућност методе да разликује два материјала са

различитим садржајем аналита. Осетљивост показује колико се промени сигнал за јединичну

промену количине аналита:

AA

A

Sk

n

(2)

Маса, запремина и наелектрисање су најпознатији сигнали за одговарајуће укупне методе анализе

гравиметрије, титриметрије и кулометрије.

Сем у неколико изузетака, сигнали у укупним методама анализе су последица једне или више

хемијских реакција у којима учествује аналит. Ове реакције укључују било коју комбинацију

таложних, кисело-базних, редокс реакција или реакција комплексирања. Стехиометрија сваке

реакција мора бити позната како би се добио број молова аналита из једначине 1.

2. Концентрационе (инструменталне) методе анализе су методе чији је сигнал пропорционалан

релативној количини аналита:

SA = kА·CA (3)

SA је сигнал пореклом од релативне количине супстанце (CA) са константом пропорционалности kА.

Методе као што су спектроскопија, потенциометрија и волтаметрија спадају у ову класу аналитичких

метода. Пошто је већина њих заснована на мерењу оптичких или електричних сигнала, оне су

познате и као инструменталне методе. За концентрационе методе, веза између аналита и сигнала је

функција која зависи од експерименталних услова и карактеристика уређаја којим се врши мерење

сигнала. Из тог разлога се kА·из једначине 3 мора експериментално одредити.



Код потпуно селективних метода сигнал потиче само од аналита као што је то случај у једначинама

1 и 3. Међутим, у већуни ситуација сигнал из анализираног материјала не потиче само од аналита,

већ и од других супстанци (interferent):

S = SA + SI (3)

S = kА·nA + kI·nI (4)

S = kА·(nA + KA,I·nI) (5)

S = kА·CA + kI·CI (6)

S = kА·(CA + KA,I·CI) (7)

S је сигнал из анализираног материјала пореклом од свих супстанци од којих је материјал сачињен;

SA и SI су сигнали пореклом од аналита и интерферента; kA и kI су осетљивости метода за аналит и за

интерферент; nI и CI су апсолутне и релативне количине интерферента у анализираном материјалу.

Интерферент је супстанција која утиче величину сигнала, а није аналит.

Коефицијенат селетивности показује колико је метода осетљивија за интерферент у односу на

аналит:

,I

A IA

kK

k (8)

Може имати позитивне или негативне вредности зависно од тога да ли је утицај интерферента

супротан од утицаја аналита на укупан сигнал. Ако је коефицијент селективности већи од +1 или

мањи од –1, метода је селективнија за интерферент него за аналит. Поред интерферената допринос

укупном сгналу може потицати и од супстанција које интерагују са аналитом (reagent):

S = SA + SI + SR (9)

S = kА·nA + kI·nI + SR (10)

S = kА·CA + kI·CI + SR (11)

SR сигнал пореклом од реактанта.

Укратко сигнал пореклом од реактаната и од интерферента представља сигнал позадине (blank):

S = SA + SBLANK (12)

S = kА·nA + SBLANK (13)

S = kА·CA + SBLANK (14)

Да би се одредиле тачне вредности за nA и CA неопходно је елиминисати одређене грешке које утичу

на S, kА и SBLANC помоћу калибрације, стандардизације и снимања базне линије (сигнал позадине -

SBLANK). Сигнал позадине се одређује тако што се сними сигнал за исту количину и састав матрикса

као што је количина материјала и састав матрикса у материјалу. Овај сигнал је потребно одузети од

сигнала испитиваног материјала пре него што се настави са даљом аналитичком процедуром.



Калибрација је процес при коме се помоћу стандарда обезбеђује да инструмент или уређај којим се

мери сигнал ради коректно.

У принципу, требало би да буде могуће одредити вредност kА за било коју методу разматрањем

хемијских и физичких процеса одговорних за сигнал. Нажалост, примена оваквих прорачуна је

ограничена због недовољно развијеног теоријског модела неиделаних процеса. У таквим

околностима вредност kА се мора одредити експериментално анализирањем једног или више

стандардних раствора са познатом количином аналита. Стандардизација је процес

експерименталног одређивања односа између сигнала и количине аналита.

Стандардизација коришћењем једног стандарда (у једној тачки) - Single-point standardization

Најједноставнији начин да се утврди вредност за kA из једначине 3 је коришћењем једног стандарда

(Single-point standardization) познате концентрације аналита. Припреми се један стандард са познатом

количином аналита, StAC . Након измереног сигнала аналита из стандарда stS израчунамо константу

сразмерности:

StA St

A

Sk

C (15)

Коришћењем једног стандарда све одређене и неодређене грешке се преносе и утичу на вредност

константе. Свака несигурност константе значајно утиче на повећање несигурности у одређивању

вреднсти концентрације аналита (слика 1).

Слика 1. Пример како погрешна примена једног стандарда може довести до значајне одређене

грешке у одређивању концентрације аналита у материјалу.



Коришћење једначине 3 за одређивање концентрације аналита у материјалу чија се вредност доста

разликује у односу на концентрацију аналита у стандарду заснива се на претпоставци да Ak има

сталну вредност за широк опсег концентрација аналита. У највећем броју случајева то није тачно.

Поступак са једним стандардом могуће је користити само ако су концентрације аналита у уском

опсегу интервала и ако је концентрација аналита у испитиваном материјалу блиска концентрацији

аналита у стандарду (пр. клиничке лабораторије).

Боља опција је припремање серије стандарда где свака од њих има различите концентрације аналита.

Треба користити најмање 3 стандарда, а оптимално 5. На основу добијених сигнала нацрта се график

зависносати сигнала од концентрације аналита (калибрациони дијаграм). Након повлачења праве

неким алгоритмом за фитовање добијамо константу пропорционалности Ak из нагиба праве. Када је

калибрациона линија права, онда је осетљивост методе константна. У случају да је у питању крива

линија, осетљивост зависи од концентрације аналита. То је непогодно, јер онда сигнал не зависи само

од концентрације аналита, већ и од осетљивости методе.

1. Метода спољашњег стандарда

Стандарди који су припремани и анализирани одвојено од материјала називају се спољашњи

стандарди.

Пример 1 Метода спољашњег стандарда када користимо само један стандард:

Спектроскопском методома за одређивање количине 2Pb у крви добија се сигнал за стандард

0,474StS чија је концентрација аналита 1,75SPbC ppb . Колика је концентрација 2Pb у крви, ако је

одговарајући сигнал 0,361krvS ?

10, 4740, 2709

1,75St

A StPb

Sk ppb

C ppb

1

0,3611,33

0,2709krv krvPb

A

SC ppb

k ppb

Пример 2 Метода спољашњег стандарда када користимо више стандарда :

Другом спектроскопском методом за одређивање концентрације олова у крви добијен је линеаран

калибрациони дијаграм, чија је једначина:

10, 296 0,003StSt PbS ppb C



Колика је концентрација олова у крви, ако је сигнал 0,397MatS ?

1 1

0,003 0,397 0,0031,33

0, 296 0, 296krv krvPb

SC ppb

ppb ppb

Метода спољашњег стандарда омогућује да слични материјали буду анализирани уз помоћ једне

калибрационе праве. Ова метода је добра за лабораторије где се анализира велики број материјала

где је брзина анализе пресудна.

Постоје и озбиљна ограничења. Однос сигнала и концентрације аналита је одређена за аналит из

спољашњег стандарда. Претпостављено је да разлика између матикса материјала и стандарда не

утиче на вредност Ak . Када се утицај разлике између матрикса стандарда и испитиваног материјала

не може занемарити, уноси се пропорционална грешка (слика 2). Једини начин да се таква грешка

избегне је или да се користе исти матрикси за материјал и стандарде (тежи начин) или да се користи

друга метода (лакши начин).

Слика 2. Приказ праве и привидне осетљивости.

2. Метода стандардног додатка

Компликације због разлика између матрикса испитиваног материјала и стандарда може се избећи

додавањем стандарда у испитивани материјал.



2а. Метода стандардног додатка са разблаживањем

Слика 3. Приказ поступка за методу стандардног додатка са разблажењем.

Први раствор-леви део слике 3.

Запремину течног материјала, MatV , концентрације аналита, MatAC , треба сипати у суд, а затим

растварачем допунити суд до марке (укупна запремина UV ) (горњи део слике 3). Измери се сигнал

разблаженог раствора испитиваног материјала, RMatS .

Други раствор-десни део слике 3

У исту запремину испитиваног материјала MatV дода се мала запремина стандардног раствора, StV , за

коју је концентрација аналита позната, StAC (доњи део слике 3). Затим се смеша испитиваног

материјала и стандарда разблажи до марке, тј. до запремине, UV (доњи десни део слике 3). Након

разблаживања, концентрације аналита из стандарда RStAC и из испитиваног материјала RMat

AC су:



St

RSt St AA

U

V CC

V

(16)

Mat

RMat Mat AA

U

V CC

V

(17)

RMat StS је сигнал који се добија снимањем разблаженог раствора испитиваног материјала и стандарда.

Одговарајуће једначине за оба раствора су:

Први раствор: R Mat MatMat A A

U

VS k C

V (18)

Други раствор: R Mat StMat StMat St A A A

U U

V VS k C C

V V

(19)

Преко односа Mat

U

V

V и St

U

V

V урачунато је разблаживање раствора. Докле год је запремина стандарда StV

мала у односу на запремину материјала, ефекат додавања стандарда у матрикс материјала је

занемарљива. Сматра се да је матрикс материјала исти са матриксом материјала у који је додат

стандард. У том случају је Ak иста у обе једначине. Пишемо:

R RMat Mat St

Mat Mat StMat Mat StA A A

U U U

S SV V V

C C CV V V

(20)

Пример 3 Метода стандардног додатка када користимо један стандард:

Сигнал олова пореклом из крви запремине 1 ml разблажене до укупне запрамине од 5 ml је

0,193RKrv

PbS . У исту запремину крви додат је 1 l стандардног раствор олова и опет је смеша

разблажена до запремине од 5 ml . Концентрација олова у стандардну је 1560 ppb . Овај други

раствор даје сигнал од 0, 419Rkrv StS . Одредите концентрацију олова у крви.

R Rkrv krv St

krv krv Stkrv krv StA A A

U U U

S SV V V

C C CV V V

3

0,193 0, 419

1 1 1 101560

5 5 5krv krvA A

ml mlC C ppb

ml ml ml

0,193 0, 419

0, 200 0, 200 0.312krv krvA AC C ppb



0,0386 0,0602 0,0838krv krvA AC ppb C

0,0452 0,0602krvAC ppb

1,33krvAC ppb

За калибрацију се може користити више стандарда различитих запремина. Калибрациона права је

добијена цртањем RMat StS у функцији од запремине додатог стандарда StV (слика 4а). Из пресека са x

осом одредићемо концентрацију аналита у материјалу. Пресек са x осом је MatA Mat

StA

C V

C

.

Mat StR A A Mat A AMat St St

U U

k C V k CS V

V V

(21)

Слика 4: Калибрациона права за методу стандардног додатка (а) са разблаживањем и (б) без

разблажења.

Пример 4 Метода стандардног додатка када користимо више стандарда:

Испитивани материјал крви има запремину 1 ml . Концентрација олова у додатом стандарду је 1560

ppb . Материјал крви је разблажен до 5 ml пре мерења сигнала. Израз који повезује сигнал олова и

његове концентрације је 10, 266 312Mat St StS ml V . Одредите концентрацију олова у крви.

StV ћемо наћи као пресек праве са x осом, односно када је 0Mat StS .

10 0, 266 312 ml x пресек

48,526 10x пресек ml

MatA Mat

StA

C Vx пресек

C



4 1,008,526 10

1560

MatAC ml

mlppb

48,526 10 15601,33

1,00MatA

ml ppbC ppb

ml

2б. Метода стандардног додатка са разблаживањем

Могуће је примена методе стандардног додатка без разблаживања (слика 5). У том случају мери се

сигнал испитиваног материјала запремине MatV и сигнала из смеше испитиваног материјала и

стандардног додатка запремине Mat StV V , па добијамо једначине:

Слика 5. Поступак за методу стандардног додатка без разблаживања.

MatMat A AS k C (22)

Mat StMat StMat St A A A

Mat St Mat St

V VS k C C

V V V V

(23)

Након изједначавања константи из две једначине:

Mat Mat StMat

Mat StA Mat StA A

Mat St Mat St

S S

C V VC C

V V V V

(24)



Пример 5 Метода стандардног додатка када користимо један стандард:

Четврта спектроскопска метода за квантитативно одређивање концентрације 2Pb у крви даје сигнал

аналита 0,712krvS за 5,00ml крви. Додавањем 5,00 l стандарда концентрације 1560StAC ppb ,

добија се сигнал 1,546krv StS . Одредите концентрацију олова у крви.

krv krv Stkrv

krv StA krv StA A

krv St krv St

S S

C V VC C

V V V V

3

3 3

0,712 1,546

5 5 101560

5 5 10 5 5 10

krvkrvAA

C ml mlC ppb

ml ml ml ml

0,712 1,546

0,9990 1558krvA AC C ppb

0,7113 1.109 1,546krv krvA AC ppb C

1,33krvAC ppb

Стандард се убаца у испитивани материјал, па се калибрациони дијаграм не може користити за друге

материјале. Сваки материјал захтева посебну калибрациону праву. Ова метода је непогодна за

рутинске анализе. Служи још и за проверу рутинских метода.

3. Метода унутрашњег стандарда (internal standard)

Ова метода подразумева да се сигнал аналита из материјала пореди са сигналом друге хемијске врсте

из истог материјала. На тај начин се избегавају све могуће грешке везане за различито третирање

матрикса материјала и стандарда.

Ако материјал садржи аналит концентрације MatAC и унутрашњи стандард концентрације Mat

IStC ,

једначине за однос сигнала и концентрације биће:

A

Mat MatA AS k C (25)

ISt

Mat MatISt IStS k C (26)

A

MatS и ISt

MatS су сигнали аналита (А) и унутрашњег стандарда (ISt) из испитиваног материјала (Mat).

Ak и IStk су осетљивости методе за аналит и унутрашњи стандард.

Дељењем ове две једначине, добијамо:

Mat Mat MatA A A AMat Mat MatISt ISt ISt ISt

S k C CK

S k C C (27)



Аналогно томе је и однос сигнала аналита и унутрашњег стандарда у стандардном раствору:

St St StA A A ASt St StISt ISt ISt ISt

S k C CK

S k C C (28)

Можемо применити снимање на једном стандарду и одредити константу сразмерности:

St StISt ASt StA ISt

C SK

C S

(29)

Када се једном одреди константа, концентрација аналита у материјалу се веома лако одређује.

Mat MatMat ISt AA Mat

ISt

C SC

K S (30)

Када се замени израз за константу из једначине 29 у једначину 30, добија се:

St Mat St MatMat A ISt ISt AA St St Mat

ISt A ISt

C C S SC

C S S

(31)

Пример 6 Метода унутрашњег стандарда када користимо један стандард:

За одређивање олова у крви користи се унутрашњи стандард јона бакра. Стандардни материјал

садржи 1,75 ppb олова и 2,25 ppb бакра и даје однос сигнала 2,37StPbStCu

S

S . У крв је убачена иста

концентрација бакра. Из крви је однос сигнала аналита и унутрашњег стандарда 1,80MatPbMatCu

S

S .

Одредите концентрацију олова у крви.

2,252,37 3,05

1,75

St StCu PbSt StPb Cu

C SK

C S

22,251,80 1,33

3,05

Mat MatMat Cu PbPb Mat

Cu

C SC ppb Pb

K S

Може се користити и више стандарда са различитом концентрацијом аналита, али истом

концентрацијом унутрашњег стандарда. Под овим условима калибрациона линија StAStISt

S

S у зависности

од концентрације аналита је права са нагибом StISt

K

C.

Пример 7 Метода унутрашњег стандарда када користимо више стандарда:

Методом унутрашњег стандарда добијена је калибрациона права:



12,11 0,006St

StAASt

ISt

Sppb C

S

Колика је концентрација олова у крви, ако је 2,80MatAMatISt

S

S ?

1 1

0,0062,80 0,006

1,332,11 2,11

MatAMat

Met IStA

S

SC ppb

ppb ppb

1. колоквијум ПОГЛАВЉЕ 6: МЕТОДЕ СТАНДАРДИЗАЦИЈЕ ·...

Documents

Transcript of 1. колоквијум ПОГЛАВЉЕ 6: МЕТОДЕ СТАНДАРДИЗАЦИЈЕ ·...