04 Determinacion de La Sensibilidad Metodo de Dilucion 2012

7/25/2019 04 Determinacion de La Sensibilidad Metodo de Dilucion 2012

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Servicio Antimicrobianos - INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

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M07-A9Vol. 32 No. 2

Replaces M07-A8Vol. 29 No. 2

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DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD

A LOS ANTIMICROBIANOS POR EL METODO

DE DILUCION

1.0 ALCANCE DE LA METODOLOGA

La sensibilidad in vitro de las bacterias a los agentes antimicrobianos se puede ensayarmediante varios mtodos disponibles en el laboratorio. Este documento describe las tcnicas

estandardizadas de dilucin en caldo (macrodilucin y microdilucin) y agar, para ensayar in vitrola sensibilidad de bacterias que crecen aerbicamente. En este documento estn descriptos lapreparacin de los mtodos de dilucin en caldo y agar, las condiciones del ensayo (preparaciny tamao del inculo, tiempo de incubacin y temperatura), el informe de los resultados de CIM,los controles de calidad, y las limitaciones de los mtodos de dilucin. Tambin se presentan lasguas para la seleccin de los agentes antimicrobianos a ensayar e informar de rutina. Lasnormas para el ensayo in vitro de la sensibilidad de bacterias que crecen aerbicamenteutilizando el mtodo de difusin por discos se encuentran en el documento M2 de la CLSI,Perfomance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests.

2.0 INTRODUCCIONLas tcnicas de dilucin en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente laactividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos mtodos se basanen la preparacin de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a loscuales se les agrega el antibitico (ATB) en distintas concentraciones. Luego se inoculan cadauno de los tubos o placas con una suspensin estandarizada del microorganismo en estudio. Laspruebas se examinan despus de incubar overnight a 35 2C y se determina laconcentracin inhibitoria mnima (CIM) del antimicrobiano frente al microorganismo ensayado.

El resultado final depende significativamente de la metodologa empleada. Por ello, para obtenervalores reproducibles intra e interlaboratorios, cada detalle tcnico debe ser cuidadosamentecontrolado.En este documento se describen las tcnicas estandarizadas de dilucin en caldo (Macro-Microdilucin) y el mtodo de dilucin en agar. Las bases para la realizacin de estasmetodologas derivan, en gran parte, de la informacin generada por un estudio colaborativointernacional (1). Aunque estos mtodos son referenciales, algunos son lo suficientementeprcticos para ser desarrollados tanto en los laboratorios clnicos como en los de investigacin.Existen tambin sistemas comerciales que se basan, al menos en parte, en los mismosconceptos y dan resultados equivalentes a los obtenidos con las tcnicas descriptas en estedocumento. La aprobacin de estos sistemas comerciales, en los EEUU, es responsabilidad dela United States Food and Drug Administration (U.S. FDA). El CLSI no aprueba productos nidispositivos comerciales.Las tcnicas que se describen en este documento fueron diseadas para ensayar bacteriasaerbicas o facultativas de fcil desarrollo despus de incubacin overnight en medio M. Hintonsin suplementos. Para algunos microorganismos fastidiosos se describen mtodos y medios

alternativos en la seccin 11 y en M-100 en las Tablas 2E a 2I. Las normas para el ensayo invitrode la sensibilidad de bacterias que crecen anaerbicamente pueden ser encontradas en eldocumento M11, Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria. Lasnormativas para determinar la sensibilidad de bacterias fastidiosas o no aisladafrecuentemente, no incluida en los documentos M02, M07 o M11, estn disponibles en eldocumento M45 del CLSI.Este documento conjuntamente con el M-100, describen la metodologa, el control de calidad yel criterio de interpretacin recomendado actualmente para las pruebas de dilucin. Cuando se

reconozcan inconvenientes o se desarrollen mejoras en este tema, los cambios se incorporarn

en ediciones futuras de esta norma y se distribuirn en suplementos de informacin anuales.


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3.0 PRECAUCIONES SOBRE MATERIAL INFECCIOSO

Dado que es imposible reconocer de antemano que aislamiento o muestra podra ser infecciosa,todo material y/o paciente deber ser tratado como infeccioso y se debern adoptarprecauciones estndares. Las precauciones estndares son guas que combinan lasprincipales caractersticas de las precauciones universales y practicas de aislamiento de

muestras corporales. Las precauciones estndares cubren la transmisin de todos losagentes infecciosos, mientras que las precauciones universales slo se aplican a latransmisin de patgenos sanguneos. Las precauciones estndares y universales estndisponibles en el Centro de Control y Prevencin de Enfermedades de USA (CDC). Paraprecauciones especificas sobre el riesgo de trasmisin de patgenos al personal de laboratorio

y para las recomendaciones sobre el manejo de la exposicin a todos los agentes infectantes,refirase a la edicin mas actualizada del documento M29 del CLSI.

4.0 DEFINICIONES

Categora de interpretacin de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos :

Clasificacin basada en la respuesta in vitrode un microorganismo a un antibitico en los nivelesque ste alcanza en sangre o tejidos con una dosificacin habitual;1) Categora de interpretacin SENSIBLE: Esta categora implica que una infeccin dadapor la cepa en estudio puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibiticorecomendada para el tipo de infeccin y la especie infectante, a menos que hubierancontraindicaciones;2) Categora de interpretacin INTERMEDIO: Esta categora incluye cepas que pueden serinhibidas por concentraciones de antibitico ms elevadas, siempre que se pueda aumentar ladosis.(Ej. -lactmicos) o que la droga concentre fisiolgicamente en el tejido infectado (Ej.quinolonas y -lactmicos en orina). Tambin nos indica una "zona buffer" que debera evitar que

pequeos factores tcnicos difciles de controlar causen mayores discrepancias deinterpretacin;3) Categora de interpretacin RESISTENTE: Las cepas resistentes no son inhibidas por

las concentraciones sricas normalmente alcanzadas a dosis habituales y/o caen en el rangodonde son comunes mecanismos especficos de resistencia microbiana (por ejemplo -lactamasas) y la eficacia clnica no ha sido comprobada;4) Categora de interpretacin NO SENSIBLE: esta categora se utiliza paramicroorganismos que slo tienen categora de interpretacin sensible, debido a la ausencia o ala rara aparicin de cepas reisistentes. Aquellos aislamientos con CIMs mayores o halos deinhibicin menores al punto de corte de sensible, se denominan no sensibles; NOTA 1:Estadesignacin no implica necesariamente que exista un mecanismo de resistencia en elmicroorganismo. Puede suceder que, posteriormente al establecimiento del punto de corte desensibilidad, se encuentren aislamientos con CIMs mayores al punto de corte de sensibilidad,que no posean un mecanismo de resistencia, y que estn dentro de la distribucin wild-type.NOTA 2: para cepas con resultados en la categora de no sensible se debe confirmar laidentificacin y la sensibilidad antimicrobiana.

Punto de corte / criterio de interpretacin: el valor de CIM o el halo de inhibicin utilizadospara indicar sensible, intermedio y resistente se definen como se explic anteriormente.Por ejemplo, para el antimicrobiano X con el siguiente criterio de interpretacin::

CIM (g/ml) Halos de inhibicin (mm)

Sensible 4 20

Intermedio 8-16 15-19

Resistente 32 14


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Punto de corte de sensibilidad es 4 g/ml o 20 mmPunto de corte de resistencia es 32 g/ml o 14 mm

D-test: prueba de difusin que utiliza discos de clindamicina y eritromicina colocados a ciertadistancia, para detectar la presencia de resistencia inducible a clindamicina en estafilococos yestreptococos.

Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM): mnima concentracin de un antimicrobiano quepreviene el desarrollo visible de un microorganismo en una prueba de sensibilidad por dilucin encaldo o agar.

Control de calidad: incluye todas aquellas tcnicas operativas y procedimientos utilizados paracumplir los requerimientos de calidad (ISO 9000); NOTA: sistema para asegurar elmantenimiento de los estndares mediante la inspeccin peridica de los resultados y tcnicasusadas para asegurar exactitud y reproducibilidad.

Salina: una solucin de 0,85 a 0,9 % de ClNa

4.1 ABREVIATURAS/ACRONIMOS

AST Prueba de sensibilidad a los antimicrobianosATCC American Type Culture Collection

BHI Infusin Cerebro CoraznBLNAR lactamasa negative, ampicilina resistente.BSC Gabinete de Seguridad Biolgica.BSL Nivel de Seguridad Biolgica (USA)CDC Centro para el Control y Prevencion de Enfermedades (USA).CFU Unidades Formadoras de Colonias.CMRNG N. gonorrhoeaeresistente a penicilina por mecanismo cromosmico.CSF/LCR Liquido cefalorraqudeo.DNA Acido deoxiribonucleico.EDTA Acido etilendiaminotetracetico.ESBL/BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido.FDA Food and Drug Administration (FDA).HTM Haemophilus Test Mdium.

hVISA S. aureusintermedio a vancomicina, heterorresistente.ICS Estudio internacional colaborativo.KPC K. pneumoniaecarbapenemasa.MDR Resistente a mltiples drogas.MHA/AMH Agar Mueller Hinton.MHB/CMH Caldo Mueller Hinton.MHT Test de Hodge modificado.MIC/CIM Concentracin Inhibitoria Mnima.MLSB Macrlidos, lincosamidas y estreptograminas tipo B.MRS Estafilococo meticilino-resistente.MRSA/SAMR S. aureusmeticilino-resistente. NAD Nicotinamida adenina dinucleotido.PBP 2 a Proteina ligadora de penicilina 2a.

QA Aseguramiento de la calidad.QC Control de calidad.RNA Acido ribonucleico.TEM Temoneira (primer paciente reportado con una cepa productora de

-lactamasa tipo TEM).US Estados Unidos.VISA S. aureusintermedio a vancomicina.VRE/EVR Enterococo resistente a vancomicina.


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5.0 INDICACIONES PARA REALIZAR PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Las pruebas de sensibilidad deben realizarse slo sobre microorganismos asociados ainfecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificacin. Ladeterminacin de la sensibilidad est indicada en los casos en que el microorganismo causal dela infeccin pertenezca a una especie capaz de exhibir resistencia a los antibiticos de usoclnico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos incluyen: produccin de

enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de accin y modificaciones en el ingreso o el eflujode las drogas. Para los microorganismos que posean sensibilidad antibitica predecible serecomienda la aplicacin de la terapia emprica adecuada. Rara vez son necesarias las pruebasde sensibilidad para microorganismos sensibles a una droga altamente eficaz, (por Ej.Streptococcus pyogenes que ha mantenido invariable su sensibilidad a penicilina). En caso de

infecciones causadas por S. pyogenes en pacientes alrgicos a la penicilina, para terapiaalternativa, se puede ensayar la sensibilidad a la eritromicina u otros macrlidos, debido a quepueden existir cepas resistentes a estas drogas. Las pruebas de sensibilidad tambin sonimportantes en estudios de epidemiologa de la resistencia y de nuevos agentesantimicrobianos.

Para realizar pruebas de sensibilidad e identificacin se debe partir de un cultivo primario enmedio slido y se deben procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda

tener rol patgeno. No se deben realizar pruebas de sensibilidad sobre mezclas de diferentestipos de microorganismos, ni sobre el material clnico sin procesar (Ej.: fludos biolgicosnormalmente estriles y orina), excepto para emergencias clnicas donde la coloracin de Gramsugiera la presencia de un slo patgeno. Cuando la prueba de sensibilidad haya sido realizada apartir del material clnico, se debe informar como resultado preliminar y se debe repetirutilizando la metodologa estandarizada. En este caso, el resultado debe informarse comopreliminar y luego debe repetirse usando la metodologa estandarizada. No es aconsejable larealizacin de pruebas de sensibilidad, cuando la naturaleza de la infeccin no es clara y la

muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aisladosprobablemente tengan poca relacin con el proceso infeccioso. En estos casos los resultadosobtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento.

El valor de CIM obtenido por el mtodo de dilucin, orienta al clnico sobre que concentracin de

antibitico necesita alcanzar en el sitio de infeccin para inhibir el microorganismo infectante. LaCIM, sin embargo, no representa un valor absoluto. La CIM real puede estar entre la menorconcentracin de antibitico que inhibe al microorganismo y la siguiente donde se observadesarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas diluciones al medio y se determina unaCIM de 16 g/ml, el verdadero valor podra estar entre 16 y 8 g/ml. Debe tenerse en cuentaque a pesar de realizar las pruebas de dilucin bajo condiciones cuidadosamente controladas, nosiempre se obtienen los mismos resultados. Generalmente, la reproducibilidad de esta pruebaes de +/- 1 dilucin. Para evitar gran variabilidad en los resultados, se debe estandarizar ycontrolar cuidadosamente la prueba de dilucin tal como se describe en este documento.

La metodologa ms comn para la determinacin de la CIM es la que utiliza diluciones seriadasal medio (por Ej. 1, 2,4, 8,16 g/ml, etc.). Tambin existen otros esquemas de dilucin, queutilizan unas pocas concentraciones (hasta dos), concentraciones "Breakpoint" o que agreganconcentraciones entre las que se ensayan normalmente (por Ej. 4, 6, 8, 12, 16 g/ml). Losresultados de estos mtodos alternativos pueden ser igualmente tiles en la clnica; sin

embargo, a veces son ms difciles de controlar (ver seccin 16.3). Cuando se produceinhibicin del crecimiento con la menor concentracin utilizada, el verdadero valor de la CIM nose puede determinar exactamente y debe informarse como igual o menor que dichaconcentracin. Cuando se ensayan concentraciones adicionales entre las usuales y la CIM esuna de esas concentraciones intermedias, la interpretacin de la prueba se debe hacer despus


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de redondear el valor a la prxima superior dilucin al medio del esquema normal (por Ej. UnaCIM de 6 g/ml se debe redondear a 8 g/ml y luego interpretar).

Cuando se informa al clnico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompaado por sucorrespondiente interpretacin (por Ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE) que se obtieneaplicando los criterios enumerados en las Tablas 2A a 2I del M-100. Cuando las CIMs serealizan con 4 o menos concentraciones consecutivas, o con concentraciones no consecutivas,

se debe informar la correspondiente interpretacin. Si se desea se puede informar adems elrango de CIM.

6. SELECCION DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA LAS PRUEBAS DESENSIBILIDAD

La seleccin de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusin, es una

decisin de cada laboratorio clnico en consulta con el cuerpo mdico, el comit de farmacia y elcomit de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1A, 1B y 1C del documento M100, enumeranlos agentes de eficacia clnica probada para el tratamiento de infecciones producidas pordistintos tipos de microorganismos. Estos antimicrobianos muestran resultados aceptables enlas pruebas in vitro.Las consideraciones que se han tenido en cuenta para la designacin de un agenteantimicrobiano en un grupo especfico de prueba e informe incluyen: eficacia clnica, prevalenciade resistencia, minimizacin de la emergencia de resistencia, costo, indicaciones de la FDA y lasrecomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativas. La evaluacin de lasensibilidad a determinados antimicrobianos debe ser til para el propsito de control deinfecciones.

6.1. Informes de rutina

Las tablas 1A, 1B y 1C del documento M100, contienen recomendaciones de losantibiticos a ensayar e informar frente a cada grupo de microorganismos consideradosapropiados en la actualidad. Para evitar una mala interpretacin, el informe de rutina almdico, deber incluir nicamente las drogas apropiadas para el uso teraputico como

sugieren las Tabla 1A, 1B y 1C. Se podrn incluir o retirar antibiticos de esta lista dedrogas a ensayar e informar de acuerdo a necesidades particulares. Otras drogasinapropiadas para tratamiento pueden ser probadas para proveer datos taxonmicos oinformacin epidemiolgica. Sin embargo, tales resultados debern estar disponibles (en ellaboratorio) slo para el comit de control de infecciones y/o para los epidemilogoshospitalarios.

6.2. Nombre genrico

Para minimizar confusiones, todos los antibiticos debern ser referidos por su nombregenrico. Para resaltar la relacin que guardan muchas drogas disponibles en la actualidad,se puede agrupar en clases de la siguiente manera:

6.2.1. -Lactmicos(ver M100 Glosario I, Parte 1)

Los antibiticos -lactmicos poseen un anillo central de cuatro tomos denominado anillo-lactmico. El mecanismo de accin de este grupo de drogas es la inhibicin de lasntesis de pared celular. El agregado de grupos sustituyentes u otras estructurascclicas adicionales al anillo -Lactmico determinan si el agente es una penicilina, uncefem, un carbapenem o un monobactam.


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6.2.2 No -Lactmicos (ver M 100 Glosario I, Parte 2)

6.2.2.1 Aminoglucsidos

Son un grupo de antibiticos de estructura similar que inhiben la sntesis de protenas anivel ribosomal. Esta clase de antimicrobianos est compuesta por drogas que tienendistinta estabilidad a las enzimas modificadoras de aminoglucsidos. Esto determina

diferencias en el espectro de actividad de cada uno de sus miembros. Se utilizanprincipalmente para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gram negativosaerbicos o en combinaciones sinrgicas (con antibiticos inhibidores de la sntesis depared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, Ej. enterococos.

6.2.2.2 Inhibidores del metabolismo del folato (Sulfonamidas y Trimetoprima)

Este grupo de compuestos, abarcan varios agentes quimioterpicos con similar espectrode actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato. El sulfisoxazol es la sulfonamidams comnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lotanto podra ser apropiada su seleccin para la evaluacin in-vitro. El sulfametoxazol esusualmente ensayado en combinacin con trimetoprima porque producen una inhibicinsecuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias gram positivas y

negativas.

6.2.2.3 Glicopptidos

Los glicopptidos que incluyen a la vancomicina (en la subclase glicopeptido) y a lateicoplanina (en la subclase lipoglicopeptido) poseen una compleja estructura qumica yactan inhibiendo la sntesis de pared celular en un sitio blanco diferente al de losantibiticos -Lactmicos. La actividad de este grupo est dirigida principalmente a las

bacterias gram positivas aerbicas. La vancomicina se recomienda para el tratamientode infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alrgicos a la penicilina ytambin es til para la terapia de infecciones debidas a microorganismos gram positivosresistentes a los antibiticos -Lactmicos, Ej.: Staphylococcus aureus meticilinoresistentes (MRSA) y algunos enterococos.

6.2.2.4 Lipopeptidos

Incluye a un grupo de compuestos estructuralmente relacionados cuyo principal sitioblanco es la membrana celular. La subclase de las polimixinas incluye a la polimixina B y alcolistin, activos frente a bacteria gram negativas. La daptomicina es un lipopeptido cclicoactivo frente bacterias gram positivas. La actividad de estos lipopeptidos estafuertemente influenciada por la presencia de cationes divalentes en el medio de cultivoutilizado. El exceso de Ca++ inhibe la actividad de las polimixinas mientras que esesencial la presencia de niveles fisiolgicos de Ca++ (50 mg/L) para la correctaactividad de la daptomicina.

6.2.2.5 Macrlidos

Los macrlidos son antibiticos estructuralmente relacionados que inhiben la sntesisproteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercadoque podran ser considerados para ensayar frente a bacterias gram negativas con

requerimientos nutricionales especiales. Para organismos gran positivos solo deberaensayarse rutinariamente la eritromicina. Este grupo de antibiticos consiste de distintossubgrupos que incluyen la azitromicina, claritromicina, diritromicina, y el cetolidotelitromicina el fluorocetlido solitromicina.


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6.2.2.6. Nitroimidazoles

Los nitroimidazoles, que incluyen al metroinidazol y al tinidazol, son agentes bactericidasque son convertidos intracelularmente en los organismos sensibles a metabolitos quedesarregla el DNA del husped; son activos slo sobre bacterias anaerobias estrictas.

6.2.2.7. Oxazolidinonas

EEll ggrruuppoo ddee l laass ooxxaazzoolliiddiinnoonnaass eess uunnaa ccllaassee ddee aaggeenntteess aannttiimmiiccrroobbiiaannooss ccuuyyoo nniiccoommeeccaanniissmmoo ddee aacccciinn eess i innhhiibbiirr l laa ssnntteessiiss ddee pprrootteennaass.. EEll pprriimmeerr aaggeennttee aapprroobbaaddoo ddeeeessttaaccllaasseeffuueeeelll liinneezzoolliiddqquueettiieenneeaaccttiivviiddaaddccoonnttrraaoorrggaanniissmmoossGGrraammppoossiittiivvooss..

6.2.2.8. Quinolonas

Este grupo de compuestos incluye un nmero de agentes antimicrobianos ntimamenterelacionados cuyo principal mecanismo de accin es la inhibicin de la DNA-girasa (o laactividad de la topoisomerasa) de muchas bacterias gram positivas y negativas. Algunasdiferencias en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensaye comoagentes individuales.

6.2.2.9. Estreptograminas

Las estreptograminas, que incluyen al quinupristn-dalfopristin y linopristin-flopristin, sonuna combinacin de dos pptidos cclicos producidos por Streptomycesspp. Ellos actan

en forma sinrgica para inhibir la sntesis de protenas, principalmente en organismosGram positivos, aunque poseen limitada actividad frente a algunos organismo Gramnegativos y anaerobios.

6.2.2.10. Tetraciclinas

Las tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas de ciertas bacterias gram positivas y

negativas a nivel ribosomal. Las drogas de este grupo estn muy relacionadas y salvoescasas excepciones, slo la tetraciclina debera ser ensayada de rutina. Las bacteriasque son sensibles a tetraciclina se pueden considerar sensibles tambin a doxiciclina yminociclina. Sin embargo, algunos microorganismos intermedios o resistentes atetraciclina pueden ser sensibles a doxiciclina, minociclina o a ambos. La Tigeciclina, unaglicilciclina, es un derivado de la minociclina con actividad contra microorganismos quepodran ser resistentes a otras tetraciclinas.

6.2.2.11. Clases de antibiticos con una nica droga

En este grupo encontraremos antimicrobianos para los que no existen drogasrelacionadas. Cloranfenicol (fenicoles), clindamicina (lincosamidas), cido fuscdico

(esferoidales), mupirocina (cido pseudomnicos), y espectinomicina (aminociclitoles), loscuales inhiben la sntesis de protenas; y rifampicina (ansamicinas) y fidaxomicina(macrocclicos) que inhiben la sntesis de RNA. La nitrofurantoina (nitrofuranos) actainhibiendo varios pasos en la sntesis y ensamblado de las protenas a nivel ribososmal.Slo es til para infecciones en el tracto urinario. Fosfomicina (fosfomicinas), aprobadapor la FDA slo para el tratamiento de infecciones urinarias, inhibe una enzima necesaria

para la sntesis de pared celular.


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6.3. Gua para la seleccin de antimicrobianos

Para obtener resultados relevantes y prcticos el nmero de antibiticos ensayados en laspruebas de sensibilidad debe ser limitado. En las tablas 1A, 1B y 1C del documento M100se puede encontrar la lista bsica de drogas a ensayar en un laboratorio clnico. Las tablasestn divididas en columnas de acuerdo a microorganismos especficos o grupos debacterias. En esa tabla se indican las drogas segn el orden de prioridad para ayudar al

microbilogo a optimizar la batera de antibiticos a ensayar en el antibiograma. Cada casillade la tabla contiene drogas con actividad comparable. Slo es necesario incluir una de ellasen el antibiograma porque, en general, las interpretaciones son las mismas y sus eficaciasclnicas comparables. La letra o designa grupos de drogas que tiene espectro de actividade interpretacin casi idnticos. En estos casos tanto la sensibilidad como la resistencia suele

ser cruzada. Esto quiere decir que la combinacin de errores major y very major es menorde 3% y los errores minor son menores del 10%, en base a una gran poblacin ensayada.Para designar la letra o, se probaron al menos 100 cepas resistentes a los antibiticos enconsideracin y se obtuvo un resultado de resistencia por lo menos para el 95 % de lascepas. La letra o tambin se usa para drogas comparables cuando stas se ensayan paramicroorganismos para los cuales slo hay categora de interpretacin sensible (Ej.:cefotaxima o ceftriaxona con H. influenzae). Por lo tanto el, resultado obtenido para unaagente se puede usar para predecir el del otro. Por ejemplo, un aislamiento de la familia

Enterobacteriaceae no productor de BLEE, sensible a cefotaxima, se puede considerarsensible a ceftriaxona. Cuando los antibiticos no estn conectados por la letra o, no sepuede predecir el resultado de cada uno de ellos en base a otros ensayados ya sea por quese hallaron discrepancias o por informacin insuficiente.

6.4. Recomendaciones para el ensayo e informe selectivo y de rutina

Como se ve en la Tabla 1A, 1B y 1C los agentes del Grupo A se consideran apropiados paraensayar e informar en las pruebas de rutina para cada grupo de microorganismos

El Grupo B comprende agentes que son de importancia clnica particularmente parainfecciones hospitalarias y se debern incluir en el panel primario. Sin embargo, ellos deben

ser informados selectivamente en el caso en que el microorganismo en estudio searesistente a los agentes de la misma familia de Grupo A. Otro ejemplo en donde debeinformarse la sensibilidad a los agentes de este grupo, sera cuando el foco de infeccin lojustifique (por ejemplo: trimetoprima-sulfametoxazol para aislamientos del tracto urinario ouna cefalosporina de tercera generacin para bacilos gram negativos entricos aislados delquido cefalorraqudeo). Tambin debern informarse en caso de infecciones polimicrobianas,infecciones que involucren mltiples sitios del organismo, alergia, intolerancia o falla derespuesta a los antibiticos del Grupo A o como ayuda epidemiolgica en el control deinfecciones.

El Grupo C est compuesto por agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios quedeben ser probados en el caso de instituciones donde se aslen cepas endmicas oepidmicas resistentes a varias de las drogas primarias (especialmente en la misma familia,por ejemplo -lactmicos o aminoglucsidos), para el tratamiento de pacientes alrgicos alas drogas primarias, as como tambin para el tratamiento de microorganismos inusuales(por ejemplo: cloranfenicol para aislamientos extraintestinales de Salmonella spp.) o comoayuda epidemiolgica en el control de infecciones.

El Grupo U (Orina) enumera ciertos antimicrobianos, cuyo uso se limita a las infeccionesdel tracto urinario (p. Ej. nitrofurantoina y ciertas quinolonas). Estos agentes no se debeninformar en caso de infecciones que se encuentren en otra localizacin que no sea la va


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urinaria. En este grupo se pueden incluir otras drogas con indicaciones ms amplias paraalgunos patgenos urinarios especficos (Ej.: P. aeruginosa y ofloxacina)

El Grupo O (Otros) incluyen antibiticos que poseen indicacin clnica para un grupo deorganismos determinado, pero en general no son candidatos para las pruebas de rutina einforme en los Estados Unidos.

El Grupo Inv. (Investigacin) incluye agentes que estn bajo investigacin y an no han sidoaprobados por la FDA para su uso en USA.

Informe Selectivo: Cada laboratorio debera elegir los agentes listados en las Tablas 1A, 1By 1C para el ensayo e informe de rutina (Grupo A) y aquellos que podra informar solo

selectivamente (Grupo B), en consulta con la farmacia, los comits de teraputica y controlde infecciones y el plantel mdico del hospital. El informe selectivo debera ayudar a mejorarla relevancia clnica del informe y minimizar la seleccin de cepas nosocomialesmultirresistentes por uso excesivo de antibiticos de amplio espectro. Los resultados de losantibiticos del Grupo B que no se informan de rutina deberan estar disponibles slo apedido, o para algn microorganismo especial. Las resistencias inusuales siempre debeninformarse pero slo si fueron confirmadas (Ej.; resistencia a agentes del grupo B consensibilidad a los del grupo A). Adicionalmente, cada laboratorio debera desarrollar un

protocolo dirigido a aquellos aislamientos que presenten resistencia a todos losantmicrobianos probados de rutina. Este protocolo debera incluir las opciones de probarotros antimicrobianos en el mismo laboratorio o enviar el aislamiento a un laboratorio dereferencia.

7.0 AGENTES ANTIMICROBIANOS

7.1 Fuentes

Los antibiticos estndar o de referencia se pueden obtener directamente del laboratorioproductor o de otras fuentes comerciales. No se debe usar las preparaciones paraaplicacin parenteral. Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer el lote, la potencia(generalmente expresada en microgramos [g] Unidades Internacionales [UI] pormiligramo de polvo) y la fecha de vencimiento de los antimicrobianos utilizados. Elalmacenamiento de la droga debe hacerse segn las recomendaciones del laboratorioproductor, o a una temperatura igual o menor a -20C en un desecador (preferiblemente

con vaco) provisto de algn material desecante como gel de slice o cloruro de calcio.Cuando se saca el desecador del freezer se debe esperar que tome temperatura ambienteantes de abrirlo para evitar que el agua de condensacin humedezca las drogas.

7.2 Pesada de los antibiticos

A todos los agentes antimicrobianos se les realiza el ensayo de actividad. La actividad de unadeterminada droga puede variar entre los distintos productores y entre los distintos lotesdel mismo productor. Por esto es muy importante conocer el dato de potencia de cadafrasco de antimicrobiano que va a ser utilizado para realizar pruebas de sensibilidad pordilucin y en base a dicho dato, hacer los clculos para la preparacin de las soluciones autilizar. El valor de la potencia suministrado por el fabricante debera incluir la pureza(generalmente ensayada por HPLC), contenido de agua (Ej.: mediante el anlisis de KarlFischer o por prdida de peso durante el secado) y la fraccin sal/ion (si el compuesto essuministrado como una sal en lugar de un cido o base libre). La potencia puede expresarse


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como porcentaje, o en g/mg (w/w). En algunos casos, el fabricante extiende un certificadode anlisis con valores para cada uno de estos componentes con los cuales se puedecalcular el valor de la potencia a partir de la pureza por HPLC, contenido de agua, y cuandosea aplicable, la fraccin activa de aquellas drogas provistas como sales (Ej.: hidrocloruro).Sin embargo, si se desconoce algunos de estos valores o no figuran claramente en elcertificado de anlisis, se deben confirmar con el fabricante.

Ejemplo: Meropenem trihidratoCertificado de anlisis:

Ensayo de pureza (por HPLC):99.8%

Contenido de agua (anlisis de Karl Fischer): 12.1% (w/w).

Fraccin activa: 100% (provisto como cido libre y no como sal)

Clculo de la Potencia de acuerdo a los datos de arriba:

Potencia = (Ensayo de pureza) x (Fraccin activa) x (1- Contenido de Agua)

Potencia = (998) x (1.0) x (1- 0.121)

Potencia = 877 g/mg o 87.7 %

Para determinar la cantidad de polvo antimicrobiano (ATB) o solvente necesarios parapreparar una solucin estndar (SE) se puede utilizar alguna de las siguientes frmulas:

Frmula 1

Pesada de ATB (mg) = Volumen de SE (ml) x Concentracin de SE (g/ml)Potencia de ATB (g/mg)

Frmula 2

Volumen de SE (ml) = Pesada de ATB (mg) x Potencia de ATB (g/mg)Concentracin de SE (g/ml)

La pesada del antibitico a ensayar se debe hacer en balanza analtica bien calibrada, conuna precisin igual o superior al dcimo de miligramo, y se debe evitar pesar cantidades muypequeas de droga ya que estas acarrean alto error (si es posible se recomienda pesadassuperiores a los 100 mg). Es posible que al realizar la pesada se obtenga un exceso de la

droga, en tal caso se debe aplicar la frmula 2 para conocer el volumen exacto de solvente aagregar para obtener la concentracin deseada.

Ej.: Para preparar aproximadamente 100 ml de una solucin madre de 1280 g/ml deagente antimicrobiano con una potencia de 750 g/mg, deben pesarse entre 170 y 200 mgde droga. Si el peso final del antibitico fue 182,6 mg, el volumen de solvente necesario

para diluir el mismo se calcula de la siguiente manera:

182,6 mg x 750 g/mgVolumen (ml) = (Peso) (Potencia) = 107.0 ml

1280 g/ml(Concentracin deseada)

En este caso los 182,6 mg de droga pesada se deben disolver en 107 ml de diluyente.


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7.3 Preparacin de las soluciones

Se deben preparar soluciones madres de por lo menos 1000 g/ml (por Ej.: 1280 g/ml) de una concentracin 10 veces mayor que la ms alta del rango establecido (por Ej.: paraun rango establecido de 2 a 512 g/ml se podra preparar una solucin madre de 5120g/ml), y conservarse en alcuotas a - 60C por 6 meses ms, salvo indicacin expresa dela bibliografa. En algunos casos el lmite de solubilidad del antimicrobiano slo permite

preparar soluciones de concentraciones bajas.

Para las drogas que no son solubles en agua, se debe proceder de la siguiente manera:

Use solamente la cantidad mnima del solvente (metanol, acetona, cloroformo,

etc.) necesaria para solubilizar la droga.

Diluya hasta alcanzar el volumen final calculado, con agua estril o con el bufferestril adecuado como se indica en M-100 Tabla 5A.

Si se van a utilizar solventes potencialmente txicos, asegrese de tomar todos losrecaudos necesarios para el manejo que indica el fabricante (ver M-100 Tabla 5A)

La contaminacin de las soluciones es extremadamente rara, por lo tanto pueden utilizarsesoluciones no esterilizadas. Si se desea, sin embargo, las soluciones pueden ser esterilizadaspor filtracin a travs de membranas; se debe tener la precaucin de no utilizar materialesque adsorban ATB. (Como por ejemplo: papel, asbestos o filtros de vidrio sinterizado).Se pueden distribuir pequeos volmenes de las soluciones madres estriles, en viales devidrio, polipropileno, poliestireno o polietileno, y conservar a una temperatura de -60C omenor, pero nunca se deben conservar soluciones de antimicrobianos a una temperaturasuperior a -20C).De esta manera las soluciones de la mayora de antibiticos pueden

conservarse a -60C o menos durante 6 meses o ms, sin que se observen prdidasimportantes de actividad. Cada vez que se descongela un vial, se debe utilizar en el da y elsobrante del mismo debe descartarse, nunca se debe volver a congelar una solucin deantibitico. Si existe deterioro de la actividad en las soluciones almacenadas, se verreflejado en los resultados de las cepas de control de calidad que deben acompaan a cada

determinacin.

7.4 Nmero de concentraciones probadas

Las concentraciones a ensayar para un determinado antibitico, en general, deberandeterminarse de acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en la Tabla M-100 (2A a2J), pero el nmero de concentraciones deber ser elegido por quien realiza la prueba. Sinembargo, se recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya elrango de CIM de al menos una cepa patrn de control de calidad. En algunos casosespeciales puede ser necesario ensayar concentraciones inusuales (por Ej. para evaluar elefecto sinrgico entre aminoglucsidos y penicilinas o glicopptidos frente a enterococospuede ser necesario ensayar altas concentraciones de gentamicina y estreptomicina).


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8.0 PREPARACION DEL INOCULO PARA LAS PRUEBAS DE DILUCION

8.1 Turbidez del estndar para la preparacin del inculo

Ver M2 A11, 8.1. (Prueba de difusin por discos).

8.2 Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas.Ver M2 A11, 8.2.1. (Prueba de difusin por discos).

8.3 Mtodo de desarrollo previo

Ver M2 A11, 8.2.2. (Prueba de difusin por discos).

9.0 PROCEDIMIENTO PARA LA DILUCION EN AGAR

La dilucin en agar es un mtodo bien establecido para la determinacin de la sensibilidad a losantimicrobianos (1,2). El agente antimicrobiano se incorpora dentro del medio con agar, demanera tal que cada placa contenga una concentracin de antibitico diferente. Los inculos de

los distintos microorganismos se pueden aplicar rpida y simultneamente sobre la superficiedel agar utilizando replicadores. (3) La mayora de los replicadores existentes transfieren de 32a 36 inculos por placa.

9.1 Materiales y reactivos

9.1.1 Agar Mueller Hinton

El agar M. Hinton demostr ser, de todos los medios disponibles, el mejor para laspruebas de sensibilidad de rutina de bacterias no fastidiosas, por las siguientes razones:

Muestra buena reproducibilidad de los resultados de sensibilidad entre distintos lotes.

Tiene baja cantidad de inhibidores para sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas.

Permite buen crecimiento de la mayora de los patgenos.

Se tiene gran cantidad de datos y experiencia sobre pruebas de sensibilidad realizadascon este medio.

Aunque el agar M. Hinton es un medio confiable para realizar las pruebas de sensibilidad,

los resultados obtenidos con algunos lotes, en ocasiones, pueden variarsignificativamente. Slo se deben utilizar lotes de agar M. Hinton evaluados de acuerdo aldocumento M6, Protocolos para la evaluacin del agar Mueller Hinton deshidratado delCLSI, cuyos resultados estn dentro de los lmites que se describen en dicho documento.

Los lotes nuevos de medio deben ser controlados antes de ser usados en clnica (verseccin 16).

Ver apndice B para la preparacin de MHA.

Examine el pH del nuevo lote como se indica en el apndice B


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No es necesario adicionar cationes al agar M. Hinton. Para detectar meticilinoresistencia en estafilococos debe agregarse, al agar, NaCl 2 % p/v. Cuando seensaya fosfomicina se deber adicionar 25 g/mL de glucosa-6-fosfato.

No agregar calcio o magnesio al MHA.

9.1.2 Cepas con dificultades de crecimientoLos suplementos requeridos por estos microorganismos se describen mas adelante en estedocumento.

Agar MH con 5 % de sangre de carnero fresca.

Agar MH con 5 % de sangre de carnero no fresca (> 2 semanas) para H. pylori.

HTM: HaemophilusTest Medium.

Agar GC + 1 % de suplemento de crecimiento.

9.1.3 Replicadores

La mayora de los replicadores disponibles transfieren de 32 a 36 inculos por placa (2).Los replicadores con pernos de 3 mm de dimetro, siembran aproximadamente 2 L(rango 1 a 3 L) sobre la superficie del agar. Aquellos que tienen pernos de 1 mmsembrarn diez veces menos, aproximadamente 0.1 a 0.2 L (5).

9.2 Preparacin de las placas de agar

Prepare soluciones intermedias del agente antimicrobianos (10x) haciendo dilucionessucesivas 1:2, 1:4, y 1:8 usando el mtodo descrito en M100 Tabla 6 o mediantediluciones al medio. Luego adicione una parte de la solucin de antimicrobiano 10X en nuevepartes de agar fundido

9.2.1 Procedimiento

Agregue la solucin de antibitico apropiada para cada dilucin, en el agar fundido y

enfriado a 45 - 50C en bao de agua. Agite la mezcla agar-antibitico y colquela en la placa de petri hasta alcanzar unaprofundidad de 3-4 mm.

La mezcla agar-antibitico debe ser colocada rpidamente en las placas para evitarla solidificacin total o parcial de la misma dentro del recipiente de mezclado, evitando laformacin de burbujas.

La placas se dejan solidificar a temperatura ambiente y si no se usan de inmediatose pueden guardar en bolsas plsticas selladas a 2 - 8C por 5 das para ensayos dereferencia o por mayor tiempo para uso de rutina. En un estudio se comprob que lasplacas conteniendo cefaclor se deben preparar 48 hs. antes de su utilizacin debido a larpida degradacin de la droga; en cambio las placas conteniendo cefamandolpermanecen estables por un tiempo superior al recomendado de 5 das (6). Otrosantimicrobianos particularmente lbiles como el cefaclor son: ampicilina, meticilina,imipenem y cido clavulnico.

NOTA: No se puede asegurar que todos los antibiticos mantengan su actividad enestas condiciones, por lo tanto cada laboratorio debera evaluar la estabilidad de lasplacas mediante la prueba de cepas patrones de control de calidad y establecer su propiocriterio.Esta informacin en algunas ocasiones es provista por el fabricante.


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Antes de ser utilizadas, las placas deben ser equilibradas a temperatura ambientey no deben tener gotas de agua sobre la superficie. Si las placas estuvieran mojadas sedeben colocar abiertas, por aproximadamente 30 minutos, en una incubadora o en ungabinete de flujo laminar para eliminar el exceso de agua.

9.2.3 Frecuencia de los controles

Aunque en estas normas se recomienda el control de calidad semanal de las placas conantibitico; algunas drogas necesitan controlarse con mayor frecuencia debido a que sedegradan rpidamente. Se presentan ejemplos de este tipo de drogas en la seccin9.2.2. Para ms detalles ver seccin 16

9.2.4 Placas de control de crecimiento

Se debe usar placas con el medio base (con o sin suplementos tal como se indica en laseccin 9.1.1) sin antibitico como control de crecimiento.

9.3 Inculo

9.3.1 Preparacin del inculo

El inculo estandarizado para el mtodo de dilucin en agar, se puede prepararpermitiendo el crecimiento del microorganismo hasta la turbidez 0,5 de la escala de

McFarland o bien resuspendiendo colonias directamente hasta alcanzar dicha turbidez(Ver seccin 8). La preparacin del inculo inicial y la dilucin final del mismo, puede variarpara algunos microorganismos como N. meningitidis (ver Seccin 11 y Apndice C).

9.3.2 Dilucin de la suspensin bacteriana

El cultivo ajustado a la turbidez equivalente al patrn 0,5 de McFarland contiene, para lamayora de las especies, aproximadamente 1-2 108 UFC/ml. El inculo final requeridopara la prueba de dilucin en agar es de 104unidades formadoras de colonias (UFC) porspot de 5 8 mm de dimetro. Por lo tanto cuando se utilizan replicadores con pernosde 3 mm que siembran 2 l, se debe diluir la suspensin bacteriana, ajustada al 0,5 de

McFarland, 1/10 en caldo estril o solucin fisiolgica obtenindose de esta manera unaconcentracin de 107 UFC/ml. El inculo final sobre el agar ser de alrededor de 104

UFC por spot. Si el replicador tiene pernos de 1 mm que inoculan 0.1 a 0.2 l, no senecesita hacer una dilucin de la suspensin inicial. Una vez ajustado, el inculo debeutilizarse dentro de los 15 min

9.4 Inoculacin de las placas de agar

Los tubos que contienen la suspensin bacteriana ajustada y diluida (107 UFC/ml) se

deben colocar en orden en una gradilla. Luego se debe distribuir una alcuota de cada tubo,bien homogeneizado, en el correspondiente pocillo de la policubeta del replicador.

Se debe marcar cada placa de agar para conocer la ubicacin de los inculos en lamisma.

Aplicar una alcuota de 1 a 2 l de cada inculo sobre la superficie del agar, por mediodel replicador, ansa calibrada o pipeta. De debe realizar la dilucin adecuada del inculo de talforma de obtener una concentracin de 104 UFC/ spot (ver Seccin 9.3.2)

Para comenzar se debe inocular una placa control de agar sin antibitico (control deviabilidad) y luego se inoculan las que contienen las distintas concentraciones del antibiticocomenzando por la de menor concentracin. Se debe inocular una segunda placa control deviabilidad al finalizar la serie, para confirmar que no hubo contaminacin un significativoefecto "carry over" de antibitico durante el procedimiento.


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Se debe reaislar una muestra de cada inculo sobre una placa de medio de cultivoslido, e incubar "over night" para detectar mezcla de cultivos y para contar, al dasiguiente, con un cultivo fresco en caso que la prueba se deba repetir.

9.5 Incubacin de las placas

Las placas inoculadas se deben mantener a temperatura ambiente hasta que el agar

absorba el lquido que acompaa al inculo pero no ms de 30 minutos. Luego se debenincubar invertidas a 35 2C por el trmino 16 - 20 hs. (ver Seccin 11 y 12 y Apndice Cpara las excepciones).

Cuando se prueban microorganismos sin exigencias nutricionales se deben incubar las

placas sin atmsfera de CO2, ya que este procedimiento puede alterar el pH de la superficiedel agar. A pesar de esto N.meningitidis, N. gonorrhoeae y Streptococcus spp. se debenincubar en una atmsfera que contenga 5 % de CO2 (ver Seccin 11, Apndice C, y M-100 Tablas 2A a 2I)

9.6 Determinacin del punto final

Para determinar el punto final, las placas se deben colocar sobre una superficie

oscura y opaca. La CIM se registrar como el valor de la menor dilucin que inhibecompletamente el desarrollo bacteriano, no se debe considerar el desarrollo de una simplecolonia o una tenue pelcula causada por el depsito del inculo. Algunos antagonistas delmedio de cultivo pueden permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se ensayatrimetoprima o sulfonamidas. El punto final en estos casos corresponder a la concentracinen la que haya ms del 80 % de reduccin del crecimiento comparando con el control.

Si persisten 2 o ms colonias en concentraciones superiores al aparente punto final, o

si se encuentra desarrollo a altas concentraciones y no a bajas, se debe controlar la purezadel cultivo y probablemente deba repetirse la prueba.

10.0 METODO DE DILUCION EN CALDO (MACRO Y MICRODILUCION)

10.1 Caldo Mueller Hinton

El caldo M. Hinton es el medio recomendado para las pruebas de sensibilidad de patgenosaerbicos o facultativos de crecimiento rpido (1). La reproducibilidad de los resultados delas pruebas de sensibilidad utilizando diferentes lotes de este medio es buena; tiene bajocontenido de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina y permite elcrecimiento de la mayora de los grmenes patgenos. Adems se han acumulado un grannmero de resultados y experiencias utilizando este medio para las pruebas de sensibilidad.

(1) El medio de eleccin para la determinacin de rutina por mtodo de dilucin es el CAMHBLas instrucciones para su preparacin se encuentran en el Apndice B

(2) Controle el pH de cada lote de MHB (Apndice B).

(3) Evale el desempeo del mtodo incorporando un panel de microorganismos QC(Seccin 16.3). Si un Nuevo lote de MHB no alcanza las CIM esperadas para losorganismos QC, se recomienda investigar los contenidos de cationes junto con otrasvariables y componentes del ensayo

(4) Para determinar si el medio es adecuado para probar la sensibilidad a sulfonamidas ytrimetoprima, se debe realizar la CIM de estas drogas frente a Enterococcus faecalis


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ATCC 29212. El punto final debe ser fcil de leer (> 80 % de reduccin en el desarrollocomparado con el control). El medio se considera adecuado si el valor de la CIM es 2 mm de dimetro oturbidez neta.

Cuando se evala la sensibilidad a trimetoprima y sulfonamidas se puede observarun leve crecimiento como consecuencia de sustancias antagonistas presentes en elmedio. En estos casos el punto final se define como la concentracin en la cual hay unareduccin en el crecimiento > 80 % comparada con el control del crecimiento.

Cuando en una prueba de microdilucin se obtiene un pocillo salteado, se debe leerla CIM ms alta Si apareciera ms de un pocillo salteado con alguna droga, esta no sedebera informar.

Para bacilos gram (-) las CIMs obtenidas por el micromtodo tienden a ser las

mismas una dilucin menor a las obtenidas por el macromtodo (8).

11.0 MICROORGANISMOS CON EXIGENCIAS NUTRICIONALES ESPECIALES

El medio MH descripto anteriormente para patgenos aerbicos de rpido crecimiento, no esadecuado para las pruebas de sensibilidad de microorganismos con exigencias nutricionalesespeciales. Si se va a realizar la CIM de alguno de estos microorganismos, se deben adecuar

tanto el medio de cultivo, como las cepas de control de calidad y los criterios de interpretacinutilizados.

Se describen a continuacin pruebas de dilucin para los siguientes organismos:

H. influenzae y H. parainfluenzae, usando HTM (solo dilucin en caldo);

N. gonorrhoeae, usando GC agar base medo;

Streptococci, usando CAMHB suplementado con sangre lisada de caballo (LHB); y


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N. meningitidis, usando CAMHB suplementado con sangre lisada de caballo (LHB) oMHA con sangre ovina.

Detalles de los requisitos exigidos para estas pruebas se resumen en el Apndice C.

Algunas bacterias fastidiosas diferentes de las anteriormente mencionadas pueden sersometidas a prueba por una dilucin o de difusin en disco, mtodo que se describe en el

documento CLSI M45. Mtodos para las bacterias anaerobias se describen en el documentoCLSI M11.

11.1 Haemophilus influenzae y H.parainfluenzae

La CIM para Haemophilus influenzae y H.parainfluenzae usando Haemophilus TestMdium (HTM) slo se desarroll por el mtodo de dilucin en caldo. No se estudi aun elmtodo de dilucin en agar HTM. Cada vez que se nombra en el texto Haemophilusspp, serefiere slo a las dos especies antes mencionadas. Si son probados sulfonamidas otrimetoprima, aadir aspticamente 0,2 UI de timidina fosforilasa al medio. El pH debe ser

7.2 a 7.4.

Se recomienda el uso de Haemophilus influenzaeATCC 10211 para controlar la calidaddel HTM. Los fabricantes de HTM, sobretodo deberan usar Haemophilus influenzaeATCC 10211 como cepa de control de calidad

11.1.1 Procedimiento

Siga el procedimiento de ensayo en la seccin 10 con las siguientes excepciones:

Para ensayar Haemophilus spp. se debe realizar una suspensin a partir decolonias aisladas de cultivo en agar chocolate placa (preferentemente 20 - a las 24 horasdel da). Dicha suspensin se prepara en caldo M. Hinton o solucin salina al 0.9 % apartir de colonias obtenidas en una placa de agar chocolate incubada durante 20-24

horas. Ajuste a una turbidez equivalente al estndar 0.5 Mc Farland (1 2 x 108UFC/ml). Debe tenerse cuidado de no preparar inculos densos que puedan llevar aresultados falsos resistentes con antibiticos lactmicos, especialmente cuando setrabaja con cepas de H. influenzae productoras de betalactamasa. La concentracinprecisa de microorganismos en la suspensin inicial depender de las condiciones deincubacin de la placa de agar chocolate, especialmente del tiempo de incubacin. Porejemplo una suspensin de H. influenzae equivalente al 0.5 Mc Farland preparada a partirde una placa de agar chocolate incubada 16-18 hs contendr aproximadamente 3 a 4 x108 UFC/ml; mientras que si la misma se prepara a partir de una placa de 24 hs deincubacin, contendr menos organismos viables (Ej.: 1 a 2 x 108 UFC/ml. Cuando seensaya Haemophilusspp, inculos mayores al 0.5 Mc Farland pueden dar resultados deCIMs ms altos para ciertas cefalosporinas, particularmente con cepas productoras debetalactamasa. Inocule las microplacas dentro de los 15 min. de haber ajustado elinculo.

Incubar las microplacas a 35 C 2 C en atmsfera de aire durante 20 a 24 hs.antes de leer la CIM.


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11.1.2 Interpretacin de la CIM

Los antibiticos que se sugiere ensayar de rutina para Haemophilus spp estnenumerados en Tabla 1 A del M100.Los criterios de interpretacin de la CIM estn enumerados en la Tabla 2E del M100.

11.2 Neisseria gonorrhoeae

La determinacin de la CIM para Neisseria gonorrhoeae ha sido desarrollada nicamente porel mtodo de dilucin en agar usando el agar base GC con el agregado de 1 % de unsuplemento de composicin definida (Apndice B y M100-Tabla 2F.).



Resuspenda el microorganismo en caldo M. Hinton o sol. salina al 0.9 % a partirde una placa de agar chocolate overnight y ajuste a turbidez equivalente al 0.5 Mc

Farland. Inocule las microplacas dentro de los 15 min. de ajustado el inculo.

Incubar a 36 1 (No exceder los 37C) en atmsfera de 5 % de CO2 durante20 a 24 horas.

11.2.2 Interpretacin

Los antibiticos que se sugiere ensayar de rutina para N. gonorrhoeaeestn enumeradosen Tabla 1B del M100. Los criterios de interpretacin de la CIM estn enumerados enla Tabla 2F del M100.

11.3 Neisseria meningitidis

Precaucin: Realizar todas las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos de N.meningitidis en un gabinete de seguridad biolgica (BSC). Manipulacin de las suspensionesde N. meningitidis fuera un BSC se asocia con un alto riesgo de contraer la enfermedadmeningoccica. La enfermedad meningoccica adquirida en el Laboratorio est asociada conuna tasa de letalidad del 50%. La exposicin a los aerosoles o gotitas de N. meningitidisesla va ms probable de adquirir la infeccin en el laboratorio. Se debe realizar una proteccinrigurosa de las gotitas o aerosoles cuando se realizan procedimientos microbiolgicos

(incluyendo las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos) en todos los aislados de N.meningitidis, especialmente los procedentes de sitios estriles (sangre o LCR).Si no se dispone de cabina, se debe minimizar la manipulacin de los aislamientos,limitndose a la coloracin de gram e identificacin de serogrupo. Se debe usar una solucin

fenolizada, guardapolvo, guantes y mscara protectora de salpicaduras. Cuando existe altoriesgo de generar aerosoles o se trabaja con altas concentraciones de material infeccioso,se debe trabajar en un BSL-3. Si no se dispone de un Laboratorio de Bioseguridad BSL-2 oBSL-3 se deben derivar los aislamientos a un Laboratorio de Salud Pblica o de Referenciaque cuente al menos con un Laboratorio de Bioseguridad BSL-2.Se debe considerar la vacunacin del personal de laboratorio de acuerdo a lasrecomendaciones del Comit Asesor de Inmunizacin del CDC(http://www.cdc.gov/vaccines/recs/acip). La vacunacin disminuye, pero no elimina el riesgo


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de infeccin porque no es el 100% efectiva y no provee proteccin contra el serogrupo B,causa frecuente de infecciones adquiridas en el laboratorio.

Se validaron la microdilucin en caldo y la dilucin en agar para proveer mtodos para ladeteccin de posibles mecanismos de resistencia emergentes. Hasta la fecha se hallresistencia principalmente a viejos agentes antimicrobianos usados para el tratamiento(penicilina o ampicilina) o a agentes usados par profilaxis de los contactos. Como no se

detect resistencia a ceftriaxona o cefotaxima los cuales son antibiticos que se usan entratamiento de la enfermedad invasiva, no es necesario ensayarlos de rutina en loslaboratorios clnicos. Meningococo puede causar infeccin adquirida en el laboratorio.

Para el mtodo de microdilucin en caldo se utiliza caldo Mueller-Hinton ajustado con

cationes y suplementado con 2-5% de sangre lisada de caballo y para el de dilucin en agar,agar Mueller-Hinton suplementado con 5% de sangre de carnero.


Siga el procedimiento de ensayo en las secciones 9 o 10 con las siguientes excepciones:

Resuspenda el microorganismo en sol. salina al 0.9 % a partir de una placa deagar chocolate overnight (20 a 24 hs), incubada a 35 2C en 5 CO 2 y ajuste aturbidez equivalente al 0.5 Mc Farland. Inocule las microplacas o placas dentro de los 15min. de ajustado el inculo.

Incubar la microplacas o placas a 35 2C en 5 % CO 2 durante 20 a 24 h

11.3.2 Interpretacin de resultados

En la tabla 2I del M 100, se encuentra el criterio de interpretacin y las cepas decontrol de calidad.

11.4Streptococcus pneumoniae y Otros Streptococcus spp

La CIM de las distintas especies de Streptococcusse realiza utilizando caldo Mueller Hintonsuplementado con 2,5 a 5 % de sangre lisada de caballo. El mtodo de dilucin en agar noha sido validado por CLSI.



Resuspenda el microorganismo en caldo M. Hinton o sol. salina al 0.9 % a partirde una placa de agar sangre de carnero overnight (18 a 20 hs) y ajuste a turbidezequivalente al 0.5 Mc Farland. Inocule las pruebas dentro de los 15 min. de ajustado elinculo.

Las microplacas se incuban en atmsfera de aire a 35 2C durante 20 a 24 hsantes de leer la CIM.


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La resistencia inducible a clidamicina, se puede detectar siguiendo el mtododescrito en la Seccin 13

El subcomit no ha realizado ni revisado estudios utilizando el mtodo de dilucin en agar.Si se va a utilizar la dilucin en agar, siga los procedimientos generales de la seccin 9con las excepciones enumeradas arriba e incube en 5 % CO2 si fuese necesario para elcrecimiento.

11.4.2 Interpretacin

Los antibiticos que se sugiere ensayar de rutina para S. pneumoniae y otros

estreptococos estn enumerados en Tabla 1B del M-100. Los criterios especficos deinterpretacin de la CIM estn enumerados en las Tablas 2G y 2H-1 y 2H-2,respectivamente.

12.0 MICROORGANISMOS PROBLEMA

12.1 Staphylococcus spp.

12.1.1 Resistencia a penicilina y -lactamasa

La Penicilina prcticamente no es opcin de tratamiento para infecciones porestafilococos debido a que la mayora de estos son resistentes a penicilina. Las cepasresistentes a penicilina producen -lactamasa y se debera ensayar penicilina parapredecir la sensibilidad a todas las penicilinas labiles a -lactamasas, tales comoampicilina, amoxicilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina.

Algunos aislamientos de Staphylococcusproductores de -lactamasa resultan sensibles apenicilina en las pruebas de sensibilidad. Debido a que esta -lactamasa es inducible,existe un riesgo si se utiliza penicilina para estas cepas. Por esta razn, cuando unaislamiento de Staphylococcusspp presenta CIM a/para penicilina 0.12 g/ml o zona deinhibicin 29 mm de debe realizar una prueba de -lactamasa inducida, antes deinformarlo sensible a penicilina. Se han descripto varias pruebas para deteccin de -

lactamasa, entre estas, las pruebas de deteccin en base a nitrocefin o la evaluacin delborde del halo de inhibicin de penicilina en el mtodo de difusin con discos. Para esteltimo mtodo un borde de halo difuso indica un resultado negativo, mientras que unborde de halo definido indica un resultado positivo para la produccin de -lactamasa. Eltest del borde del halo de inhibicin de penicilina result ms sensible que el nitrocefinpara la deteccin de -lactamasa en S. aureus. Si solo va utilizarse un test para ladeteccin de -lactamasa en S. aureus, se recomienda utilizar el test del borde del halode inhibicin de penicilina. Otros laboratorios pueden optar por utilizar primero elnitrocefin, y si este da positivo se informa como -lactamasa positivo o penicilinoresistente. Si el nitrocefin es negativo se recomienda la realizacin del test del borde delhalo de inhibicin de penicilina antes de informar la sensibilidad a penicilina (en los casosen donde la penicilina pueda ser utilizada como terapia para S. aureus). Paraestafilococos coagulasa negativos, incluyendo S. lugdunensis, slo se recomienda elnitrocefin. Para ms recomendaciones sobre deteccin de -lactamas en Staphylococcusspp ver la Tabla 2C del Documento M100.


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12.1.2 Resistencia a meticilina u oxacilina

La resistencia a las penicilinas antiestafilococcicas resistentes a las -lactamasas se ha

denominado histricamente meticilino resistencia. Es por eso que las siglas MRSA(methicillin-resistant S. aureus) o MRS (Methicillin-resistant staphylococci) se siguenutilizando aunque la meticilina ya no sea la droga de eleccin para la determinacin de la

sensibilidad o para el tratamiento. En este documento, cuando nos refiramos a laresistencia a estas drogas, vamos a utilizar distintos trminos, por Ej. MRS, meticilinoresistencia u oxacilino resistencia.

La mayor parte de la resistencia a oxacilina en estafilococo es mediada por el gen mecA,el cual codifica para una protena ligadora de penicilina (PBP) adicional, PBP2a.Se puedeexpresar homognea o heterogneamente. La resistencia homognea es fcil dedetectar con los mtodos estndares, mientras que la heterognea podra ser mas difcilde detectar con algunos mtodos, porque slo una fraccin de la poblacin (Ej.:1:100000 clulas) expresa el fenotipo de resistencia. La resistencia a otra clase deantimicrobianos era un indicador de resistencia a oxacilina. Sin embargo algunos MRSA,tales como los hallados en infecciones asociadas a la comunidad, no presentan mltipleresistencia.

Las cepas de Staphylococcus lugdunensis mecA negativas, sensibles a oxacilina, tienenCIMs de oxacilina en el rango de 0.25 a 1 g/ml, mientras que las cepas mecA positivassuelen presentar CIMs 4 g/ml. Por lo tanto la resistencia mediada por el gen mecA

en S.lugdunensis, se detecta con mayor exactitud usando el criterio de interpretacinutilizado para S. aureus. Esta especie est agrupada conS. aureus en la Tabla 2C y seincluye en esta seccin con S. aureus. Los criterios de interpretacin de oxacilina ycefoxitina para SCN excluyen al S. lugdunensis.

12.1.2.1 Mtodos

Los mtodos basados en oxacilina o en cefoxitina pueden ser utilizados para la deteccin

de resistencia mediada por mecA en estafilococos. El mtodos de difusin por discoutilizando oxacilina de no debe utilizarse para S. lugdunensis y otros estafilococoscoagulasa negativos. Los mtodos basados en cefoxitina, solo predicen la presencia deresistencia mediada por mecA. Se prefiere su uso ya que son mejores predictores de lapresencia de mecA que los mtodos basados oxacilina, incluido el agar screeningutilizando placa de oxacilina-salada. Debido a la rara ocurrencia de mecanismos deresistencia a oxacilina distintos de mecA, se pueden encontrar algunos S. aureus que son

resistentes a oxacilina pero mecA negativo. Estos aislados cursan con sensibilidad acefoxitina.

Todos los mtodos requieren el uso directo de la colonia suspensin mtodo para lapreparacin del inculo (ver seccin 8.2).

Incube las pruebas para detectar la MRS las 24 horas a 35 2 C cuando seutiliza oxacilina antes informarlas como sensibles (temperaturas superiores a 35 C nopuede detectar MRS). Incube las pruebas utilizando cefoxitina 16 a 20 horas para S.aureus y S. lugdunensis y 24 horas para estafilococos coagulasa negativos.

Para conocer las ltimas recomendaciones sobre las pruebas y la presentacin deinformes, consulte el documento M1007 Cuadro 2C.


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12.1.2.2 Mtodos basados en oxacilina

De las penicilinas estables a las penicilinasas se prefiere a la oxacilina para losensayos in vitro. El resultado con el disco de oxacilina puede extrapolarse a otraspenicilinas estables a las penicilinasas (cloxacilina, dicloxacilina, flucoxacilina, meticilina,nafcilina). La oxacilina es ms resistentes a la degradacin y detectan mejor la hetero-resistencia que la meticilina y la nafcilina.

Cuando se ensaya oxacilina, se requiere el agregado de ClNa (2% p/v; 0.34 mol/L) almedio de cultivo, tanto en el mtodo de dilucin en caldo como en agar (no para difusin).Mejora la deteccin de hetero-resistencia.

Cuando se utiliza el mtodo de difusin, debe inspeccionarse cuidadosamente lazona alrededor del disco de OXA usando luz transmitida para poder as visualizarpequeas colonias o la presencia de un fino desarrollo dentro de la zona de inhibicin.

Si se obtiene resultados de intermedio para oxacilina (pruebas de difusin en disco)para S. aureus, realizar las pruebas de deteccin del gen mecA o PBP 2a, CIM o disco acefoxitina, o prueba de CIM a oxacilina, o placa de screening oxacilina-salada. informe elresultado de la prueba alternativa en lugar de la Oxacilina con resultado intermedio.

12.1.2.3 Mtodos basados en cefoxitina

Los resultados de las pruebas utilizando cefoxitina (ya sea por microdilucin o mediantepruebas de difusin en disco de 30 ug) y puntos de corte apropiados (M100) se puedeutilizar para predecir resistencia a oxacilina mediada por mecA en S. aureus. Las pruebascon cefoxitina son equivalentes a la CIM de oxacilina en y especificidad para el S. aureus.

Para los estafilococos coagulasa negativos, en la actualidad slo el disco de cefoxitinaha sido validado para la prediccin de resistencia mediada por mecA. La prueba de disco

cefoxitina posee equivalente sensibilidad pero mayor especificidad que la CIM de oxacilina(es decir, el disco de cefoxitina identifica con mayor precisin cepas oxacilino-sensiblesque la CIM a oxacilina). No esta recomendado el mtodo de difusin con oxacilina ladifusin para estafilococos coagulasa negativos.

Por ambos, S. aureus y estafilococos coagulasa negativos, la prueba de disco concefoxitina es ms fcil de leer que el disco de oxacilina, por lo tanto, el disco de cefoxitinaes preferible para el mtodo de difusin.

Para S. lugdunensis, slo la prueba de disco cefoxitina debe utilizarse por difusin

Para todos los estafilococos, lea la zona de inhibicin alrededor del disco de cefoxitinautilizando luz reflejada.

Se considera a la cefoxitina como un marcador de deteccin de la resistencia aoxacilina. Sobre la base del resultado de cefoxitina, informe oxacilina como sensibles oresistentes.

12.1.2.4 Mtodos de deteccin molecular

Las deteccin del gen mecA o la protena producida por mecA, llamada protena de unina penicilina 2a (PBP2a, tambin PBP2 llamado "), son la forma ms precisa de prediccinde la resistencia a oxacilina.


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12.1.2.5 Informes

La resistencia puede ser informado en cualquier momento despus de un mnimo de 16horas, en el que se observa crecimiento bacteriano

Si se utiliza cefoxitina, informe oxacilina como sensibles o resistentes sobre la base delresultado de cefoxitina.

Informe como resistentes a oxacilina lo estafilococos que posean gen mecA, o queproducen PBP 2a. Los que no producen mecA o PBP2a, infrmelos como oxacilinasensibles si la CIM de oxacilina es 2 ug/ml. Debido a la rara aparicin de mecanismos deresistencia distintos de mecA, informe los aislados que son negativos para la mecA o no

producen PBP 2a, como oxacilina resistente si la CIM a oxacilina es 4 ug/ml. Aunque el criterio de interpretacin de la MIC de oxacilina para SCN se correlacionabien con la presencia o ausencia del gen mecA en S. epidermidis, este criterio puedesobreestimar la resistencia en otros SCN (Ej. S. saprophyticus).

Para estafilococos coagulasa negativos distintos de S. epidermidis, la deteccin del genmecA o PBP2a pueden ser adecuados para las cepas presenten CIM a oxacilina de 0,5 a2,0 ug/ml. Para coagulasa estafilococos negativos se prefiere la prueba de disco

cefoxitina es (vase la Seccin 12.1.2.5).

Informar MRSA y Staphylococcus coagulasa negativa como resistentes a todas laspenicilinas, carbapenemes, cefemes, y las combinaciones de -lactmicos con inhibidoresde -lactamasas a pesar de los resultados in vitro que se obtengan con esas drogas.Esto es debido a que la mayora de los casos documentados de infecciones por MRShan respondido pobremente a la terapia con antibiticos -lactmicos, o porque aun no sehan presentado datos clnicos convincentes que documenten la eficacia clnica de estosagentes.

En el caso de cepas sensibles a la oxacilina, se deben informar los resultados paralos cefemes orales y parenterales, las combinaciones de -lactmicos con inhibidores de-lactamasas y carbapenemes, si se ensayan, de acuerdo al criterio de interpretacin

utilizado de rutina.

12.1.3 Resistencia a Vancomicina en S. aureus.

En 2006 (M100-S16), los criterios interpretativos de la vancomicina y S. aureus seredujeron a 2 ug/ml para sensible, de 4 a 8 ug/ml para intermedio, y 16 ug/ml pararesistente. Para estafilococos coagulasa negativo, an permanecen en 4 ug/ml parasensibles, 8 a 16 ug/ml para intermedio, y 32 ug/ml para resistentes.

EL primer hallazgo de cepas de S. aureus con sensibilidad disminuida a vancomicina (CIMs4-16 g/ml) fue en Japn, en el ao 1997 (14). Posteriormente se describieronaislamientos con esta caracterstica en Estados Unidos y Francia (15). An no se conocecon exactitud el mecanismo que provoca el aumento de las CIMs, pero se cree queinvolucra alteraciones en la pared celular e hper expresin de protenas ligadoras de

penicilina (PBPs). A la fecha, todos estos aislamientos de S. aureusparecen provenir deMRSA.

De 2002, se han reportado en los Estados Unidos cepas de S. aureusen que la CIM avancomicina oscil de 32 a 1024 ug/ml. Todas estas cepas contena una gen vanAsimilar a los encontrados en enterococos. Estas cepas se pudieron detectar detect demanera fiable tanto por el mtodo de referencia (microdilucin en caldo), el mtodo de


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difusin, y la prueba de agar screening de vancomicina (vase ms adelante), cuando laspruebas son incubados durante un 24 horas plenas a 35 2 C.

12.1.3.1 Mtodos para la deteccin de sensibilidad reducida a vancomicina

S. aureus con CIM a vancomicina 32 ug/ml pueden ser detectado tanto por MIC,difusin por discos, o la prueba de agar screening de vancomicina. Con el fin de

reconocer las cepas de estafilococos para los que la CIM a vancomicina es de 4 a 16ug/ml, debe realizarse la determinacin de la CIM incubando durante 24 horas plenasa 35 2 C. Cepas con una CIM a vancomicina 32 R VRSA SI SI SI

Cepas de S. aureuscon zona de dimetro 7 mm de vancomicina puede tener CIMs de2 a 16 ug/ml. Se debe confirmar la identificacin de las cepas que no presenten zonas deinhibicin i para vancomicina. Las cepas de S. aureuscon zonas de vancomicina 7 mm,no deben informarse de como sensibles sin realizar una prueba de CIM. Hasta que seconozcan los datos de prevalencia o significado clnico de estos aislamientos, loslaboratorios pueden elegir examinar cuidadosamente los MRSA para detectar elevacionesen la CIM para vancomicina.

12.1.3.2 Placa de screening de vancomicina

La placa de screening de vancomicina se puede usar para detectar S. aureus consensibilidad reducida a vancomicina. La prueba se realiza por inoculacin de un aislamientode S. aureusen una placa de agar Cerebro-Corazn (BHI) con 6 g/ml de vancomicina.

Inocular el agar con una suspensin bacteriana de turbidez equivalente al estndar0,5 de Mc Farland, ver seccin 8.2.1.

Utilizar una micropipeta para descargar 10 l en la superficie del agar En formaalternativa, si usa hisopo, escurra el inoculo de la misma forma que lo hara para el


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mtodo de difusin y disperse el inculo en un rea de 10-15 mm de dimetro. Si seusa hisopo, podra ser ms difcil detectarse el crecimiento de colonias.

Incubar las placas a 35 2C en atmsfera de aire, durante 24hs completas,

Se debe examinar la placa cuidadosamente con luz transmitida con el objeto dedetectar pequeas colonias (>1 colonia) o una tenue pelcula de crecimiento. Laobservacin de alguno de estos tipos de desarrollo sugiere sensibilidad reducida avancomicina.

Confirme los resultados de S. aureus que crecen en el Agar Screening BHIVancomicina, repitiendo la identificacin y realizando una CIM a vancomicina por unmtodo validado por CLSI.

El uso de una cepa sensible de control de calidad, tal como el E. faecalis ATCC 29212 o S. aureus ATCC 29213 (vancomicino sensibles) es crtico para asegurarespecificidad. E faecalis ATCC 51299 se puede usar como control positivo. No

utilice S. aureus ATCC 25923 ya que puede dar resultados falsos positivos. No vuelva a utilizar las placas luego de incubadas

Varios aislamientos de S. aureus con CIMs a vancomicina de 4 g/ml no crecen en elAgar Screening de Vancomicina (ver seccin 12.1.3.1). No hay suficientes datos comopara recomendar el uso de esta placa de screening para Staphylococcus coagulasanegativa.

12.1.3.3 Hetero VISA (hVISA)

Cuando se describi por primera vez en 1997, S. aureus hVISA fueron definidos comolas subpoblaciones de clulas bacterianas (por lo general 1 de cada 100.000 a1.000.000 clulas), para los que la CIM a vancomicina era de 8 a 16 ug/mL, es decir,en la categora intermedia. Debido a que una prueba estndar de microdilucin en caldoutiliza un inculo de 5 x 105 UFC / mL, estas subpoblaciones no son detectadas,obtenindose CIM a vancomicina en el antiguo rango de sensibilidad (entre 1 y 4 ug/ml).Muchos mdicos ymicrobilogos inicialmente se mostraron escpticos sobre la posibilidad que los hVISAdieran lugar a fracasos del tratamiento clnico con vancomicina, debido a que estas cepasfueron presentaban CIM de sensibles a vancomicina cuando se utilizaba la

microdilucin (mtodo de referencia). Sin embargo, despus de revisar datos clnicos y delaboratorio, la CLSI redujo la categora intermedio para vancomicina (cepas de S. aureussolamente, y no coagulasa-negativos) de 8 a 4 ug/mL, y la de resistente de 32 a 16ug/ml, siendo estos puntos de corte ms predictivos de los resultados de evolucinclnica. Por lo tanto, los nuevos puntos de corte de vancomicina para S. aureus son:sensible - 2 ug / ml, intermedio de 4 a 8 ug/mL, y resistente 16 ug/ml. Estasconcentraciones permiten detectar muchas de las cepas hVISA para las que la CIM avancomicina es de 4 ug/mL, que previamente habran sido designadas como sensibles. Sinembargo, algunas cepas de hVISA de S. aureus pueden presentar CIM de vancomicinade 1 a 2 ug/ml.

La determinacin de anlisis de perfiles poblacionales de S. aureus se ha convertido defacto en el mejor mtodo disponible para la investigacin de la relevancia clnica de lascepas hVISA en grandes estudios de vigilancia. Esta tcnica, sin embargo, es mano deobra intensiva y no es apropiado para la rutina clnica. Lamentablemente, no hay ningunatcnica estandarizada para los laboratorios de rutina hasta el momento que resulteconveniente y confiable para la deteccin de las cepas hVISA. La incapacidad de losmtodos automatizados y las pruebas de sensibilidad de referencia para detectar lealfenotipo hVISA, hace difcil identificar las infecciones que podran no responder a la


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terapia de la vancomicina. La deteccin de la presencia de cepa de S. aureus conresistencia heterognea sigue siendo un reto difcil.

12.1.3.4 Informe

La sensibilidad a vancomicina debe ser comunicado segn los mtodos de rutina utilizadospor los laboratorios. Para las cepas en las que se observe no sensibilidad a vancomicina

(es decir, aquellos asilados con CIM 4 ug/ml y/o crecimiento en agar BHI+vancomicina), los resultados preliminares deben ser reportados siguiendo losprotocolos utilizados de rutina; los resultados finales debe ser comunicado despus de laconfirmacin por un laboratorio de referencia. Ver M100, Tabla 2C para lasrecomendaciones ms recientes.

12.1.4 Resistencia inducible a Clindamicina

La resistencia de tipo inducible a clindamicina se puede detectar usando el mtodo

descrito en la Seccin 13 y documento M023 (seccin 12).

12.1.5 Resistencia a MupirocinaEL alto nivel de resistencia a mupirocina (es decir, CIM 512 ug/mL) se asocia con lapresencia de plsmidos conteniendo el gen mupA.Este alto nivel de resistencia mupirocina pude ser detectada usando ya sea la difusin por

disco o la microdilucin en caldo. En la prueba de difusin se utiliza disco de mupirocina de200 microgramos e incubacin completa de 24 horas. Se debe leer cuidadosamente conluz transmitida para detectar patinas o crecimiento dentro de zona de inhibicin de lapresencia de alto nivel de resistencia mupirocina;Interpretacin: patinas, colonias dentro de zona de inhibicin o ausencia de zona deInhibicin = resistencia de alto nivel.En un estudio reciente, la mayora de los aislados mupA negativos mostraron dimetros>18 mm con el disco de mupirocina 200 microgramos zona.Microdilucin en caldo: una MIC 512 ug/ml indica alto nivel de resistencia a mupirocina;

CIM 256 ug/ml = ausencia de alto nivel resistencia. Para la dilucin se puede probarsolo una concentracin de antimicrobiano ( 256 ug/mL de mupirocina). Interpretacin delensayo de una sola concentracin: crecimiento = alto nivel de resistencia a mupirocina;ausencia de crecimiento = ausencia de alto nivel resistencia.

12.2 Enterococcusspp.

12.2.1 Resistencia a Penicilina/AmpicilinaLos enterococos pueden ser resistentes a penicilina y ampicilina debido a la produccin deprotenas ligadoras de penicilinas (PBPs) de baja afinidad a la produccin de -

lactamasas. Este ltimo mecanismo de resistencia es mucho menos comn. Las pruebasde dilucin en agar o en caldo detectan satisfactoriamente los aislamientos con PBPs

alteradas, pero no son efectivas para detectar las cepas productoras de -lactamasas.Para la correcta deteccin de -lactamasas en este gnero se debe utilizar la prueba denitrocefn (ver Seccin 14.2). Un resultado de -lactamasa positivo predice resistencia apenicilina, as como a amino-, carboxi-, y ureidopenicilinas. Algunos aislamientos deenterococos resistentes a penicilina o ampicilina pueden presentar alto nivel deresistencia a penicilina (por ej. CIMs > de 128 g/ml) o ampicilina (CIM 64 g/ml). Lascepas de enterococos con bajo nivel de resistencia a penicilina (CIM 64 g/ml) oampicilina (CIM < 32 g/ml), podran ser sensibles a la sinergia con gentamicina oestreptomicina (en ausencia de alto nivel de resistencia a estos ltimos) si se usan altas


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dosis de penicilina. En cambio las cepas que muestran alto nivel de resistencia a penicilina(CIMs de 128 g/ml) o ampicilina (CIM 64 g/ml) pueden no ser sensibles a lasinergia. (

04 Determinacion de La Sensibilidad Metodo de Dilucion 2012

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