Oxidacin Microbiolgica de Alcoholes por

Nocardiacorallina

8.276

n . ..

QUE PARA

OBTENER EL GRADO

DE:

1

.

L

DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS

HERMINIA INES PEREZ MENDEZ

MEXICO. O. F.

NOVIEMBRE D E 1998

EL DOCTORADO EN CJENCIAS BIOLGJCAS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMAMETROPOLITANA EST INCLUIDO EN EL PADRN DE EXCELENCIADELCONACyT

POSGRADOS DE

Y ADEMSCUENTA

CON APOYODEL

MISMO

CONSEJO, CON EL CONVENIO NMERO PFP-200-93.

El jurado designado por las Divisiones de Ciencias Biolgicas y de la Salud de las Unidades lztapalapa y Xochimilco aprob la tesis que present:

Q.1. HERMlNlA INS PREZ MNDEZ."I

' x

:'.)

El da 10 de Noviembre del ao de 1998

V '

L

Comit Tutorial:

" 1

Tutor: DR. HECTOR MANUEL LUNA CONTLA.

Asesor: DR. ANGEL HORACIO SANDOVAL Y TRUJILLO

Asesor: DR. LUIS ANGEL MALDONADO GRANIEL

Dedicatoria: A mi madre: Elisa Mndez Vda. de Prez

A la memoria de mi padre: Dionisio Prez CapdevilaA mi esposo Norbert0 que tuvo un sueo y lo pude hacer realidad, gracias a su apoyo, paciencia y conocimientos para alcanzar esta meta. A mi suegra: Carmen Alvarez Vda. de Manjarrez A la memoria de mis abuelos: Eleuterio Prez Vega y Herminia Capdevila de Prez

A mis hermanos: Eleuterio, Betty y AlejandroAmis sobrinos: Dionisio, Ivan, Carlos, Celeste, Ariadna, Anah, Kathia, Alejandra, Adhara, Alfredo, Ernesto, Angel, Luis Angel, Eduardo, Toms, Mara del Carmen y Mara Dolores. A mis cuadas: Josefa, Rosa, Carmen, Dolores, Rosario y Silvia. A mis cuados: Angel, Toms, Luis Angel y Miguel A mis tios, tias y primos A mi comit Tutorial: Dr. Hctor Luna, Dr. Maldonado A mis sinodales: Dra. Ahide Lpez y Dr. Hctor Jaime Salgado Horacio Sandoval y Dr. Luis Angel

PginasRESUMEN ABSTRACT 13

5 OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECFICOS ANTECEDENTES -Biotransformaciones -Oxidaciones microbiolgicas -Oxidaciones qumicas -Descripcin morfolgica de Actinomicetos Nocardia -Inmovilizacin de Clulas 8 15 19 23 28 31

7

PARTE EXPERIMENTAL

41 68 99 102 104 105 113 118

RESULTADOS Y DISCUSI~NCONCLUSIONES PERSPECTIVAS RECONOCIMIENTOS BIBLIOGRAFA ARTCULOS PUBLICADOS RECONOCIMIENTOS Y PREMIO

RESUMEN

La oxidacin en el campodelaqumicaorgnicaindustrialconstituyeunadelas principales herramientas la en sntesis compuestos de orgnicos uno y de mtodos con mayor potencial de contaminacin, por los

lo anterior eventuales

desarrollos de metodologas alternas como las oxidaciones microbiolgicas siempre sern bienvenidas.

El objetivo principal del presentetrabajoesestudiar

el espectroyalcancedela

oxidacin microbiolgica de alcoholes porNocardia corallina B-276.

Se sometieron a la biooxidacin 43 substratos con Nocardia corallina B-276, a una escala de 1mmol;deloscuales, producto dichas debiotransformaciones 21 fueron dealcoholesbenclicosprimarios. fueron El

los

cidos carboxlicos

correspondientes, y una cetona con rendimientos del 5 al 77 %. Por otro lado, de los

5 alcoholes allicos solamente dos produjeron los cidos,57 %; los tresrestantes fueron heterocclicos,de

en rendimientos del 25 al

no fueron biotransformados.Dentro de lossubstratos 4los cuales solo

el alcoholfurfurlicoseoxido

al cido

furoco en un rendimiento del 51 O , y los otros tres no fueron biotransformados. h Tambin se incluyeron 4 aldehdos, en estos casos todos cidos carboxlicos en rendimientos del 33 al 71 %. ellos produjeron los

Entrelos

alcoholes norelacionadosestructuralmente,

el 2-naftilcarbinol y el cis19 y 71 % de rendimiento,

verbenol produjeron los productos esperados en respectivamente.

De los

7 dioles que

se probaron, soiamente de uno

ellos produjo lactona la

esperada en 42 YOde rendimiento.

Todos

los

productos fueron

purificados (cristalizacin o

cromatografa)

y

caracterizados por: pf, espectroscopia de IR, RMN-H (comparndolos con muestras estndar).

Estetrabajomuestrala

versatilidad y limitaciones de laoxidacindealcoholes viabilidad de sta

benclicos y allicos con la Nocardia coralina B-276 as como la metodologa,ya que se puede partirindistintamentedel

alcohol o del aldehdo,

conduciendo a resultados reproducibles.

Adems se describen estudios iniciales de la inmovilizacin decorallina B-276 en alginato de bario

clulas de Nocardia

y su utilizacin en la oxidacin microbiolgica

descrita anteriormente, substrato.

para estos estudios

se uso al alcohol furfurlico como

2

ABSTRACT.

Oxidation is one of the main tools

in the synthesis of organic compounds and it is potential forenvironmental pollution, for that

also one of the methods withmore

reason new methodologies, as microbial oxidation, are always welcome.

The main objective of this work is the determination of the

scope and limitations of

the microbial oxidation of alcohols by Nocardia coralha B-276; in order to do these 43 substrates were selected: 21 primary benzylic alcohols,

5 allylic alcohols, 4

heterocyclic alcohols, 4 aldehydes,2-naftol,cis-verbenol scale. For the primary benzylic alcohols, the products the corresponding carboxylic acids, the with exception corresponding ketone, with yield ranging from 5 to 77 O . h

and 7 diols, in a lmmol

of the biotransformation were one that produced the

For the

allylic alcohols tested, only two

of them gave the carboxylic acid in yields

around 25-57 %; the other three were biotransformed. not heterocyclic compounds, only

In the case

of the furoic

furfurilic alcohol was successfully oxidized to

acid in 51 % yield; the other three were not biotransformed. The aldehydes produced carboxylic acid in yield from 33 to 71 %.

3

2-naftol and cis-verbenol, non-structurally related to benzyl alcohol, were oxidized to the expected products in 19 and 71 % yield, respectively.

For the diols only one produced the expected lactone in 42 % yield.

All products were purified (by crystallization or chromatography) and characterized

by: mp, IR and 'H-NMR spectroscopy (by cornparation with authentic samples).

This work shows the versatility and limitations of the microbial oxidation of benzylic and allylic alcoholswithNocardiacorallina B-276,aswellasthe

viability ofthis used asstarting

methodology, because eitherthealcoholorthealdehydecanbe materials, obtaining reproducible results.

It also describes the initial work in the study of immobilization of the cells of Nocardiacorallina B-276 withbariumalginateandits

application to the microbial oxidation

described above. In these studies thefurfurilic alcohol was used as substrate.

4

La creciente preocupacin la por proteccin

del ambiente, ha impulsado a la si no esque,no,

investigacin hacia la generacin de procesosqumicosmenos, contaminantes. Como un ejemplo problemtica de esta

estn los procesos

oxidativos, los cuales generan grandes cantidades de residuos difciles de manejar o eliminar; muchos agentes oxidantes estn basados en iones metlicos txicos como el cromo. Reacciones laterales no deseadas este en tipo comunesdebido oxgeno molecular, a supobreespecificidad. de conversiones son e inocuo oxidante, el

El ms barato

no puede ser usado eficientemente, por

lo cual se hace

necesario el uso de catalizadores metlicos,los cuales son generalmente costososy contaminantes. Es altamente significativo el hecho de que existenpocos ejemplos de oxidaciones regio- ylo estereoselectivas.

creado la Por lo anterior se ha

inquietud de generar procesos oxidacin de

biocatalticos, por las ventajas que estos ofrecen. Entrelos mtodos biocatalticos, el uso microorganismos posiblemente de es procesos oxidativos, debidosistema al poseen. el ms adecuado para utilizarse en natural de reciclaje de cofactores que

5

Una aplicacin interesantede la metodologaantesmencionada bacteria Nocardia corallina, reportada Luna por et al,"*

es el uso de la

para la oxidacin de

alcoholes allicos. Lo anteriornosindujoaestudiar

el efecto de la estructurade

alcoholes allicos y benclicos sobre el proceso de oxidacincon Nocardia corallina. Conbase en lo anterior fue pertinenteampliartambin el estudioadioles no

simtricos y depreferenciadenaturalezaqumicadistintacomosera,alcoholes primarios y secundarios. Recientemente Morimoto3 estudi la formacin de lactonas a partir de dioles no simtricos con NaBrO2-almina en fase heterognea y encontr la oxidacin preferencial del alcohol primario sobre el secundario, para el caso de

1,6-dioles. Lo anterior nos motivo a considerar este tipo de substratos, para estudiar el alcance y limitaciones las de condiciones decorallina.

la biooxidacin con

Nocardia

Con la finalidad de facilitar el manejo de este tipo de biotransformaciones se aplicadoprocedimientosdeinmovilizacin de lasclulas

han

m i ~ r o b i a n a s ,esta va ~'~ la reutilizacindelas la

permite una mejormanipulacindelabiomasa,ademsde clulasinvolucradas en el procesooxidativo.

Lo anteriornosllevoaestudiar

inmovilizacin de Nocardia corallina y los parmetros necesarios para reproducir la bioconversin en estas nuevas condiciones, y posiblemente sentar las bases para un eventual desarrollo biotecnolgico de aplicacin a escala industrial.

6

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el espectroyalcancedelaoxidacinmicrobiolgicaNocardia corallina -276. B

de alcoholespor

OBJETIVOS ESPECFICOS

a) Estudiar el efecto de la estructura de diferentes substratos en la oxidacin de alcoholes allicos y benclicos con Nocardia coralha.

b) Estudiar la regioqumica y estereoqumica en la oxidacin de dioles para producir las lactonas correspondientes.

c) Analizar los resultados alcanzados y estructurar una propuesta de metodologa, incluyendo los alcances y limitaciones del proceso.

7

ANTECEDENTES

Para el desarrollo de este proyecto dentro de las Ciencias Biolgicas,se requiere de la convergencia de varias disciplinas como son: la qumica orgnica, la microbiologay la qumica analtica. Por lo que se estimo de suma relevancia el tener una base de

conocimientosgeneralessobreestostemasquenos

permitieran desarrollarlas

mejores estrategias para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo.

BIOTRANSFORMACIONES

c

,-,7

f .

f ' :, < /1

r- :.3

:: : ,. . Y'

%L

.

Biotransformacin, bioconversin, conversin microbiolgica microbiolgica esconversin una la de substancia qumica (substrato) substancia(producto)por

o transformacin T,'_

'

a otra el

in

I *

LL.

,

un microorganismo.8 En estasreaccionesenzimticas

I-. t1

substrato puede ser metabolizado,peroenalgunoscasoslaconversin lugarsingananciadeenerga(comensalismo).Unproceso

puede tener

, ' .. -

industrial puede ser

llevado a cabo por mtodos qumicos tradicionales o por bioconversin, sta ltima opcin presenta las siguientes

ventaja^:^"^

- Especificidad

desubstrato:unaenzimainteractua

o acepta un limitadonmero

de substratos, generalmente relacionados estructuralmente.

-

Especificidad de sitio (regioespecificidad): Si existen en la molcula varios

grupos funcionales de un tipodeterminado,lasenzimassolamenteafectanuna posicin especfica.

-

Estereoespecificidad: Si se utiliza una mezcla racmica material como de un enantimeroconvertido. esA tener un centro quiral, I

partida, solamente

como resultado de reaccin la enzimtica, pticamenteactivo.

e l

producto normalmente

es

- Condicionesla destruccin de conversin.

de reaccin suaves: reacciones Las enzimticas de los substratos sensibles, debido

no causan

a las suaves condiciones causan menos

Los medios usados en este tipo de reacciones

dao al ambiente, ya que el disolvente es generalmente agua.

Procesos Industriales de Biotransformacin Microbiana

En una conversin microbiana de compuestos orgnicospueden ser utilizados como biocatalizadores: sistemas de esporas; cultivos de clulas en crecimiento; clulas en reposo; y clulas inmovilizadas. En los procesos con cultivos en crecimiento, la cepa utilizada se cultiva en un medio adecuado y despus del crecimiento del cultivo se aade una solucin concentrada substrato. variante de Una del procedimiento

9

anterior es utilizar un inoculo muy grande y aAadir el substrato inmediatamente, sin permitir un perodo de crecimiento.

Para la biotransformacin de materiales hidrofbicos es posible emplear un sistema polifsico. A la fase acuosa, que contiene el material celular o la enzima, se superpone una fase inmiscible en la que seha disuelto el substrato. El substrato pasar lentamente a la fase acuosa y a medida que contina la biotransformacin se producir lentamente el producto y este regresar al disolvente. En algunos casos la biotransformacin se produce en la interfase.

El tiempo de la bioconversin est generalmente relacionado al tipo de reaccibn, la concentracin del substrato y el microorganismo utilizado. Las reacciones de oxidacin que utilizan bacterias frecuentemente son concluidas en horas; las conversiones con levaduras varios das. unas pocas

y especialmente con hongos pueden llevar

Las reacciones de biotransformacin en equipo de gran escala condiciones estriles en fermentadores agitados conversin monitoreado por cromatografa

se llevan a cabo en

y aireados, siendo el proceso de

o espectrofotomtricamente. El proceso

termina cuando se alcanza un ttulo mximo del producto esperado. La esterilidad

10

del sistema necesaria es porquecontaminacin la

puede suprimir reaccin la

deseada, inducir la formacin de falsos productos de biotransformacin o producir la degradacin total del substrato o producto.

Los productos finales dereacciones las

de transformacin microbiana son

normalmente extracelulares y pueden encontrarse disueltos o en suspensin en el medio de la reaccin. Para el procesamiento adicional generalmente no se separan las bacterias ni las levaduras, mientras que el micelio de los hongos generalmente es eliminado por filtracin. En todos los casos el material celular separado debe ser lavado repetidamente agua con

o con disolventes orgnicos, yapueden

que parte

significativa de los productos la dereaccin celulas.

estar adsorbidos las en

Una transformacin microbiolgica es diferente a una fermentacin y un resumen delas diferencias se muestra en la tabla 1.

11

Tabla 1: Diferencias entre Siotransformaciones y Fermentaciones Botransformaciones Fermentaciones Microorganismo Reaccin reaccin Materias primas Cultivos en crecimiento, clulas en reposo, o clulas inmovilizadas Reaccin cataltica sencilla (uno o varios pasos) Corto Tiempo de Substratos caros Cultivos en crecimiento

Producto Naturales o no naturales Fcil Aislamiento del producto Cantidad de enzimas activas Pocas Pocos Subproductos Alto Concentracin del producto

Proceso vida de (secuencia de reacciones multipasos) Largo y carbn Fuentes de nitrgeno baratos Solamente naturales Tedioso Muchas Muchos Bajo

Labiocatlisisaplicadaa

la sintesisorgnicaes

un readeinvestigacin

bien

definida la cual esta teniendo gran un auge; diferentes libros126

y revisiones

b i b l i o g r f i ~ a s ~se ~ ocupado de esta temtica. La biocatlisis se efecta con ~ han clulas completas de animales,20-22 plantas23-26 o microorganismos.27-30a,31 Tambin se han purificado, a diferentes niveles, algunas de las enzimas presentes materialesparausarsedirectamente en estos

en transformacionesqumicas. En ocasiones

estas enzimas se han utilizado en medios de reaccin y con objetivos alejados a su capacidad de transformacin biolgica natural. Como es de esperarse, al purificar

las enzimas el costo aumenta pero ello conlleva a otros beneficios, actualmente se dispone de una amplia variedad de stas macromolculas de manera

12

Las enzimas se agrupan de acuerdo

al tipo especfico de

reaccin que ellas son

33 capaces de catalizar y tradicionalmente se dividen en seis clases:

Oxidoreductasas: a) catalizan reacciones oxido-reduccin, de involucrando oxigenacin, o remocin o adicin de tomos hidrgeno de a hidrocarbonado. b) Transferasas: transferencia de grupos acilos, como glucosilo, fosfatos y equivalentes de aldehdos y cetonas de una molcula a otra. c)Hidrolasas: el rangodegruposhidrolizadosporestasenzimasesmuyamplio, incluyendo anhdridos,amidas, y glucsidos, steres,pptidos otras funcionalidades que contienen el enlace C-N. d) Liasas: estas enzimas catalizan adiciones usualmente de tambin catalizan el proceso inverso. e) Isomerasas: pueden efectuarse estas con enzimas isomerizaciones varias incluyendo migraciones ligaduras, dobles de isomerizaciones racemizaciones. un esqueleto

H-X a dobles enlaces y

cis-frans

y

9

Ligasas:estasenzimastambinllamadassintetasas,medianlaformacinde

enlaces C-O, C-S, C-N, C-C y enlaces de steres de fosfatos.

Las enzimas de las clases a,b,c,y d son las ms usadas en sntesis. Las reacciones de oxidacin son particularmente tiles en la industria.

Por otro lado las tcnicas de biologa molecular estn abriendo nuevos horizontes, por ejemplo el desarrollo enzimas de artificiales nuevas con caractersticas,0

simplemente el rediseo de enzimas por la tcnica de mutagenesis directa permite la alteracin de la estructura de la enzima original;los mtodos modernos

de

secuenciasdeprotenasycristalografaderayos determinacinla de estructura tridimensionalla de enzima clonacin del gen responsable de sntesis la deOchrobacfrurn anthropi en Escherichiacoli

X soncapacesdeapoyarla m ~ d i f i c a d a . ~La ~ la D-aminopeptidasa de es un ejemplo de comolaactividad

enzimticapresenteen

un microorganismopuedeserincrementadapormuchos

ordenes de magnitud y la concentracin del producto requerido es mayor.35 Se sabe quealgunas de estasclasesdeenzimasrequierencofactores

o coenzimas, losel

cualessoncostosos,difcilesdeconseguir,conservar,yquehacenpreferible emplear la clula completaI2tales el casodelasoxidoreductasas.Centraremos

estadiscusinalrededordeestetipodeenzimas(oxidoreductasas)

ya quees el

objetivo de esta tesis. En estos casos las clulas mas comnmente utilizadas son las de los microorganismos, los cuales utilizan sucomplejamaquinariadeenzimasy coenzimasdurantesuciclometabliconormalytransforman al substratoen el

marcodesumetabolismosecundario.Sehaninformadoejemplosdeaplicacin industrial haciendo uso de esta idea para lograr interesantes biotransformacione~,~~ siendo en el campo de productos qumicos finos (farmoqumicos e intermedios) la

13

hidroxilacin de progesterona a 1la-hidroxiprogesterona por Rhizopus arrhzus y R.

ngricans reportado por Peterson y Murray un excelente e j e ~ p l o , ~ ,yaqueste ~~paso sinttico simplific e hizo realidad la preparacin, a muy costo, bajo de

hormonas corticosteroides y varios de sus derivados, llevando el precio de cortisona de US$200 a US$6 por gramo y a la fecha solamente US$ 1 por gramo.34b

OXIDACIONES MICROBIOL~GICAS

Dentro del amplio campo de la biotecnologa, enzimas, ocupa una parte importante

el uso de los microorganismos o sus un rea que se est

y es a la fecha

desarrollando rpidamente. La oxidacin con microorganismos tan viejacomo la humanidad,siendo

es una metodologa

la produccin de vinagre el ejemplo ms

antiguo y ms conocido (hay datos de su uso y obtencin desde 2000 aos A.C. por los b a b i l o n i ~ s ) . ~ ~ ~ un Este campo investigacin ltimamente ha es de que se revitalizado, debido al incremento en el control de la contaminacin ambiental y a la posibilidad de realizar sntesis asimtrica con biotransformaciones. el empleo tipo de de este

Lasaplicacionesdelasbiotransformaciones los substratos polifuncionales. pueden

en rea muy esta son variadas

y

ir desde hidrocarburos molculas hasta complejas

15

En todos estos casos la funcionalizacin (oxidacin) y la estereoqumica generada son factores estudio de inseparables regioy lo estereoespecificidad

y

busca sesiempre

la

mayor

posible; manera a de ejemplo se puede la cual el la uso

mencionar el caso de de

la

epoxidacin de alquenos en

c o d i s ~ l v e n t e s ~ ~ modificar pueden substancialmente

estereoqumicaNocardia

producida. Pseudomonas oleovorans, Methylococcus sp.coralhna 8-276 y Brevibacterium sp.

CRL MI, se cuentan

CRL 61,

entre los

microorganismos ms

utilizados

para

este al

tipo biotransformacin, de epoxidar: 1-deceno, el de uso la un oxidacin

que, lograr ademsestereoespecificidad de tetradeceno algunas qumicaun

1-

y

propileno

respectivamente, evita sey

sales inorgnicas tradicional,

perxidos usados en

los cuales constituir puedenpersonal involucrado.

riesgo ambiental y

peligro para la seguridad del

oxidaciones Ejemplos de microbiolgicas son:

la

oxidacin deo

cadenas laterales alifticas con formacin de aldehdos, cetonas carboxilo; la conversin den-dodecilbenceno

funciones

al cido fenilactico por Nocardia

sp.

con un 80

O h

conversin; de degradacin las la oxidativa de ejemplo por la conversin del I-fenildodecano al

cadenas laterales,

cido 2-hidroxifenilactico por Nocardia opaca Stamm TI6 o al cidofenilactico por Nocardia opaca P2 con un 67-85O h

deconversin;

la ruptura oxidativade

16

10s anillos aromticos por conversin ejemplo lasaliclico por

del sp.

naftaleno con

al

cid0 de

Corynebacterium

(ATCC 15570)

un 70 ?41

conversin; oxidativa ruptura la de substituyentes (desaminacin oxidativa, desmetilacin grupos: deO-CH3 o N-CH3), un ejemplo la es transformacin de

1O, 11-dimetoxiamorfina(ATCC 9245) con

a

isocapocodena por

Cunninghamella blakesleana

un 100 %

conversin; grupos de oxidacin la de a grupos formacin nitro; de N-xidos el 2-amino-4-alquilimidazol deshidrogenacin la de glaucina con un 60 % de conversin; al y 2-nitro-4a la

heterofuncionales (grupos amino sulfxidos), ejemplo por alquilimidazol por dihidroglaucina por hidroxilacin de triptofano

Streptomyces sp; Fusarium

solani

y

la

al 5-hidroxitriptofano por

B. subtilis.28 Entre

los

microorganismos que se han utilizado en este campo estn entre otros gneros las,

Pseudomonas,

Nocardia,

Rhodococus,

Acinetobacter,

Xanthobacter,

El Cunninghamella, Chaetomi~m.~' gnero Nocardia hasidoutilizadoampliamentepara la epoxidacin microbiolgica de alquenos, siendo Nocardia corallina la que ha proporcionado los mejoresresultados. 4-7, 41-53 Luna y COI,' informaron el potencialUSO

de los dos primeros microorganismos para transformar alcoholes

alilicos a [os

correspondientesaldehdos/cidos o cetonas,siendo los resultadoscon Nocardia

COra//ina los de mayor inters. El proceso se lleva a cabo en un medio de reaccindifsico, encontrndose al microorganismo mayormente en la interfase. Este

microorganismo, lo reportado tambin Lunapromovii, por et la oxidacin de

17

dioles a lactonasquirales;logrndoseprepararmaterialesdealtapurezaptica, con la oxidacin preferencial del grupo pro-S. En todos los ejemplos estudiados se utilizaron dioles primarios; es relevante el hecho que, cuando se efectu la oxidacin de un diol protegido, como el monometil ter, la reaccin no condujo a productos de oxidacin,lo que sugiri la que oxigenasa en

N. corallina no oxida alcoholes

saturados primarios y se presume la necesidad de la presencia de ambos grupos hidroxlicos, en su forma libre, para la mencionada biotransformacin.

Un beneficio de laoxidacinmicrobiolgica

es que facilita la eliminacin y10 el

tratamiento del agua residual de la reaccin, lo cual al final del proceso presenta un menor impacto en el ambiente, sin disminuir la eficiencia qumica de la

biotransformacin.

Aunque por su volumen muchos procesos petroqumicos son an irremplazables, el avance enel uso de microorganismos o enzimasdecualquierprocedencia, en

procesos de bajo volumen de produccin, se hace cadavez estima que en un futuro cercanocon incrementar la escala de produccin.

ms evidente y sese podr

nuevos desarrollostecnolgicos

La posibilidad deinducirasimetra

en el readesntesisqumicaessinlugar

a

dudas un reto a la creatividad del qumico y el poder usar los procesos biolgicos de

1s

distintos orgenes o enzimas aisladas, abre una amplia gama de posibilidades cuya exploracin est en franco crecimiento, se estima que tan solo en el campo de las biotransformaciones, aplicadas a los farmoquimicos se estn utilizando ms de

200054enzimas para el desarrollo de procesosconducentes a lapreparacinde

molculas q u i r a l e ~ . ~ ~ nosindica Esto biotransformaciones

el enormeimpacto que tiene el readelas

y se considera muchos que farmoqumicos quirales que

estarn en el mercado para el ao 2000 se obtendrn a travs de sta metodologa.

OXIDACIONES QUMICAS

Es innegable que este tipo de reaccin, es una de las ms empleadas en la qumicaorgnica. Pero a su vez una de las mas complejas; tanto por el nmero de reactivos que se puedan utilizar, comopor la granvariedaddemecanismosdereaccin ya han sido industrial la

involucrados. Algunas de las limitaciones este para proceso mencionadas, sin embargo en el campo la dequmica orgnica oxidacin constituye una de las

principales herramientas en la sntesis de potencial de contaminacin,por lo

compuestos y uno de los mtodosconmayor anterior se estima

que desarrollo de nuevas metodologas alternas siempre sern degruposfuncionalessusceptiblesdeser se revisarn a continuacin el proceso oxidativo;5637

bienvenidas. Dada lagrandiversidad

oxidados y a los objetivos planteados para sta tesis,

reacciones de oxidacin por tipo de enlace involucrado en

a

19

manerademarcoconceptualparavisualizarunaeventualcomparacincanlas biotransformaciones estudiadas.

A. Reacciones de eliminacin de Hidrgeno. A.l La aromatizacin alquilciclohexanos, de ciclohexenos

o ciclohexadienos a

derivados del benceno es el ejemplo mas representativo, estareaccin es catalizada por platino, nquel o paladio. A.2 Reacciones de ciclodeshidrogenacin. La formacin de naftaleno a partir butilbenceno sobre catalizadores de almina crmica a proceso.A.3 La deshidrogenacin alcoholes de a aldehdos

de n-

500 OC: ilustra este tiDo de

y cetonas. Este

tipo de

transformacin se puede llevar a cabo con una gran variedad de agentes oxidantes, tales como:

88 ooCI

"to4,

Br2, Mn02, el complejo de CrOs-piridina, o el empleo de CuCrOs,

m Z Q rn 2 7 3? ;

plata o cobre

previenen la oxidacin alcoholes de primarios hasta

los cidosnivel industrialpara

?S 3: j' IL!

carboxlicoscorrespondientes,

y sonampliamenteutilizadosa

p Fc"

1;7

0:

laproduccin de aldehdos;algunascetonassepreparan

por esteprocedimientoa el mtodo general

F;5" i

P

I:!?

partir de alcoholes secundarios; aunque a escala de laboratorio

ms empleado es el del reactivo de Jones.58 En el caso de alcoholes benclicos se han utilizado compuestos de Ce(lv) para obtener aldehdos. agentes Otros

empleados son la N-bromosuccinimida o la N-clorosuccinimida.

20

La variedad de posibilidades y condiciones de reaccin son muy amplias para este tipo de transformacin qumica.

B. Reacciones que involucran reemplazo de hidrgeno por oxgeno.B.1 Oxidacin de arilmetanos a aldehdos. Esta transformacin se lleva a cabo por lo general con cloruro de cromilo (CrO2CI2)o conunamezcladeCrOs actico en rendimientos moderados. y anhdrido

8.2 Oxidacin de alcoholes primarios a cidos carboxlicos. La reaccin se puederealizar con varios agentes oxidantes fuertes, como KMn04 en medio: cido o bsico; en medio cido es preferible el uso de dicromato de sodio o potasio, dado los riesgos inherentes al cido permangnico. En estas condiciones se obtienen cantidades considerables del ster, posiblemente por la oxidacin del hemiacetal formado por la reaccin del aldehdo intermedio con el alcohol de partida. Este procedimiento permite tambin preparar lactonas, por oxidacin de dioles que posean al menos, un alcohol primario; si bien existen otros mtodos para preparar estos steres cclicos.3,56,57

C. Reacciones de adicin de oxgeno a enlaces insaturados.C.1 Formacin de epxidos a partir de alquenos. Esta reaccin se lleva a cabo con

peroxicidos; con oxgeno y catalizadores organometlicos de titanio59-62 O manganeso.63,64 Es importante mencionarque la reaccin de Sharpless muestrauna

21

alta

induccin asimtrica ciertos con substratos

y que por ello es gran dea

importancia en qumica sinttica. En carbonilos, cetonas por ejemplo a,P-insaturadas,

el caso dobles de enlaces conjugados se forma el

epxido

correspondiente por la reaccin con H202en medio bsico.

D. Reacciones en las cuales un par electrnico no compartido se enlaza oxgeno. a Si bien existen reacciones de oxidacin sobre tomos de: azufre, nitrgeno, selenio, boro,etc., se seleccion al azufrecomoejemplodeeste dada la importanciade los sulfxidosquirales,debido tipo de transformacin, a suamplia aplicacin en

sntesis asimtrica como intermediarios tiles y en nuestro futuro inters en ampliar nuestro estudio de oxidacin de sulfuros proquirales con Nocardia corallina.

D.l Oxidacin de sulfuros a sulfxidos o sulfonas. Esta reaccin se lleva a cabo concantidades controladas de H202 al 30 % con el objetivo de dirigir la reaccin hacia el grupo funcional deseado. sulfona La se oxidantes fuertes como KMn04, o puede obtener directamente cido hipocloroso. Siendo utilizando

de inters la

transformacin estereoselectiva del sulfur0 a sulfxido con agentes oxidantes ms suaves y especficos.

22

DESCRIPCI~N MORFOL~GICA ACTINOMICETOS DE

Los actinomicetos, conforman un grupo amplio y diversos de bacterias, son bacilos

grampositivos con una tendencia caracterstica a formar cadenas o filamentos. Los actinomicetos incluyen cierto nmero de taxones superiores varan que en

morfologa, requerimientos de oxgeno, composicin de la pared celular y capacidad de formar esporas.

El trminoactinomiceto no tiene valideztaxonmicayaqueestosorganismosseclasifican como bacterias en un sentido estricto y son miembros del orden

Actinomycetales, pero no todos los gneros de los Actinomycetales se consideran como actinomicetos en el lenguaje comn. Los actinomicetos son microorganismos que producen filamentos delgados y ramificados que se desarrollan en un micelio en todos los gneros, excepto el gnero Actinomyces. El filamento del actinomiceto puede ser bastante largo -aunque en algunos grupos es corto- puede fragmentarse y en muchas unidades ms pequeas. Las hifas o filamentos individuales se asemejan morfolgicamente a los filamentos fngicos son pero mucho delgados, ms generalmente de 0.5 a 1.0 pm dedimetro;sinembargo, en algunos gneros las

hifas pueden tener ms de 2 pm de dimetro. Muchos de los actinomicetos del suelo producen sobre sus hifas esporas asexuales, conocidas como conidias, aisladas en

23

paredes o formando cadenas, mientras unos que cuantos habitantes

del suelo

producen sus esporas en una estructura especializada conocida como esporangio.

A pesar de estarcolocadosjunto

con lasbacterias,la

relacin aparentede

los

actinomicetos con los hongos se manifiesta en tres propiedades: a) el micelio de los actinomicetossuperiorestienelasextensasramificacionescaractersticasde los

hongos; b) muchos actinomicetos forman un micelio areo, y c) el crecimiento de los actinomicetos en cultivolquidoraramenteproducelaturbidezasociadaconlas bacterias unicelulares que sino produce formacin filamentos, la de grumos esferas.Porotrapartelamorfologay el tamaodelashifas,lasconidiasyo

los

fragmentos individuales las de especies micelio segmentacin cuyo sufre son65 semejantes a las estructuras que se observan entre las bacterias.

Distribucin y Abundancia de los Actinomicetos en la Naturaleza.

Los actinomicetos son numerosos y estn ampliamente distribuidos, no

slo en el

suelo sino en una variedad de hbitats diferentes, incluyendo estircol; fango de los ros y el fondo de los lagos. Se encuentranen la superficie del suelo as como en los horizontes inferiores, aprofundidadesconsiderables. bacterias y a veces En abundancia,siguenalas

el nmero viable de ambos es casi igual. Particularmente, en

ambientes de pH elevado, los actinomicetos constituyen una gran proporcin de la

24

comunidad.Como regla generalsonsaprfitos,aunquealgunasespeciespueden provocar enfermedades a las plantas, animales domsticos e incluso hombre. al

En hbitats sus normales,

los actinomicetos pueden presentarse

en forma de

conidias o de hifas vegetativas y ambas formas pueden originar colonias en medios de agar. Tanto terreno en virgen como terreno en cultivado, actinomicetos los constituyen del 10 al 50 % de la comunidad en alcalinas, total; reas y especialmente cuando hay sequedad, la abundancia alta. relativa es espectacularmente

Se pueden hacer algunas generalizaciones respecto

al papel de las caractersticas

ambientales especficas en la determinacin de la abundancia de los actinomicetos. En comparacin con las bacterias verdaderas, actinomicetos menos los son comunes en reas hmedas que en reas secas. Adems la poblacin es mayor en pastizalesy en suelosdepastoreoqueensueloscultivadosylaabundanciaen campos de cultivo con frecuencia sobrepasa la de los sitios vrgenes adyacentes. Sin embargo desfavorables las son en turberas, las en reas inundadasy los

ambientes cuyo pH es menor de 5.0; los suelos en regiones climticas clidas son ms favorables para una extensa flora de actinomicetos que los de reas ms fras; el tamao la de comunidad actinomicetos latitudes de en templadas tiende a aumentar conforme se acerca a los trpicos.

25

Taxonoma de los Actinomicetos.

Actualmente se sabe que

los suelos contienen gran cantidad de actinomicetos de

gneros caractersticamente diferentes y estos se pueden dividir en las siguientes familias: I. STREPTOMYCETACEAE. Hifas generalmente no fragmentadas. Extenso micelio areo y cadenas de esporascon5 a 50 o msconidiasporcadena.Gneros:

Streptomyces, Microeiiobosporia, Sporichthya.H.

NOCARDIACEAE. caractersticamente Hifas fragmentadas que produceno

pequeas redondeadas estructuras

elongadas. Gneros:

Nocardia,

Pseudonocardia.111. MICROMONOSPORACEAE. Hifas no fragmentadas. Conidias aisladas, en pares

o en cadenas cortas. Gneros:

Micromonospora, Microbispora, Micropolyspora,

Thermomonospora, Thermoactinomices, Actinobifida.IV. ACTINOPLANACEAE.Esporasformadasenesporangios.El dimetro las de

hifas puede ser de 0.2 a ms de 2.0 blm. Gneros: Streptosporangium, Actinoplanes,

Planobispora, Dactyiosporangium. V. DERMATOPHILACEAE. Los fragmentos hifales sedividen para formar gran

nmero de estructuras redondas, mviles. Gnero: Geodermatophjim.

26

VI. FRANKIACEAE. Habita lo en ndulos las de races algunas de plantas no leguminosas. No crecen fuera de la planta hospedera. Gnero: Frankia. Vil. ACTINOMYCETACEAE. No producen micelios verdaderos. Por desde anaerobios estrictos a facultativos. Gnero: Actinomyces. lo general son

Aunque en el suelo se desarrollan un nmero razonable de gneros,

tan slo las

especies de algunos gneros predominan sobre las colonias de actinomicetos que aparecensobremediosdeagarinoculadosconsuspensionesdiluidasdesuelo. Casi invariablemente,

Streptomyces predomina numricamente,

con frecuencia

constituye ms del 70 al 90 % de las colonias en la mayora de los medios de agar; raramente es baja su frecuencia relativa, pero a veces

las especies de ste gnero

representan slo el 5 % de los actinomicetos en algunos suelos. Nocardia es, por lo general, el segundo abundante, ms del 10 al 30 % decolonias las de

actinomicetos son nocardias. Las especies de

Mcromonospora son las terceras enque crecensobre

frecuencia y presentndosedel 1 al 15 O delosactinomicetos h medios slidos miembros este son de grupo morfolgicamente distintivo. Las

especies de Actinomyces se consideran poco comunes y los otros gneros tambin existen en nmero escaso.65

27

Gnero: Nocardia; Morfologa y Coloracin.

Las especies de Nocardia son bacilos grampositivos aerobios parcialmente acidorresistentes.Dentro del gnero la formacindefilamentosylaramificacin

estn muy desarrolladas. Las especies de Nocardia producen filamentos profundos yareos(tambindenominadoshifaso micelios) de alrededor de

1pm de ancho.los

Las clulas de los filamentosprofundosseseparan

en formasderosarioy

filamentosareosexperimentanfragmentacinparaproducirclulassimilaresa esporas unicelulares que se dispersan y forman aerosoles con facilidad. AI igual que los Mycobacterium, Rhodococcus, y Corynebacterium, las paredes de las Nocardia poseen cidos miclicos, denominados cidos nocrdicos. Los cidosmiclicossoncidosgrasoslargosp-hidroxiladosya-ramificados,por

lo

comn saturados o monoinsaturados. Los cidos nocrdicos tienen alrededor de 50 carbonos de largo, en tanto que los cidos corinomiclicos tienen 32 a 36 carbonos. Las especies de Corynebacterium no son acidorresistentes y las Nocardia presentan una acidorresistencia dbil o parcial cuando se las tie con carbolfucsina de acuerdo con el mtodo de Kinyoun. Si se las decolora con cido sulfrico lugar del decolorante fuerte, ms la mayor de parte presentarn acidorresistencia. del 1 ai 4 % en

la cepas de

Nocardia

28

Fisiologa deNocardia

Caractersticas de

su cultivo. Nocardia proliferan con facilidad y rapidez en

diversos medios de cultivo. En los que contienen agar las colonias aparecen dentro de los tres siguientes das a la inoculacin. Despus siete de a diez se das

presentan colonias apiladas, irregulares, cerosas, brillantes y de varios milmetros dedimetro. A medida que seformanlosfilamentosareoslasuperficiedela

colonia se torna opaca y vellosa.

Propiedades metablicas diferenciales. Nocardia puede diferenciarse de gneros similares por su capacidad para descomponer y utilizar la parafina como una fuente de carbono y energa. Esta propiedad permite el aislamiento selectivo de Nocardia de cultivos mixtos.

Un mtodo para atrapar Nocardia implica el uso de varillas de vidrio recubiertas con parafina que se preparan al sumergir una varilla de vidrio en parafina fundida. Las varillas pueden colocarse en suelos o agua del medio ambiente y las especies de Nocardia, si estnpresentes, se desarrollarnalrededordela varilla de vidrio

recubierta con parafina. Usando esta tcnica se han aislado especies patgenas y saprfitas de Nocardia de una amplia variedad de suelos, agua dulce y agua de mar en todo el mundo. Los estudios ecolgicos tienden a correlacionar la prevalencia de

29

una cepa particular de N. asteroides en el ambiente con su incidencia de infecciones como: 1) nocardiosis localizada o sistmica; 2) infecciones cutneas; 3) infecciones linfocutneas (esporotricoides); 4) micetomas en lapoblacin nativa. Adems de la digestin de la parafina, las especies deNocardia producen catalasa y ureasa.

Infeccin Clnica por Nocardia

Epidemiologa. Ms de la mitad de los pacientes que desarrollan nocardiosis tienen algn tipo de deficiencia. El 30 % de los pacientes refieren el antecedente de haber recibido esteroides y/o tratamiento inmunodepresor, pulmonares crnicas y el cncer, con pero las infeccioneso sin ellos,

sus respectivos tratamientos

tambin proporcionan una base para la nocardiosis oportunista. Alrededor

del 6 %

de los pacientes presenta una tuberculosis previao concurrente. Otras categoras de alto riesgo incluyen a los receptores transplantes de y a los pacientes de

alcoholismo crnico. En los pacientes en quienes prevalece afeccin no una subyacente el pronstico esconsiderablementemejor.En frecuencia de la nocardiosis fue estimada enlos EstadosUnidosla

1976 como de 500 a 1000 casos por

ao. Desde entonces esta enfermedad ha sido reconocida con frecuencia como una infeccin oportunista. Del0.5 al 2 % de los pacientes con

el sndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA)contraennocardiosis,cadaao

se producen

30

varioscientosdecasosnuevos.

La nocardiosisno se transmiteentrepersonas

o

animales,aunque se han notificadovariosbrotesentrepacientesconsusistema inmunolgico deprimido.=

INMOVILIZACIN DE CLULAS.

222485Uno de los principales problemas se que presentan fermentaciones en cuyos productossonligeramentedifundidos al medioes la formacindelos llamados

Pellets los cuales se definen como un aglomeradodeclulasque

al tomar esta

formacin afectan la difusin de los substratos al interior de la clula, as como la secrecin de productos al exterior. El problemaanteriorpuedesersolucionado incrementar la velocidad del propulsor en el tanque de fermentacin, esto crea gran dispersin de las esporas o clulas evitndose la formacin de pellets. al una

En aos recientes, los procesos de inmovilizacin de clulas completas han atrado grandemente la atencin por el descubrimiento del enorme potencial que ofrecen los microorganismos en la industria qumica. La tcnica de inmovilizacin ha sido

definida como el procedimientoen el cual se confina una enzimacatalticamente activa o una clula dentro de un sistema, permitiendo el libre paso del substrato y del producto a travs de l.67 Tampion y Tampion la han definido como una clula o

31

una porcin de ella que, por medios naturales o artificiales es impedida de moverse independientemente de susvecinas en todaslaspartes de una fase lquida del

sistema bajo estudio.68 Las enzimas o clulas se emplean en la industria de forma inmovilizada cuando se desea el reciclado de procesos biocatalticos continuos.

los biocatalizadores, o bien en

Otro aspecto de la durabilidad de los biocatalizadores inmovilizados es la resistencia a la degradacin microbiana, su operacin es deseable en condiciones donde los contaminantes microbianos no pudieran desarrollarse fcilmente.

Esta metodologa tambin mejora

el rendimiento de los productos, esto puede ser la actividad biocataltica,

atribuido a muchos factores talescomolaextensinde

cambios metablicos ventajosos o la canalizacin del flujo del material dentro de la clula a travs de una va particular. Adems se mejora la estabilidad del producto, debido al corto tiempo de residencia de productos inestables o la disminucin de la degradacin microbiana del

Desde que se empezaron a estudiar los sistemasde purificadas, sehadescubiertoqueestnlimitados involucran cofactores, adems

inmovilizacin de enzimas que no

a reaccionessimples

que presentan algunas

dificultades en su

reutilizacin. Consecuentemente, se ha incrementado el inters de emplear sistemas

32

de inmovilizacin de clulas completas, que

pueden catalizar reacciones de varios

pasos, involucrando una serie completa de diferentes enzima~.~'

Las comparaciones econmicas entre los procesos que involucran enzimas y clulas inmovilizadas otras con alternativas posibles resultan sumamente complejas. costo depende mucho del sistema adoptado controlables. embargo, Sin es y de fuerzas de mercado El no

posible hacer ciertas generalizaciones

de cada

proceso con sus ventajas dificultades. y

Entrelasventajasqueofrecen

los sistemasdeinmovilizacin

de biocatalizadores reutilizables y la

estn, el que proporcionan una larga estabilidad, usualmente son

recuperacin del producto es fcil. Aunque la inmovilizacin celular sido ha desarrollada despus dela econmicos inmediatos, inmovilizacin deenzimas,sta ha tenidobeneficios

de separacin al evitarse los costos til en

y purificacinprocesos

enzimtica, adems inmovilizacin es dela que celular

multienzimticos y es posible reutilizar lasclulas.Frecuentemente,lasenzimas presentes en clulas inmovilizadas exhiben mayor enzimas inmovilizadas en estado puro. estabilidad que las mismas

Como una de las dificultades quetienen los sistemas de inmovilizacin podemos mencionar principalmente labaja difusin de substratos a travs de la matrizy a

33

travs las de

clulas en el caso enzimas de intracelulares, desventaja se que

presenta en sistemas de soporte en geles.

La tecnologa

de la fermentacin sumergida tiene

la ventaja de que es bien disponible. Pero los ciclos y

fcilmente entendida y el equipo utilizado es

desperdiciados de esterilizacin del medio,inoculacin,crecimientodeclulas

limpieza del equipo de fermentacin son algunas de sus desventajas; los cuales se reducen en los sistemas de inmovilizacin. Como se not previamente, una de las

principales ventajas de la inmovilizacin es extender la vida metablica de clulas en un estado estacionario, adems la recuperacin del producto es ms fcil y el.!

tamao del recipiente puede ser reducido en un procesocon clulas inmovilizadas, con el consecuente ahorro de operacin.

'

I

. .

. ,

los componentes del medio de cultivo y en la

'

6 -

-

,

-

-i ''

Las tcnicas

de inmovilizacin se clasifican en cuatro procedimientos bsicos de

...

acuerdo a lo propuesto por RadovichI7' siendo: inmovilizacin sin acarreador, que consiste en la formacin agregados de celulares por floculacin natural o por superficial delas

floculacin inducida utilizando agentes que modificanlacarga clulasejemplo, (por

polielectrolitos aninicos o catinicos); acoplamiento

covalente, empleando un tratamiento con agentes entrecruzadores comoel bromuro de ciangeno; adsorcin a travs de enlaces inicos, hidrofbicos o de hidrgeno

34

sobre un acarreador inerte; y atrapamiento en un material inerte semipermeable tal comogeles, alginatos, fibras o membranas.Esteltimoes utilizado. el procedimiento ms

Las caractersticas deseables que debe tener un acarreador en el atrapamiento son las siguientes: En la inmovilizacin: 1) controlar en lo posible el tamao y porosidad del medio de atrapamiento, especialmente para reactores a escala industrial, 2) que los agentes

atrapantes formen una matriz estable en el medio acuoso a temperaturas y valores de pH compatibles con la accin enzimtica deseada y del microorganismo, 3) todoslos acarreadores deben ser baratos y fcilmente disponibles, para tener el costo del

proceso de inmovilizacin ms bajo posible.

En la produccin: 1) el acarreador debe poseer estabilidad mecnica para resistir largos periodos de reaccin y estabilidad qumica en presencia de otros los componentes del sistema, 2) el acarreador debe ser inerte para el microorganismo,3) el medio de atrapamiento debe permitir la libre difusin del substrato, producto y

otros metabolitos, especialmente los dos ltimos, porque pueden inhibir la reaccin,4) el acarreador debe tener capacidad para soportar una alta densidad de

clula^.^'de

Una ventaja

sustancial de un sistemadeinmovilizacines

la altadensidad

clulas y velocidad de flujo, que permiten incrementar la productividad y la facilidad

35

de purificar el producto. Trabajar con velocidades de

dilucin ms grandes que la a

velocidad crecimiento microorganismos de de contaminantes tambin ayuda resolver problemas de contaminacin.

Por otra parte,

los sistemas de inmovilizacin presentan

problemas como: posibles

alteraciones metablicas que dependen de las caractersticas de las clulas que se empleen, ya sea, clulas vivas en activa reproduccin, clulas que son viables pero no reproducibles o clulas muertas; la necesidad de asegurar una eficiente difusin de substrato y productos a travs de la matriz; y los costos de inmovili~acin.~~ La transferencia de masa de la interfase incluye todos los pasos de la transferencia de masa de los substratos y nutrientes hacia dentro de la matriz y la de productos a la superficie externa de la matriz de la clula inmovilizada.

Una de las formas para alcanzar una efectiva inmovilizacin es

el atrapamiento de

un agente biolgico dentro de una matriz de gel. El sistema usualmente tiene tres fases: la fase biocataltica, el flujo de alimentacin/producto y la fase gaseosa del substrato introducido y del producto generado. La completa descripcin del sistema requiere el conocimiento de todas las fases. entrelas fases y su relacin conla El transporte del substrato y producto

productividad especfica del biocatalizador

inmovilizado.

36

Varios factores afectan la productividad especifica del biocatalizador inmovilizado cuando se comparan conmicroorganismosindividuales en unasuspensinlibre. de las esferas

Algunos de estos factores son condiciones las fisicoqumicas comparadas con la masa lquida y la resistencia en

el transporte de masa de

los

substratos necesarios y los productos resultantes dentrode la matriz.72

Las limitaciones significativas de

difusin son comunes

de en los sistemas

atrapamiento en geles y pueden causarque inhibicin porproductodentro

el substrato se agote o que exista clulas sonmuysensibles a su

de lamatriz.Las

microambiente, una concentracin adecuada de substrato y productos dentro de las esferas juegan un importante papel en la productividad y crecimiento. Las condiciones del proceso de operacin tales como velocidad de flujo y concentracin de nutrientes en la fase lquida son ptimamente determinados sonsuperadas. Las condicionesptimasclaramente si las limitaciones

se basan en un anlisis de

difusin y reaccin en la matriz celular.73

La actividad de las enzimas inmovilizadas son usualmente expresadas en trminos del nmero de gramos de producto inmovilizada usada por hora, formado por de gramo enzimalclulao como gramo producto de

formado por litro de combinados de los factores,

volumen de reactor por unidad de tiempo. Los efectos

los cuales afectan las propiedades intrnsecas de la enzima son expresadas como

37

factores de efectividad, junto con las prdidas de actividad que tengan lugar durante tambin la inmovilizacin a los que se denomina eficiencia de acoplamiento,

porcentaje de retencin y recuperacin de a~tividad.~

Por lo tanto, las propiedades del transporte de masa dentro conocido para predecirla

de la matriz debe ser

efectividad del biocatalizadorincorporado.

El alginato

permite la rpida difusin del soluto de bajo

peso molecular, aunque hay algunas

evidencias que a altas concentraciones de alginato afectan la velocidad de difusin de los solutos.

Johansen y Flink consideran que las propiedades del alginato pueden influir en las caractersticas de las clulas levadura de inmovilizadas (especialmente transporte de masa ), las propiedades en el

que primeramente influyen son el peso

molecular del alginato (caracterizado por su viscosidad), la proporcin entre el cido gulurnico y cido manurnico (proporcin G/M) y la concentracin del alginato en el inmovilizado. Pueden tambin influir otras propiedades como la resistencia del gel, la retencin y el nmero final de clulas inmo~ilizadas.~~

Unode

los soportesms

utilizados paralainmovilizacin el alginatodecalcio,

de enzimas,clulas en bloquesde

y

organelossubcelulareses

el cualconsiste

copolimeros compuestos de p-D-manuronato y a-R-guluronato. Ocurriendo la

38

gelacinen

presencia de ionescalcio.

Se tratadeun

gel que esunapelcula

tridimensional; es bioqumicamente inerte y las clulas pueden ser atrapadas en los espacios interticiales del gel. La resistencia de dicho soporte esta en funcin de sus componentes, de su concentraciny de la dispersin de poros dentro de la muestra.

El alginato est presente en todaslasalgasmarinascafs,principalmenteensargazogigante

el

(Macrocystis pyrifera), queeslaespecie

ms importanteparala

produccin de alginatos. En Mxico se ha venido cosechando desde 1958, con una produccin promedio de 28,300 toneladasporao.

El proceso de produccin se

basa en una serie de reacciones de intercambio inico que permite extraer del alga el alginato de sodio, dicho tratamiento se inicia con el secado de las algas, adiciona un cido diluido. Para extraer los alginatos se alcalina de carbonato de sodio, masapor se les

les somete a una solucin

el alginato que queda en la solucin separando laes tratada

centrifugacin o filtracin. Lasolucindecolorcafclaro

nuevamente con cido o sales calcio, de obtenindose

los alginatos forma en

gelatinosa (si se us cido) o como fibras (si se emple sales de calcio). Finalmente para obtener el alginato de sodio se le agrega sales de sodio y por ltimo las fibras se secan y muelen, el producto final es un alginato en polvo de color amarillo claro,

El alginato tiene mltiplesaplicacionesenlaindustriafarmacutica,hulera,textil, papelera, de alimentos y cervecera. Se utilizan para espesar, dar consistencia de

39

gel,dar

estabilidad y suavizarproductos.Cuando

se usa producir para

un gel

estable, el alginato usualmente semezclaconunasalde usado bsicamente para formar perlas de alginato que

calcio, estemtodo es contengan clulas vivas o

muertas. Debido a que los gelesdealginatosontrmicamenteirreversibles,las perlas de alginato pueden usarse a temperaturas

elevada^.'^

Encuanto a laspropiedadesfsicas

y qumicas del alginato que se utiliza en la

inmovilizacin de clulas, el alginato forma esferas con muchos cationes divalentes y trivalentes, son trmicamente resistentes, pero se destruyen o se hinchan por un

exceso de cationes tales como el Na', NH4', Mg2', K' o por agentes quelantes como que la el EDTA, citratos, fosfatos y polifosfatos, provocan Se mejora la resistencia mecnica de las perlas de alginato prdida de Ca2+.77 usando bario en lugar

de calcio como agente gelificante. La afinidad de los iones de bario hacia el alginato esmuchomsalta que los iones calcio, las perlas de alginato de bario sonmuy

estables en soluciones cidas o neutras en contraste a las de alginato de calcio. Las perlas son ms estables a los efectos qumicos (amortiguador de fosfato) y mecnico (s~nicacin).'~Las esferasdealginato clulas y tejidos en vivo.79 de bario se han usado comomatrizpara

40

PARTE EXPERIMENTAL

Los espectros de infrarrojo (FTIR) se determinaron en un espectrofotmetro Perkin de Elmer modelo Paragon 1000; los espectros Resonancia Magntica Nuclear

Protnica (RMN-H) en un espectrmetro Bruker modelo DMX500, los espectros de Masas en un espectrmetro Jeol modelo Gcmate, las lecturas de UV se

determinaron en un espectrofotmetro Beckman modelo 35. Los puntos de fusin se determinaron en un aparatoOsymaynoestncorregidos.Lasincubacionesse llevarona cabo en un agitador orbital contemperatura controlada Revcomodelo 051473A. Para cromatografa en capa fina (ccf), se utiliz silicagel GFZs4, (Merck). Los reactivos utilizados fueron adquiridosde:Aldrich,Sigma, Merck yBioxon.La

bacteria Nocardia corallina 5-276 (ATCC 31338),fue adquirida del American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA).

222485

41

Preparacin alcoholes de benclicos substituidos benzoic0 Reaccin de Cannizzaro

y derivados cido de

Alcohol 4-clorobenclico y cido 4-clorobenzoico8oCHOI

COOH

Cl

I

CI

En un matraz de tres bocas de 250 ml, se

pes 2 g

(1.4 X IOq2 mol) de

4-

clorobenzaldehdo, se adiciona poco a poco 11.15 ml (7.1 X I O mol) de KOH al 50%, la mezcla se agita en un bao mara

para mantener la temperatura de 50-60

OC,

hasta que desaparezca el olor al aldehdo, aproximadamente 3 h. Posteriormente se le agrega 55 mldeagua,precipitando el alcohol 4-clorobenclico pf 68-69

C. La

fase acuosa se extrae con ter (2 X 20 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, y se evapora a presin reducida; para obtener 0.366 g del alcohol 4-clorobenclico, pf 68-70O C

(informado, 70-72 oC)32arendimiento 36.1 %. La fase acuosa se acidifica% (pH=2), se forma precipitado, un se

con HCI al 15

recristaliza de etanol

obtenindose 0.347 g del cido 4-clorobenzoico, pf 237-240 O (informado, 239-241 C0C)32b rendimiento 31.2 %. Los productos se identificaron por ccf e I.R.

42

Alcohol 2-nitrobenclico y cido 2-nitrobenzoico

N02

En un matraz de 3 bocas de 250 ml se coloca 2 g (1.3 X 1O-* mol) de 2nitrobenzaldehdo, se adicionapoco a poco 11.35 (9.9 ml

X

mol) NaOH de

al

35 %, se calienta ligeramente en un bao mara, no dejando subir la temperatura ams de 45OC, durante 50 min. Se agrega 100 ml de aguay se extrae con ter (2X 25 ml), formndose un slido, el cual se recristaliza de etanol para obtener 0.396 g del alcohol 2-nitrobenclico, pf68-70

OC, (informado,70-72 0C)32c rendimiento 39.1 %.

La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter, (2X 25 ml), se seca sulfato sodio sobre de anhidro,

y se evapora a presin reducida,OC,(informado,

obtenindose 0.607 g del cido 2-nitrobenzoico, pf 143-145

146-148

oC)32d rendimiento 54.9 %. Los productos se identificaron por ccf e I.R.

Alcohol 4-nitrobenclico y cido 4-nitrobenzoico

43

En un matraz de 3 bocas de

250

ml, se colocan2g

(1.3 X I O mol) 4de

nitrobenzaldehdo, se adiciona poco a poco 11.35 ml (9.9 X IO-* mol) de NaOH al 35 %, se mantiene a una temperatura de 45 agua,seextraeconterO C

durante 30 min. Se agrega 85 ml de de sodio anhidro, se

(2 X 25 ml), sesecasobresulfato

evapora a presin reducida, para obtener 0.419 g del alcohol 4-nitrobenclico, pf 8891 OC,(informado, 92-94 0C)32c rendimiento 41.4 %. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter anhidro, se evapora a (2 X 25 mi), se seca sobre sulfato de sodio

presin reducida, obtenindose 0.467

g del cido 4-

nitrobenzoico, pf 234-238 OC, (informado,239-241 0C)32e rendimiento42.2 O . Los h productos se identificaron por ccf e I.R.

Alcohol 3-nitrobenclico y cido 3-nitrobenzoico 8o

En un matraz de

3 bocas de ml, colocan 25 se

0.2 g (1.3 X

mol) de

3-

nitr~benzaldehdo,~~adicionapocoapoco1.06ml(9.9 se 35 %, se mantiene a una temperatura de 45 agua,seextraeconterO C

X

mol) de NaOH al

durante 30 min. Se agrega 5 ml de sulfato de sodio anhidro, se

(2 X 15m!),sesecasobre44

evapora a presin reducida, para obtener 0.039 g del alcohol 3-nitrobenclico, pf 3031 O , (informado, 30-32 0C)32e C rendimiento 38.4 %. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter (2

X I 5 ml), se seca sobre sulfato de sodiog del cido 3-

anhidro, se evapora a presin reducida, obtenindose 0.047

nitrobenzoico, pf 138-140 O C , (informado,140-142 0C)32e rendimiento42.2 productos se identificaron por ccf e I.R.

YO.Los

Alcohol 2-bromobenclico y cido 2-bromobenzoico8o

En un matraz de

3 bocas de 250 ml, equipado con

agitacin y bao mara;se le

agrega 6.35 ml (5.7 X 1O-2 mol) de KOH al 50 %, se adiciona 1.5 g (8.1 X IOe3 mol) de 2-bromobenzaldehdo;mezcla la se calienta ligeramente para mantener la

temperatura a 6OoC, se continua la agitacin por 2 h. Se agrega agua, se extrae con ter (2 X 15ml), se secasobresulfatodesodioanhidro,seevaporaa presin

reducida, para obtener 0.230 g del alcohol 2-bromobenclico, se recristaliza de agua%. pf 77-81 O C (informado, 79-82 0C)32f rendimiento 30.3 La fase acuosa se acidifica

con HCI al 15 % (pH=2), obtenindose 0.233 g del cido 2-bromobenzoico pf 145-

45

148 O (informado, 145-150 0C)32f rendimiento 28.6 Los productos se identificaron C %. por ccf eI.R.

Alcohol 3-bromobenclico y cido3-bromobenzoico 8o

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, equipado con agitacin y bao mara; se agrega 4.24 ml (3.8X I O mol) de KOH al 50 %, se adiciona 1.O g (5.4 X Omol) de 3I bromobenzaldehdo; se calienta ligeramente para mantener la temperatura a 60 O , C se continua la agitacin por 2 h. Se agrega 20 ml de agua, se extrae con ter (2X 15 ml),sesecasobresulfatodesodioanhidro,seevaporaa presin reducida] para

obtener 0.246 g de un lquido, siendo el alcohol 3-bromobenclico, rendimiento 48.7%

. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), obtenindose 0.260 g del

cido 3-bromobenzoico, pf 153-156 O (informado, 155-158 0C)3a C rendimiento 47.9%. Los productos se identificaron por ccf e I.R.

46

Alcohol 4-bromobenclico y cido 4-bromobenzoico

En un matraz de 3 bocas de

250 ml, equipado con agitacin mecnica se adiciona

h 12.7 ml (1.1 X 10 mol)de KOH al 50 O , seagrega3g

(8.1 X I O 9 mol) de 4-

bromobenzaldehdo; se calienta ligeramente para mantener la temperatura a O y 60 C se continua la agitacin durante 90 min se agrega 50 ml de agua, se extrae con ter

(2 X 15ml), se evaporaa presin reducida para obtener 0.444 g del alcohol 4bromobenclico, pf 73-75 OC, (informado, 75-77 0C)32f rendimiento 29.3 %. La fase acuosaseacidificacon

HCI al 15 % (pH=2),obtenindose0.761g

del cido4-

bromobenzoico, pf 249-252 OC, (informado, 252-254 productos se identificaron por ccf eI.R.

0C)32f rendimiento 46.7 %. Los

47

Alcohol 4-metilbenclico 81CHO

C H Y

I

CH3

En unmatraz de 3 bocas de 250 ml,secolocan1.82 de KOH, se adiciona 2.68 ml MeOH,mezcla de la se

g (1.6 X

mol)de hojuelas

agita hasta completa

disolucin, se adiciona poco a poco una mezcla de 1.25 ml de solucin de CH20 al36 % (1.5 X IO4 mol) y 1.47 ml (1.25 X IO-* mol) de 4-metilbenzaldehdo , se deja a

reflujo durante6:40

h; se destila el MeOH, se agrega 20 ml deagua

se enfria,

formndose un slido de pf 48-50 OC, la fase acuosa se extrae con tolueno (2 X 20 ml), posteriormente se destila el tolueno, dando un slido de pf 43-46O , C

con un

rendimiento de 83.1 %. Se recristalizan de hexano, para obtener 0.936 g del alcohol 4-metilbenclico, pf 57-59 O C , (informado, 59-61 0C)32grendimiento de 50.6 O . Se y h identifica por ccf e I.R.

48

Preparacin de derivados de cidos carboxlicos aromticos Reacciones de Oxidacin con KMn04, HNOS

cido 2-naftoico 82

En un matraz de

3 bocas de 250 ml, se coloca0.5

g (3.2 X I O " mol) 2de

naftaldehdo, se adiciona 125 ml de agua, se deja en vigorosa agitacin hasta formar una emulsin; se calienta ligeramente en un bao mara a una temperatura de 708OoC, se adiciona una solucin de KMn04 [ 0.70839 (4.5 X I O " mol) en 14.16 ml de agua 1, se mantiene la temperatura durante una hora.Se agrega 9 ml de NaOH al 30 %, se filtra y se lava con agua caliente, el filtrado se enfra hasta que precipite la materiaprima sin reaccionar, (62 mg). El filtrado se acidifica con HCI al 15 %

(pH=2), los cristales amarillos se filtran, obtenindose 0.141 g del cido 2-naftoico, pf 183-1 86 O C , (informado, 185-1 87 0C)32h rendimiento 25.6 ste se identifica por %, ccf e I.R.

49

cido 6-bromoveratrIi~o~~

se En un matraz de 3 bocas de 250 ml,

coloca 0.5 g (2.5 X

mol) de 6-

bromoveratraldehdo, se adiciona 125 mi de agua, se deja en agitacin hasta formar una emulsin, se calienta ligeramente en un bao de agua para alcanzar una

temperatura de 70-80 O . Se adiciona una solucin de C mol) en 9 m de agua], se en 1 deja

KMn04 [0.45 g (1.8 X I O "

agitacin por una hora manteniendo la

h temperatura. Se agrega 8 ml de NaOH al 30 O , se filtra en caliente sobre Celita, el

filtrado se enfra hasta que precipite la materia prima sin reaccionar,

el filtrado se

acidifica con HCI al 15% (pH=2), se filtra y se seca para obtener 0.362 g del cido 6bromoveratrlico, pf 181-184OC,

(informado,185-1870C).32iRendimiento

67.9 %,

ste se identifica por ccf e I.R.

50

cido 4-hidroxibenzoico8*

OH

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca 0.462 g (3.8 X I O " mol) de 4-hidroxibenzaldehdo, se adiciona 125 ml de agua, deja se agitando hasta formar una emulsin. se calienta ligeramente en un bao de agua para mantener la temperatura de 70-80 O C . Se adiciona una solucin de KMn04 [0.837g (5.3 X IOm3mol) en 14 ml de agua], s e deja agitando por 2 h, manteniendo la temperatura. Se agrega 10 ml de KOH al 10 % y se filtra en caliente, las sales se lavan con agua caliente, el filtrado se acidifica con 15 ml de HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo (3 X 20 ml),sesecasobresulfatodesodioanhidro,seevaporaa presin reducida. Se

recristaliza de agua obtenindose 0.069 g del cido 4-hidroxibenzoico, pf 212-215

OC, (informado, 215-217 0C).32irendimiento 13.1 %, ste se identifica por ccf e I.R.

51

cido 2-metoxibenzoico8*

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca metoxibenclico, se adiciona 250 m de 1 agua, temperatura de 70-80C. Posteriormente

1 g (7.2 X I O " mol) de alcohol 2-

se calienta ligeramente a una

se adiciona una solucin de KMn04

[0.8120g (5.1 X I O " mol) en 16.4 ml de agua], manteniendo la temperatura por 40 min. Se adiciona 10 ml de NaOH al 30 %, se filtra y se lavan las sales con agua caliente, se enfra para que precipite la materia prima sin reaccionar. Se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo (3 X 20 ml), se evapora a 0.334 g del cido 2-

presin reducida, obtenindosedespusdelavarconter metoxibenzoico, pf

96-99 OC, (informado,98-100

oC).32k rendimiento 30.2 %. El

producto se identifica por ccf e I.R.

52

cido 4-metilbenzoic0~~

En un

matraz de 3 bocas de

250 mi, se pesa 1 g (8.3 X

mol) de 4-

.- I:_I

imetilbenzaldehdo, se adiciona 200 m de 1 agua, calienta se ligeramente para mantener la temperatura de 70-80C. Se adiciona una solucin de (1.1 X mol) en3.4 m de se 1 agua], continua la

{#o-,3..

b

KMn04 [1.77g

( . , c .

:.: ,- c.r

\,

agitacin por hora, una

5 ; 5.

:: .\"

z ;-; :!"4ct

r8-k

manteniendo la temperatura. Se agrega 15 m de KOH al 10 % (pH=12), se filtra en 1 caliente, se lavan las sales con agua caliente, el filtrado se acidifica con HCI al 30 % (pH=2), se filtra y se seca. Se recristaliza de ter para obtener

2;;; :G :3clrI -

,C(,

r i m

@

f ;

7

1.I3 g del cido 4-

oA-

k.

t:!

metilbenzoico, pf 179-181 O , (informado,180-1 82 0C).32'rendimiento 52.1 %. Se C identifica por ccf eI.R.

I:

cido 2-clorobenzoico 83

53

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca 0.5 g (3.5 X I O " mol) de alcohol 2clorobenclico se adiciona 4.34 ml (9.7 X I O " mol) de HN03al 65 %, manteniendo la temperatura de 70-80 O C por una hora. Se enfra, se le adiciona 15 ml de agua fra y se filtra, para obtener 0.383 g del cido 2-clorobenzoico, pf 136-139 OC,(informado, rendimiento 69.7 %. El cido se identifica por ccf e I.R. 138-140 0C).32b

Preparacin de alcoholes benclicos substituidosLiAIHd Reacciones de Reduccin con

Alcohol 4-hidroxibenclic0~~

CHQI

OH

I

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto detrampa

de cloruro decalcio, mol) de 4-

refrigerante de aire, y agitacin; se coloca 1 g (8.2 X IO-'

hidroxibenzaldehdo y 8.97 ml de THF; se adiciona poco a poco 0.36 g (9.6 XIO" mol) de tiAIH4 manteniendo la temperatura a 30 OC,se adiciona 30 ml ms de THF,

se deja en agitacin durante 22:30 h. Se agrega 3 ml de agua y se adiciona 10 mlde NaOH al 30OO /.

La fase acuosa se acidifica con HCI al 15% (pH=2) , se extrae

con acetato de etilo (2 X 25 mi), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora54

a presin reducida, rendimientocrudode97.6

%, los cristales se lavanconter,

obtenindose 0.229 g del alcohol 4-hidroxibenclico, pf 110-1 12 OC, (informado, 118122 0C).32m rendimiento 22.5 YO. identifica por ccf e I.R. Se

Alcohol 6-bromoveratrIi~o~~

CH20Ht

LiAIH4 I THF>

-

.

Er@

OCH3

OCH3OCHR

OCHR

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto detrampade

cloruro decalcio,

refrigerante y agitacin; se coloca 1.5 g (6.1 X 10" mol) de 6-bromoveratraldehdo, y 36.3 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.23 g (6.7 X I O 3 mol) LiAIH4 de

manteniendo la temperatura a 30 OC, la mezcla se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 3

ml de agua y 10 ml de NaOH al 10 %, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidificacon HCI al 15 % (pH=2); se extrae con acetato de etilo (2 X 25 ml), se seca sobre

sulfato de sodio anhidro, se evapora a presin reducida, dando un slido de pf 64-70. O C con rendimiento de96.4%, se recristaliza deter,obtenindose1.12g

del

alcohol 6-bromoveratrlico, pf 88-90I.R.

O rendimiento 70.1 C

%. Se identifica por ccf e

55

Alcohol 3-metoxibencilic0~~

En un matraz de 3 bocas de 25 ml, provisto de trampa de cloruro de calcio, refrigerante y agitacin; se coloca 0.55 g (3.6 X IO

mol) del cido 3-

metoxibenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.29 g (7.5 X O I mol) de LiAIH4manteniendo la temperatura a 30 OC, se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 1 mi de agua y 0.3 ml de NaOH al 15%, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con HCI al 15 % (pH=2),se extrae con ter (2 X 15 ml), se seca sobre sulfato de un liquido,

sodio anhidro, se evapora a presin reducida, obtenindose 0.396 g de

siendo el alcohol 3-metoxibenclico con rendimiento de 79.3 %. Se identifica por ccf

e I.R.

Alcohol 3-metilbenclic0~~

56

En un matraz de 3 bocas de 25 ml, provisto de trampa

de cloruro decalcio,

refrigerante y agitacin; se coloca 1.O g (7.4 X I O mol) de cido 3-metilbenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.59 g (15.5 X mol) de LiAIH4 1 ml de

manteniendo la temperatura a 30 O C , sedeja a reflujo 2:10 h. Se agrega

agua y 0.3 ml de NaOH al 15 O h , para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con

HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter (2 x 15 ml), se seca sobre sulfato de sodioanhidro, se evapora a presin reducida, para obtener 0.717 g de un lquido, siendo el alcohol 3-metilbenclico, con rendimiento de79.9 %. Se identifica por ccf e I.R.

Alcohol 3-clorobencilic0~~

En un matraz de 3 bocas de 25 mi, provisto de trampa de

cloruro decalcio,

refrigerante y agitacin; se coloca 1.1 g (6.4 X 1O mol) de cido 3-clorobenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.38 g (9.6 X I O mol) de LiAIH4 manteniendo la temperatura a 30 O , se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 1 ml de agua y 0.3 ml de C NaQH al 15 %, para eliminar el excesodeLiAIH4.Se acidifica conHCI al 15 % de sodio anhidro, se

(pH=2), se extrae con ter (2 X 15 ml), se seca sobre sulfato

57

evapora a presin reducida, para obtener 0.978 g de un lquido, siendo el alcohol 3clorobenclico con rendimiento de 97.6%. Se identifica por ccf e I.R.

Alcohol 2-naftil~arbinol~~

En un matrazde 3 bocas de 250 ml, provisto detrampade

cloruro de calcio; se

coloca 0.5 g (3.2 X IO" mol) de 2-naftaldehdo, se adiciona 4 m de THF, se agrega 1 poco a poco 0.0649 (8.0 X IO4 mol)deLiAIH4, sedeja

en vigorosa agitacin

durante 1:40 h a temperatura ambiente y una hora a 30 O C . Se adiciona 3 ml de aguay 10 ml de NaOH al 30 % para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con HCI al

15 % (pH=2), se extrae con ter (2 X 25 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidroy se evapora a presin reducida,para obtener 0.464 g del alcohol 2-naftilcarbinol, pf

75-78*C, (informado, 79-81 0C).32n rendimiento 91.7ccf e I.R.

%. El alcohol se identifica por

Alcohol 3-nitrobencli~o~~

58

En un matraz de 3 bocas de cloruro de calcio

250 ml, provisto de refrigerante de aire, trampa0.44 g (2.91 X I O "

de

y agitacin, se coloca

mol) de 3-

nitrobenzaldehdo, se adiciona 16 ml de THF, se calienta ligeramente para mantener la temperatura de 3O-4O0C, durante 40 min,seagrega,pocoapoco, LiAIH4 (3.4 X0.13 g de

mol).Seadiciona 3 ml deaguay 10 ml de NaOH paraeliminar el al 15 O (pH=2),seextraeconacetatode hy se evapora a

excesode LiAlH ; seacidificaconHCI

etilo (2 X 25 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro

presin

reducida, para obtener un lquido aceitoso con rendimiento de

75.4 O . Se purifica h

por cromatografa en columna, se eluy con una mezcla de acetato de eti1o:hexano (2:1), obtenindose 0.139 g del alcohol 3-nitrobenclico, pf 30-31 O , (informado, 30C 32 0C)32e rendimiento 31.2 %. Se identifica por ccf e I.R.

Alcohol 2-hidroxibencilic0~~

En un matrazde

3 bocasde

250 ml,provistodetrampa

de clorurodecalcio,

refrigerante y agitacin;secoloca 3 g (2.5 X15 ml de THF. Seadicionapocoapoco0.47

mol)de2-hidroxibenzaldehdo, cong (1.3 X IOb2 mol)de

LiAIH4, se

mantiene a reflujo durante 10 min y 20 min en agitacin a temperatura ambiente. Se

59

adiciona 3 ml de agua y 10 ml de NaOH al 30

OY

para eliminar el exceso de LiAIH4;

se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora a 1.247 g

(2 x 25 ml), se

presin reducida, para obtener

del alcohol 2-hidroxibenclico recristalizado acetato etilo-hexano de deOC,

(1:0.5), 80-83 pf

(informado,83-85

O)" C"

rendimiento40.9 %. El producto se

identifica por ccf e I.R.

Preparacin de 3-nitrobenzaldehid0~~CHO

CHO

En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto de un embudo de adicin; se adicionah 61.7 ml (1. I 6 mol) de HzS04al 98% y 8.9 ml (2.0 X I O " mol) de HNOS al 65 O , se

enfrasobre

un bao de hielo paramantenerunatemperaturade

5-10 OC. Se

adiciona,gotaagota,

9.5 m (9.9 X IO-' mol) de benzaldehdoaproximadamente 1

durante una hora, manteniendo la temperatura, al trmino de la adicin se retira el bao de hielo y se deja en agitacin durante25 min. a temperatura ambiente. Se

agrega 150 g de hielo, se forma un slido ste se filtra y se lava en varias ocasionescon agua fra, se lleva a (pH=12) con NaOH al 12 %, se filtra, el slido se recristaliza

60

de etanol, para obtener 8.977 g del 3-nitrobenzaldehdo, pf 55-5759 0C)32 rendimiento del 60.0 %, este se identifica por ccf e I.R.

OC,

(informado, 57-

Mtodo general de preparacin de dioles LiAIH4& correspondientes por reduccin con

a

partir

de las lactonas

222485Se prepararon los siguientes dioles: 1,4-pentanodiol; 1,4-octanodiol; 13y-

siguientes lactonas: undecanodiol; 1-fenil-I ,4-butanodiol a partir de las valerolactona, y-octanolactona, 6-undecanolactona y y-fenily-butirolactona.

En un matraz de 3 bocas de ml, 25

provisto de trampa de cloruro de calcio,

refrigerante y agitacin; se coloca 1 mol de la lactona, con 7 ml de THF, se adiciona poco a poco 1.2moldeLiAIH4 manteniendo la temperatura a 30O , sedeja C

en

agitacin a temperaturaambientesiguiendo

el curso de la reaccin porccf.Se

agrega suficiente agua y 5 ml de NaOH al 30 %, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con 15 ml de HCI al 18 % (pH=2); se extrae con ter (2 X 20 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora a presin reducida, dando un lquido con rendimiento de 47-79 %. Se identifica por ccf e I.R.

61

Tabla 2. Obtencin de Dioles Lactona y-valerolactona y-octanolactona 6-undecanolactona y-fenily-butirolactona Tiempo Diol 1,4-pentanodiol 1,4-octanodiol 1,5-undecanodiol 1-fen-I ,4-butanodiol% Rendimiento

(h) 2:O22:o O: 17 3:O

79.1 47.3 79.3 70.0

Activacin de Nocardia corallina 8-276

La activacin de la bacteria se efectu a travs de la inoculacin de una placa de agar con una suspensin de la cepa comercial fue incubada a 30 O por tres das. y C La composicin del agar es: Extracto de carne, 3.0 g/; peptona, 5.0 g/l; agar, 15 g/l; a un pH = 6.8.

Una muestra de la cepa almacenndose a -2OOC.

se preserv en glicerol acuoso

al 80 % (v/v),

62

El medio de cultivo lquido usado en las biotransformaciones se prepar de lasiguiente manera:

Solucin A: FeS04 7. H20,0.05 gll; K2HP04,1.74 gll; (NH4)2SO, , 2.0 gll; extracto de levadura, 1.O g/l. Solucin B: MgS04 , 1.5 g/. Solucin C:glucosa, 2.0 g/l. Cada solucin fue esterilizada por separado y aspticas ajustando el pH final, a 8.0 (fl.5). se mezclaron condiciones bajo

Procedimiento general para efectuar las biotransformaciones

Precultivo I: Un matrazErlenmeyer

de 125ml,conteniendo

50 mldemediode

cultivo estril, fue inoculado con el contenido de una placa de agar (con crecimientoo desarrollo de ms de 72 h), posteriormente se incub a 28-30O C

con agitacin

rotatoria (200 rpm) por 24-30 h. Precultivo II: El contenido del matraz de la etapa del Precultivo I fue aspticamente trasvasado a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, el cual contena 100 ml del mismoO C

medio de cultivo estril; el matraz fue incubado a 28-30 (200 rpm) por 24-30 h.

con agitacin rotatoria

63

Biotransformacin: Los substratos se adicionaron, bajo

condiciones aspticas, al

cultivo anterior (Precultivo II) en cantidades de 100-150 mg, utilizando 1.O mi de N,Ndimetilformamidacomocodisolvente,seguidode la adicin de 10 ml den-octano

como segunda fase. La mezcla se agit a 28-30 O C y el progreso de la reaccin se sigui por ccf.

El aislamiento del producto se realiz llevando la mezcla de reaccin a un pH cido con la adicin de 0.5 ml de HCI al 20 % , saturando con cloruro de sodio y filtrando sobre Celita, el filtrado se extrae con acetato de etilo(4 X 25 ml), se seca sobre

sulfato de sodio anhidro, y se evapora el disolvente a presin reducida. El residuo se disuelve en ter etlico y se adiciona una solucin saturada de bicarbonato de sodioo de hidrxido de sodio 1N, (2 X 10 ml), separndose las fases. La fase orgnica se

seca sobre sulfato de sodio anhidro, se

filtra y se evapora el disolvente a presin

reducida obtenindose, entre los neutros, el alcohol recuperado. La fase acuosa se ajusta a pH=l con sol. de HCI al 18 % y se extrae con ter etlico (4 X 20 ml), se secasobresulfatodesodioanhidro,se reducida obtenindose el cido deseado. filtra y evapora el disolvente a presin

64

Procedimiento general para la biotransformacn de dioles

La biotransformacin se llevo acabo por el procedimiento anteriormente descrito y el aislamiento del producto por sus caractersticas se efectu de la siguiente manera:

la mezcla de reaccin se lleva a un pH=5 con 0.5 m de HCI al 10 %, saturando con 1cloruro de sodio y filtrando sobre Celita, el lquido se extrae con cloruro de metileno

(3 X 25 ml), sesecasobresulfatodesodioanhidro,se

filtra y se evapora el

disolvente a presin reducida. A veces se requiere de extraccin continua (12 h) con cloruro de metileno o cloroformo (200 ml).

Cuantificacin de clulas Este mtodo se basa en laslecturasde

las densidadespticas (D.0) de varias

I I diluciones (1:O, 1:I 00, I :000, etc) para la cuantificacin de clulas en mg/ml pormedio de un espectrofotmetro.

A los medios de cultivos lquidos de clulas preparados como

se mencion

anteriormente (por duplicado) despus de 72 h, se centrifugan a 9000 rpm/20 min a4 O C , se desecha el sobrenadante y el precipitado es resuspendido en 20 m de agua 1

destilada, de esta mezcla se toma 1 ml y se agregan 9 ml de agua destilada y se lee en el espectrofotmetro a 660 nm, de esta dilucin se toma 1 ml ms 9 ml de agua

65

destilada y se lee en el espectrofotmetro y as sucesivamente se hacen varias diluciones. Este mtodo seha desarrollado con la estndar y poder extrapolar los resultados. finalidad de obtener una curva

Se pesaron 10 filtros milipore, 47 mm de dimetro, se ponen a peso constante a 60O C

durante 22 h, posteriormente se pesa cada uno deellos.

En los filtros milipore pesados anteriormente se filtran las diluciones hechas, se ponen a peso constante a 60O C

durante 22 h. Por diferencia se obtiene

el peso

seco, el cual junto con la D.O. se graficaobtenindoseas

la pendiente (m) y el

intercepto (b) para poder extrapolar los resultados obtenidos en la grficay aplicar la siguiente ecuacin:

X= (y-b/m) (dilucin)Donde:

X= mg/ml de clulas (peso seco) m= pendiente

Y= densidad ptica b=intercepto

Procedimiento para la inmovilizacin de clulas

Produccin de biornasa. En un matraz Erlenmeyer de 500 ml conteniendo 200 ml del medio de cultivo estril (etapa para la produccin de biomasa) fue inoculado con las clulas contenidas en la placa deagar y se incubo a 28-30 OC, con agitacin rotatoria (200 rpm) por 96 h. Las mezcla se centrifug a 4O C

(9000 rpm) por 20 min.

66

Procedimiento inmovilizacin. de

AI paquete celular

(suspensin de clulas

centrifugadas para tener una concentracin aproximada de 100 mg de peso seco de clulas por ml de solucin de alginato) se le adicion la solucin del cido alginic0 al 15 % (p/v) y esta suspensin se gote a velocidad constante (bomba peristltica) sobre una solucin de cloruro de bario 0.125 M, dejndose en agitacin por 24 h. Guardndose en la misma solucin a 4 OC,hasta su uso.

Procedimiento parala biotransformacin con clulas inmovilizadas

La biotransformacin se llev a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 ml utilizando de 10 a 40 esferas de Nocardia inmovilizada, se le adiciona de 50 a 150 mg de alcohol furfurlico en 50 mi del medio de cultivo lquido antes descrito, 0.8 agitacin rotatoria (140 rpm) a 28-30

m de DMF l

y 10 ml de n-octano. La mezcla heterognea se agita por periodos de 24 a 72 h con

"C.

67

RESULTADOS Y DISCUSJN

Se estudiaron en primera instancia, las condiciones adecuadas para

el crecimiento

de Nocardia corallina, con agitacin reciprocante, para ello se cuantific el peso del microorganismo desarrollado en relacin a la temperatura de incubacin (intervalo

de 2 O a 32O C) y al pH del medio de cultivo (intervalo de 6.97 a 8.6) encontrndose 6 que el intervalo de pH ms adecuado para producir 7.6-8.0 y la temperatura de incubacin de 28-30 OC. un ptimo crecimiento fue de

Durante el estudio anterior se enfrentaron serios problemas,

ya que Nocardia

corallina presentaba diferentes formas de desarrollo, lo mas frecuente fue encontraruna aglutinacin de clulas,conduciendo a biotransformaciones no reproducibles. Ademsenla fase dePrecultivo I I lasclulasmostraron una coloracin amarilla,

fuera de lo normal. Por estudios microscpicos (frotis en fresco) se observ que el material biolgico no estaba contaminado conservndose la identidad de la bacteria, pero se aprecia algo de lisis celular.

El problema de la aglutinacin se atribuy al tipo de agitacin que se estaba biomasa utilizando, ya que al cambiar a agitacin rotatoria la produccin de

68

(Precultivo II), nos llevo al desarrollo de clulas en suspensin con opalescencia de color salmn, lo cual condujo a biotransformaciones exitosas y reproducibles.

El objetivo de esta tesis era el estudiodelaoxidacinprimarios, por ello el substrato inicial, ademsdeser

de alcoholes benclicos la referencia lgica, fue el

alcohol benclico. De los experimentos realizados con el alcohol benclico (35-50 mg, con tiempos de 4-22 h de biotransformacin), no se obtuvo el cido benzoico esperado y si una mezcla compleja de por lo menos dos productos mayoritarios, no observndose el aldehdo correspondiente.

Con el objetivo de racionalizar estosresultados, se llev a cabo un experimento utilizando al cido benzoico como substrato, las bajo mismas condiciones de biotransformacin; sin embargobajoestascondiciones biotransform, recuperndose la materia prima sin cambio. el microorganismo no lo

Ello hace evidente que

el cido benzoico no es un intermediario en la ruta para obtener alguno de los dos compuestos no identificados antesmencionados, otras rutas benzoico. metablicas estn involucradas, previas y nos indica que posiblemente a la produccin del cido

A pesar de los resultados desalentadores se procedi a probar la biotransformacin

con otros alcoholes benclicos substituidos en

el anillo aromtico. Para esta

69

discusin los resultados se presentarn agrupados por patrn de substitucin,

seguido por los substratos no relacionados estructuralmente.

En la Tabla 3 semuestran los resultadosobtenidos con los alcoholesbenclicos

Tabla 3. Biotransformacin de alcoholes benclicosorto-~ubstituidos~~

CHzOHI

COOHI

% Rendimiento

Tiempo Reaccin de (h )2711026

(mol/mol)1: R= OH3: R= NO:!

2: R= OH4: R= NO26: R= C I

74

-

a

5: R= C I 7: R= NH2

1 9

8 : R= NH2

-b512

26

9:R= OCH311: R= Br

10: R= OCHJ12: R= Br

2730

a: 25 YOde materia prima recuperada b: mezcla compleja

70

Los grupos substituyentes se seleccionaron con el fin de investigar, s los efectoselectrnicos de estos podran influencia tener Desafortunadamente los resultados no en el procesooxidacin. de

mostraron una relacin clara entre

los

efectos electrnicos y el rendimiento de los productos de oxidacin. Para el caso de los gruposactivadores(hidroxilo,amino,metoxilo), el orfo-hidroxiderivado

(1)

produjo el rendimiento ms alto, por el contrario el o-metoxi derivado (2), mostr una caida sustancial del rendimiento (solo 5%). Lo anterior nos llevo a especular sobre la necesidad de la presencia del grupo oxidrilo libre a cierta distancia del grupo ltimo viene a reforzar la

reactivo, en este caso el oxidrilo benclico primario. Esto

hiptesis, presentada por Luna et al2, de que un grupo oxidrilo libre a cierta distancia es imprescindible para llevarse a cabo la oxidacin de Il4-dioles (ambos primarios) para producir lactonas quirales con la Nocardia coralha.

Otra posible explicacin para el bajo rendimiento en la

produccin del cido

(u),del

podra ser un potencial impedimento estrico, efecto ampliamente conocido en casos similares. Aunque para el caso de voluminoso tomo bromo de

los derivadoshalogenados,lainfluencia

(12 O de h rendimiento)

no produjo una caida tan

dramtica en relacin al substituyente cloro (19 O h rendimiento).

71

El caso del amino derivado (I), parece involucrar factores adicionales a los efectoselectrnicos del substituyente; se observ la desaparicin de la materia prima, pero en lugar del esperado cido antranlico

(S) se obtuvo una mezcla compleja de (S), condujo a la recuperacin de laa pesar del largo no

productos.Por el contrario el nitro derivado

materia prima en un 25 % (despus de recristalizar deagua),

perodo de reaccin; el anlisis cromatogrfico durante biotransformacin la

mostr la aparicin de ningn producto adicional y la baja recuperacin de la materia prima se debi a la recristalizacin de la compleja fase neutra extrada.

Es de mencionarse que esta metodologa constituye unanueva opcin para prepararel conocido intermedio farmoqumico denominado c. saliclico (2).

72

Tabla 4. Biotransformacin de alcoholes benclicos a r a - s u b s t i t ~ i d o s ~ ~ p

R% Rendimiento

Tiempo de Reaccin

(mollmol)13: R= OC:H3

(h)6

14: R= OC;Hz 16 : R= C I 18: R= NO220: R=OH

32

15: R= CI 17: R= NO219: R= OH

5050a

24 24

2427

21:

R