1

Estudio teórico del mecanismo de transferencia de hidruro entreFerredoxina-NADP reductasa (FNR) de Anabaena y NADP+

ISAIAS LANS VARGAS

2

Citosol

Lumen tilacoidal

La Cianobacteria Anabaena PCC 7119

FNR2Fldox + NADPH2Fldrd + NADP+ + H+

3

Mecanismo de reacción de la FNR

4

isoaloxazina

FMN

FAD

Riboflavina

Derivados del anillo de isoaloxazina

5

Estados de oxidación de la flavina

6

Mecanismo de transferencia de hidruro

N

N

N-

NH

O

O

C

CHO

C

C

CH2

HO

HO

H

H

H

O

P

O

P

O

O

-O

-O O CH2O

HO OH

N

N

N

N

NH2

N+

NH2

O

O

OHHOPO2

-

O

PO2-

CH2O

HO OPO2H-

N

N

N N

NH2

1 2

34aC

O

4

10a

5

10

5a

9a

6

98

7

1' HH

H H 12

34

5

6

7

5'

H

HN5

FADH- NADP+

Se propone la transferencia neta de hidruro desde el átomo N5 del anillo de Flavina, hacia el átomo C4 del anillo de Nicotinamida

7

La Tyr303 impide una interacción directa entre el anillo de Flavina y el anillo de nicotinamida, de tal forma que debe producirse el desplazamiento de la Tyr303 para que la transferencia de hidruro pueda ocurrir

A B

FAD

Y303

NADP+

NADP+

FAD

FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

Mecanismo de transferencia de hidruro

8

Obtener un conocimiento más amplio del mecanismo de transferencia de hidruro al NADP+ catalizado por la FNR(Tyr303Ser). Lo cual podría darnos una indicación del papel de la Tyr303 en la FNR nativa

Objetivos

Por medio de un estudio Teórico-experimental

Estudio Experimental

Determinar las constantes cinéticas del proceso de transferencia de

hidruro y efecto Isotópico

Estudio Teórico

Obtener detalles estructurales del proceso de transferencia de hidruro en

FNR(Tyr303Ser)

Determinar las Constantes de reacción y efecto

isotópico del proceso de transferencia de hidruro en

FNR(Tyr303Ser)

9

Resultados Experimentales

FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH

kB C

[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]

Tiempo muerto

CTC-2 CTC-1

WT FNR

kHT

kHT-1

Tiempo muerto

FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH

kB C

[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1

Tyr303Ser FNR

kHT

Tiempo muerto

Tiempo muerto

El equilibrio es desplazado hacia la producción de NADPH

El remplazo de Tyr303 por Ser elimina la capacidad de reducción de NADP+

10

La Disposición estructural entre la Flavina y la nicotinamida en el mutante, parece ser adecuada para que se de la

transferencia de hidruro en ambas direcciones

Anabaena Tyr303Ser FNR:NADP+ complex 2BSA

11

Dinámica molecular

Términos de Campos de Fuerza más comunes:

12

QMH-

Métodos mecánico cuánticos (QM)-Pueden tratar reacciones químicas-No pueden tratar sistemas muy grandes

Métodos de mecánica molecular (MM)-No pueden tratar reacciones químicas-Pueden tratar sistemas muy grandes

QM/MM

Parte del sistema más involucrada en la

reacción

Resto del sistemaParte más alejada del

sitio de reacción

13

Programas Usados

CHARMM GAUSSIANCHARMMRATE

14

A B

FAD

Y303

NADP+

NADP+

FAD

FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

Estructura cristalográfica de FNR

15

Dinámica Molecular QM/MM del complejo Y303S FNR:NADP

QM H-

N

N

N-

NH

O

O

C

CHO

C

C

CH2

HO

HO

H

H

H

O

P

O

P

O

O

-O

-O O CH2O

HO OH

N

N

N

N

NH2

N+

NH2

O

O

OHHOPO2

-

O

PO2-

CH2O

HO OPO2H-

N

N

N N

NH2

1 2

34aC

O

4

10a

5

10

5a

9a

6

98

7

1' HH

H H 12

34

5

6

7

5'

H

HN5

FADH- NADP+

Centro de reacción en la FNRModelo del Sistema Biológico Cordenadas Cartesianas de PDB 2BSA.

Estado de protonación: PROPKA. Adición de átomos de H:HBUILD/CHARMM.Neutralización con 7 Na+

Solvataciión TPI3Ptotal número de átomos: 41896(4800 protein atoms)

Equilibrado Campo de fuerza C15HARMM22 Dinámica Molecular NPT (270 K, 1 atm) Condicioniones de límite periódico Particle Mesh Ewald method.

58 átomos QM; 2 Átomos frontera (GHO); 41838 Átomos MM

16

RD RA

Coordenada de reacción (z) = RD- RA

Definición de la coordenada de reacción

17

Potencial de Fuerza Media (PMF)

Muestreo sesgado: umbrella samplingObligo al sistema a muestrear zonas de alta energía

V´(x) = V(x ) + W(x) Wi(x) = 1/2k(x - xo)2

Para la eliminación de sesgado se hace uso del método WHAM

Wi

x

Nº

Con

form

acio

nes

))(ln()( xPTkxW B

18

sims

sims

N

jBjbiasjj

N

iii

TkxwFn

xPxnxP

1,

1

'

/]exp([

)()(

Weighted Histogra Analysis Method (WHAM)

dx)(exexp /)(/xPp TkxwTkF

Bibi

))(ln()( xPTkxW B

19

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

PM

F(k

cal/m

ol)

z(Å)

Proceso endoérgico, con barrera de energía potencial de ~35 kcal/mol

Potencial de fuerza media (AM1)

20

Evaluación del método QM usado

PES de Y303SFNR:NADPAM1 describe mal la contribución de la energía de dispersión al apilamiento y favorece la formación de puentes de hidrógeno

Usando MPWB1K/6-31+G(d,p)level la lumiflavina y 1-metilnicotinamida presentan interacción de apilamiento.

MPWB1K/6-31+G(d,p) Describe mejor las interacciones de apilamiento que B3LYP (6 kcal/mol de diferencia en energía de formación del complejo)

21

Corrección a doble nivel del PMF

RPAM

AMcQM

RPAM

KMPWBcQM

CMAMCMDL zVzVzWzW 11

111

AM1 MPWB1K/631g(d,p) Corrección a doble nivel

FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH

FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH

NT FNR

Y303S FNR

34.9 kcal/mol 35.8 kcal/mol

3.6 kcal/mol

14.9 kcal/mol

AM1

•La corrección de energía con MPWB1K cambia la endoergícidad de la reacción

•La localización del Estado de transición de mueve levemente hacia los productos.

22

Interacción del Centro de reacción con la proteína

23

Atom1 Atom2 X-ray R TS P

N-Arg100 O2-FAD/H- 3.0 2.99 ±0.01 3.14 ±0.02 3.19 ±0.02

OH-Tyr79 O4’-FAD/H- 2.9 2.89 ±0.01 2.84 ±0.02 2.85 ±0.01

Oγ-Ser80 N5-FAD/H- 3.3 3.55 ±0.00 3.60 ±0.03 3.80 ±0.04

N-Ser80 O4-FAD/H- 3.3 3.66 ±0.01 3.43 ±0.01 3.70 ±0.01

O-Cys98 N3-FAD/H- 2.9 3.05 ±0.00 3.03 ±0.01 3.02 ±0.02

O-Glu301 N7N-NADP+/H 4.3 3.78 ±0.03 3.70 ±0.06 3.42 ±0.03

Sγ-Cys261 N7N-NADP+/H 5.0 3.71 ±0.01 3.52 ±0.04 3.66 ±0.01

Sγ-Cys261 C4N-NADP+/H 3.3 3.71 ±0.01 3.95 ±0.02 4.28 ±0.02

Oγ-Ser303 O7N-NADP+/H 3.0 4.13 ±0.01 4.23 ±0.03 4.14 ±0.04

O-Tyr79 N-Ile60 3.1 2.92 ±0.01 2.97 ±0.01 2.91 ±0.01

N-Tyr79 O-Ile60 3.0 2.88 ±0.00 2.89 ±0.02 2.89 ±0.02

Interacción del Centro de reacción con la proteína

24

Variación del ángulo entre los anillos de flavina y nicotinamida en la reacción

•El ángulo N5 – hidruro – C4N se aproxima a 180 y el átomo aceptor y donador se aproximan entre si.

• Deformación del par iónico FNRrd-NADP+, y perdida parcial de la interacción π stacking

•La penalización energética incrementa el costo energético del estado de transición

25

CMFTRR

CMCMCMact GzWzWzG ,,

zWzWzW vibCMQC

RvibCM

FTRRCMQCQC

act WGzWzWzG ,,,

Corrección vibracional

26

Corrección Vibracional

-4 -2 0 2

-4

-2

0

2

B

A

B Gauss Fit of B

-4 -2 0 2-3

-2

-1

0

1

C

A

C Gauss Fit of C

Corrección vibracional H Corrección vibracional D

Ajuste a una curva gaussiana

z

E(k

cal/m

ol)

z

27

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

PM

F(k

cal/

mo

l)

z(Å)

PMF H/D

28

R SP PZ1

Z2

Aproximación a Zona secundaria-estatica(Frozen Bath)

Coeficiente de transmisión neto promedio γ

Por cada configuración de estado de transición vibracional Por cada configuración de estado de transición vibracional i i a a zz**

QCQC::

1) AM1/CHARMM22 SP localización 2) AM1/CHARMM22 MEP3) Corrección a doble nivel del MEP (interpolación usando ISPE).4) Factor de transmisión QuasiclasicoΓi5) Coeficiente de transmisión Semiclasicoκi

29

8 estructuras optimizadas

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

PM

F(k

cal/

mo

l)

z(Å)

R

P

TS

Cálculo Coeficiente de Transmisión: γ

T T T

i(T) = exp{-Gi}

PMF

Vi (s)Para cada configuración i.

Coordenada de reacción z

Gi

tunel

I(T)

30

Coeficiente de Transmisión

Coeficiente de Transmisión:

/

/

E kT

E kT

P E e dET

e dE

0

≠TE

2

1

1 EP E

e

P(E) : permeabilidad (o probabilidad de transmisión):

)exp( */

RT

zG

h

TkTk

QCQCactBMTVTSTEA

T T T

31

RT

zG

h

TkTk

QCQCactBMTVTSTEA */ exp(

)( *CMCM

actzG )( *zG QCQC

act i i k MTVTSTEA / G MTVTSTEA /

act

HT-1 35.04 31.87 0.998±0.003 335.70±142.79 334.82±142.44 2.24X10-10 28.64

HT 20.08 17.02 0.998±0.003 335.70±142.79 334.82±142.44 92.76 13.80

DT-1 35.00 32.67 0.999±0.00 56.37±22.90 56.29±22.84 8.87X10-12 30.43

DT 20.08 17.85 0.999±0.00 56.37±22.90 56.29±22.84 3.52 15.61

Cálculo de la constante de reacción

32

3.44 3.46 3.48 3.50 3.52 3.54 3.56 3.58 3.602.0

2.5

3.0

Ln

(KIE

)

103/T

3.44 3.46 3.48 3.50 3.52 3.54 3.56 3.58 3.602

3

4

5

6

Ln

(ko

bs)

A

B

Cálculo de la constante de reacción

RT

zG

h

TkTk

QCQCactBMTVTSTEA */ exp(

33

Comparación Teórico Experimental

Parametro Teórico Experimental

kHT (279k) 92.8 s-1 190 s-1

kDT (279 K) 3.5 s-1 16.3 s-1

KIE 26.3 11.6

AH/AD12.5

34

• La transferencia de hidruro en la dirección fisiológica desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ no es posible. La reacción inversa, la transferencia de hidruro de NADPH hacia Tyr303Ser FNRox, ocurre.

• Las constantes de reacción teórica y experimental están en concordancia.

• En la zona de reactivos la distancia N5-C4N es compatible con la transferencia de hidruro, pero el ángulo N5-hidruro-C4N no es coolineal, y por lo tanto, la transferencia de hidruro es ineficiente. Al ir de la zona de reactivo hacia estado de transición el ángulo N5-hidruro-C4N se aproxima a 180º haciendo la transferencia de hidruro viable, y la distancia entre átomo donador y aceptor mas pequeña.

• Dado que la anchura del camino de reacción para la transferencia de hidruro es pequeña, la transferencia de hidruro involucra un importante cantidad de quantum mechanical tunneling.

• El KIE H/Des independiente de la temperatura.

• Las deformaciones geométricas que incluyen perdida parcial de interacción π stacking, involucra una gran penalización de energía libre para poder alcanzar el estado de transición. La barrera de energía de la reacción de transferencia hidruro desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ es 15 kcal/mol más baja que la barrera de energía para la reacción inversa, esta diferencia energética podría ser debido a una importante estabilización de la interacción del par iónico FADH-:NADP+ en los reactivo, mientras que en los productos, después de la transferencia de hidruro los dos especies (FAD y NADP) son neutras.

Conclusions

35

WT FNR

Posible role de Tyr303 en WT FNR?

Cualquier factor capaz de romper la interacción entre el par iónico FADH-:NADP+ podría desestabilizar los reactivos, incrementando la constante de reacción. La afinidad por el NADP+ en WT FNR (Kd = 5.7 μM), es mucho mas baja que en el mutante Tyr303Ser FNR (Kd < 0.01 μM) ¿Podría ser atribuida la baja afinidad por NADP+ en WT FNR podría ser atribuida a la presencia de la Tyr303 la cual eliminaría de alguna forma la interacción del par iónico FADH-:NADP+, el cual es muy estable en el mutante Tyr303Ser FNR

36

A B

FAD

Y303

NADP+

NADP+

FAD

E3E2E1

Hipótesis del mecanismo de reconocimiento del NADP+ en la FNR

FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

Simulación NT FNR:NADP

37

Modelo de partida para la simulación del complejo NT FNR:NADP+.

38

Equilibrado del Modelo

Dinámica Molecular con la restricción del movimiento de la Arg 264

Dinámica Molecular con restricción del movimiento de FADH- y NAD+

Simulación del complejo FNR:NADP+

39

R264

Fluctuación de residuos de FNR durante la dinámica molecular

40

PES partiendo del modelo de WT

Plantilla Y303SER

24kcal/mol

Z(Å)

V(k

cal/m

ol)

N1-C4N

N10 N1N

41

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

B

A

W(k

cal/m

ol)

Z(Å)

Corrección a doble nivel del PMF WT

-2 -1 0 1 2-50

-40

-30

-20

-10

0

10

Z(Å)

V(k

cal/m

ol)

pKa Glu301: 5.11 pKa Glu301: 8.04

42

PES con Glu301 protonado

-3 -2 -1 0 1 2 3-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

-3 -2 -1 0 1 2 3

V(k

ca

l/m

ol)

Z(Å)

75kcal/mol

43

PES partiendo de reubicación de TYR

-3 -2 -1 0 1 2 3-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

V(k

cal/

mo

l)

Z(Å)

35kcal/mol

44

Modelos de FNR WT obtenidos con el servidor Geno3D

Plantilla: estructura de FNR PDB (1qga)

45

-3 -2 -1 0 1 2

0

10

20

30

40

50

V(k

cal/

mo

l)

Z(Å)

PES partiendo de un modelo obtenido usando el servidor Geno3D

Plantilla: estructura de FNR de guisante

25kcal/mol

46

N

N

N

NH

R

O

O

N

N

N

NH

R

O

O

N

N

N

NH

R

O

O

-

+*

-

H H

e- + H+ e-

2

3

1

44a

10a

5

109a5a6

987

QN NEUTRA SQ NEUTRA HQ ANIÓNICA

Puntos a tener en cuenta para la simulación de la FNR WT

Glu301Ser80

47

Gracias por su atención