02-Célula..

345An. Sist. Sanit. Navar. 2003, Vol. 26, N 3, septiembre-diciembre

COLABORACIN ESPECIAL

Clulas madre adultasAdult stem cells

F. Prsper1, C.M. Verfaillie2

Servicio de Hematologa y rea de TerapiaCelular.

1. Clnica Universitaria. Universidad de Nava-rra.

2. Stem Cell Institute, University of Minnesota.Aceptado para su publicacin el 2 de octubre de2003.

Felipe PrsperServicio de Hematologa y rea de Terapia Celu-larClnica UniversitariaAvda. Po XII, 3631008 PamplonaTfno. 948 255400Fax 948 296500E-mail: [email protected]

An. Sist. Sanit. Navar. 2003; 26 (3): 345-356.

RESUMENUno de los campos de la medicina que ms expec-

tativas han levantado en los ltimos aos es la terapiacelular con clulas madre. El aislamiento de clulasembrionarias humanas, la aparente e inesperadapotencialidad de las clulas madre adultas y el desa-rrollo de la terapia gnica nos lleva a imaginar un futu-ro esperanzador para un importante nmero de enfer-medades actualmente incurables. A lo largo de lassiguientes pginas vamos a tratar de dibujar el panora-ma de la investigacin con clulas madre, describiendolos principales logros en este campo as como algunasde las preguntas pendientes de responder. A pesar delas grandes expectativas, es fundamental que manten-gamos un espritu crtico y realista a la hora de analizarlos avances cientficos en esta rea.

Palabras clave. Clulas madre adultas. Transdife-renciacin. Clulas embrionarias. Terapia celular. Rege-neracin celular.

ABSTRACT

One of the fields of medicine that has created thegreatest expectations in recent years is cellulartherapy with stem cells. The isolation of humanembryo cells, the apparent and unexpected potentialof adult stem cells, and the development of genetherapy lead us to imagine a hopeful future for asignificant number of diseases that are at presentincurable. In the following pages we offer a sketch ofthe panorama of research with stem cells, describingthe main achievements in this field as well as some ofthe questions awaiting answers. In spite of the greatexpectations, it is essential that we maintain a criticaland realistic spirit when it comes to analysing thescientific advances in this area.

Key words. Adult stem cells. Transdifferentiation.Embryo cells. Cellular therapy. Cellular regeneration.

INTRODUCCINEn los ltimos aos hemos visto cmo las clulas madre o

troncales han pasado de ser un concepto de inters cientficoprincipalmente en el campo de la biologa del desarrollo, a ocu-par tantas pginas en las revistas cientficas como en la prensa.Los conocimientos que en este campo de la medicina se vienenproduciendo de forma casi diaria ha disparado las expectativasde los enfermos y de los mdicos de que las clulas madrevayan a contribuir a la curacin de mltiples enfermedadeshumanas devastadoras como la diabetes, la enfermedad de Par-kinson, el infarto de miocardio u otras muchas. En el centro deldebate cientfico, poltico y tico se ha situado la utilizacin einvestigacin con clulas madre embrionarias. A lo largo de lassiguientes lneas discutiremos algunos conceptos bsicossobre lo que son las clulas madre, que se entiende por versa-tilidad de las clulas madre adultas y qu evidencias apoyan laexistencia de clulas madre adultas pluripotenciales. Finalmen-te, comentaremos cules son algunas de las aplicaciones clni-cas en desarrollo en la actualidad y cul puede ser, al menosdesde nuestro punto de vista, el futuro en este campo.

CELULAS MADRE, POTENCIALIDAD Y VERSATILIDADUna clula madre o troncal es aquella que es capaz de divi-

dirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de clu-las especializadas, no slo morfolgicamente sino tambin deforma funcional (Fig. 1). Las clulas madre se pueden clasificar

F. Prsper y C.M. Verfaillie

346 An. Sist. Sanit. Navar. 2003, Vol. 26, N 3, septiembre-diciembre

MorulaCigot Blastocisto Cuerpos Embrioides

MasaCelularInterna

Ectodermo Endodermo Mesodermo

Neuroesferas Piel

NeuronasGlia

EpidermisDermis

Hgado Gastrointestinal

Clulas Ovales

HepatocitosConductos Biliares

Conductos PancreticosAcinos Pancreticos

Criptas Celulares

Mdula Osea Msculo

Clulas MadreHematopoyticas

Clulas MadreMesenquimales

Clulas Satlite

NeutrfilosPlaquetasEritrocitos

CondroblastosOsteoblastos

Adipocitos

MioblastosMiofibras

Clulas MadreTotipotenciales

Clulas MadreMultipotenciales

Clulas MadrePluripotenciales

Clulas Madre Somticas Clulas Madre Germinales

Figura 1. Modelo jerrquico de las clulas madre de acuerdo con su potencial.

segn su potencial de diferenciacin: las clulas madre totipo-tenciales son capaces de producir tejido embrionario y extra-embrionario; las clulas madre pluripotenciales tienen la habi-lidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera delas tres capas embrionarias y, por ltimo, las clulas madre mul-tipotenciales, son capaces de diferenciarse a distintos tiposcelulares procedentes de la misma capa embrionaria1.

Tradicionalmente se han considerado a las clulas madreembrionarias como clulas pluripotenciales, a diferencia delas clulas madre adultas que se han caracterizado slo comomultipotenciales. Sin embargo, trabajos publicados reciente-mente sugieren que la potencialidad de algunos tipos de clu-las madre adultas podra ser mayor de lo esperado, existien-do clulas troncales pluripotenciales en algunos rganosadultos con capacidad de diferenciarse en tejidos derivadosde cualquiera de las capas embrionarias2,3. Es importante des-tacar que para que una clula madre pueda considerarse plu-ripotencial tiene que cumplir las siguientes condiciones: enprimer lugar, una nica clula debe ser capaz de diferenciarsea clulas especializadas procedentes de cualquier capaembrionaria; en segundo lugar, demostrar la funcionalidad invitro e in vivo de las clulas a las que se han diferenciado y,finalmente, que se produzca un asentamiento claro y persis-tente de estas clulas en el tejido diana, tanto en presencia oausencia de dao en los tejidos en los cuales se injerta. Enestos momentos no existe ningn estudio que cumpla todosestos criterios de forma estricta, aunque algunos trabajosindican de manera bastante evidente la posible existencia declulas madre adultas pluripotenciales2,3.

La existencia de clulas madre adultas en distintos tejidos,incluyendo hematopoytico, neuronal, epidrmico, gastrointes-tinal, msculo esqueltico, msculo cardaco, hgado, pncreaso pulmn no admite controversia. Sin embargo, cada vez pare-ce ms evidente que las clulas madre adultas derivadas deestos rganos, no slo pueden generar clulas maduras dedicho tejido sino tambin tejidos derivados de otras capasembrionarias, siendo el caso ms tpico el de las clulas madrehematopoyticas capaces de diferenciarse a tejidos comohepatocitos4, msculo cardaco5, endotelio3 o a tejidos deriva-dos de las tres capas embrionarias6. Este fenmeno, denomina-do versatilidad o capacidad de transdiferenciacin de las clu-las madre adultas, no est exento de controversia, ya quemientras algunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientescuestionan la existencia de una autntica versatilidad de lasclulas, justificando algunos de los hallazgos de versatilidad enfuncin de fenmenos de fusin celular7-9 o incluso cuestionan-do abiertamente los resultados experimentales10. En las siguien-tes lneas revisaremos los distintos tipos de clulas madres as


CLULAS MADRE ADULTAS

como algunas de las evidencias que apoyan la existencia de ver-satilidad y los mecanismos que la justifiquen.

CLULAS MADRE DE LA MDULA SEASe han descrito diferentes tipos de clulas madre en la

mdula sea: hematopoyticas (HSC)1, mesenquimales(MSC)11, las llamadas Side Population Cells (SP)12 y reciente-mente las clulas progenitoras adultas multipotenciales oMAPCs13.

Clulas madre hematopoyticas (HSC)Las HSC han sido identificadas tanto in vitro como in vivo

por varios laboratorios y utilizadas clnicamente desde hacems de 50 aos. El trasplante alognico de progenitores hema-topoyticos ha demostrado definitivamente que existen clu-las madre multipotenciales hematopoyticas en la mdulasea y en la sangre perifrica14. Mientras que en animales deexperimentacin es posible aislar e identificar las HSC, en elhombre no se ha podido identificar de igual modo la clularesponsable de la regeneracin del resto de lneas celulareshematopoyticas, entre otras cosas porque la demostracindefinitiva de las clulas madre hematopoyticas depende dela realizacin de experimentos de repoblacin, que obviamen-te no se pueden realizar en humanos.

Adems del potencial hematopoytico, diversos trabajosrecientes indican que las HSC bajo ciertas circunstancias pue-den ser ms potentes de lo esperado dando lugar a tejidosderivados de distintas capas embrionarias. Las clulas madrehematopoyticas de mdula sea y de sangre perifrica soncapaces de contribuir a la angiognesis y vasculognesis invivo de tal forma que las clulas CD34+ no slo contienen pro-genitores hematopoyticos sino tambin clulas progenitorasendoteliales. Hoy en da se acepta que existe un progenitorcomn endotelial y hematopoytico (hemangioblasto), lo cualvendra apoyado por estos hallazgos de la potencialidad endo-telial de las clulas troncales hematopoyticas de la mdulasea3. Tambin se han publicado recientemente trabajos queapoyaran la capacidad de las HSC de diferenciarse en clulasde msculo cardaco. El grupo de Orlic y Anversa han demos-trado, en un modelo de infarto de miocardio murino, que unainyeccin de clulas de mdula sea Lin- y c-kit+ (fenotipo demarcadores de superficie tpico de HSC) en el corazn daa-do, resulta de la colonizacin de estas clulas en ms de lamitad del rea infartada. Estas posibles HSC adquirieron unfenotipo caracterstico de clulas de miocardio y contribuyena la mejora y supervivencia de los animales5. La contribucinde las clulas madre adultas a la regeneracin cardaca hasido sugerida en modelos de trasplante cardaco en humanos:



en un grupo de pacientes varones trasplantados con corazo-nes de donantes mujer, el anlisis de biopsias cardacas per-miti identificar que un porcentaje de entre el 7-10% de loscardiomiocitos provenan del propio receptor ya que en ellosse poda identificar el cromosoma Y15. Aunque el origen dedichas clulas no se pudo determinar, claramente estoshallazgos sugieren la capacidad de clulas adultas de diferen-ciarse a tejido cardaco. Es necesario, sin embargo, estableceruna nota de precaucin en relacin con muchos de los traba-jos existentes en este campo y es que los resultados experi-mentales de ciertos trabajos no han podido ser reproducidospor otros grupos. Estas discrepancias pueden deberse a dife-rencias en los modelos experimentales, las tcnicas de labo-ratorio o incluso al entusiasmo de los investigadores. Sirva elejemplo de que mientras que en el trabajo que hemos men-cionado el porcentaje de quimerismo era del 7-10%, 4 trabajosadicionales utilizando un modelo muy similar han encontradoque el nivel de quimerismo oscila entre el 0-1%16.

Basndose en que las clulas ovales (clulas madre hepti-cas) expresan marcadores de superficie tradicionalmente aso-ciados a HSC (c-kit, flt-3, Thy-1 y CD34), se ha sugerido questas podran diferenciarse a clulas ovales y hepatocitos. Elgrupo de Lagasse y col han demostrado que clulas madrehematopoyticas de mdula sea con el fenotipo Lin-, c-kit+,Thy-1, Sca-1 son capaces de regenerar un hgado murino en unmodelo de dao heptico fulminante4 mientras que utilizandomodelos de quimerismo en pacientes sometidos a trasplantesde mdula sea o de hgado, y aprovechando la posibilidad deutilizar el cromosoma Y como marcador del origen de la clula,tambin se ha podido demostrar que un porcentaje de hepato-citos provienen de clulas madre de origen no heptico17,18.

El potencial de las HSC para adquirir caractersticas demsculo esqueltico, neuronas adultas as como clulas de lagla, y de contribuir a otros tejidos como el epitelio pulmonar,gastrointestinal, renal o a la piel ha sido descrito reciente-mente principalmente in vivo19. A pesar de todos estos esfuer-zos, ninguno de los estudios publicados hasta el momentodemuestra que una nica clula madre hematopoytica con-tribuya de forma robusta y funcional a la regeneracin de untejido distinto del hematopoytico y por tanto en sentidoestricto no cumple los criterios necesarios para hablar de ver-satilidad. Cada uno de los trabajos mencionados pueden sercriticados en este sentido. Sin embargo, si tomamos los estu-dios de forma conjunta, s que aportan evidencias de la exis-tencia de HSC con estas caractersticas y potencialidades3-6,20.

Clulas madre mesenquimales (MSC)La mdula sea tambin contiene clulas madre mesenqui-

males, tambin denominadas clulas madre estromales o



MSC. En los ltimos aos se han descrito distintos marcado-res de superfcie que han permitido identificar y aislar clulasMSC, tales como SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90 y CD10621.Las MSC no expresan antgenos de superficie tpicos de lasHSC, como CD34, CD45 o CD14. Experimentos recientes handemostrado in vitro que las MSC son capaces de diferenciarsea tejidos mesodrmicos funcionales, como osteoblastos, con-droblastos, adipocitos y mioblastos esquelticos11.

Varios grupos afirman haber conseguido diferenciar MSC aclulas derivadas del neuroectodermo, basndose en la adqui-sicin de ciertos marcadores de origen neuronal por parte dedichas clulas cuando son sometidas a sistemas de cultivoespecficos. Sin embargo, los autores no llegan a demostrarque estas clulas adquieran caractersticas funcionales simi-lares a neuronas o clulas de la gla22. A pesar de su probadamultipotencialidad mesodrmica y de su habilidad para dife-renciarse a neuroectodermo, las MSC no se diferencian a teji-do derivado del endodermo y, por lo tanto, no se pueden con-siderar clulas madre pluripotenciales. Las MSC constituyenun modelo muy til en aplicaciones clnicas para un nmerode enfermedades, tanto en terapia regenerativa como en tera-pia gnica23.

Clulas side population (SP)Las llamadas clulas SP han sido aisladas tanto a partir de

mdula sea como de msculo utilizando tcnicas de citome-tra de flujo (FACS). Se sabe que las SP son capaces de dife-renciar a HSC en humanos, roedores y otras especies12,24. Ade-ms algunos estudios describen que las SP podran dar lugara otros tipos de clulas especializadas e integrarse en distin-tos tejidos in vivo. As, el grupo de Jackson y col demostr en1999 que las SP podan diferenciar a clulas con caractersti-cas de msculo cardaco y endotelio en un modelo murino deinfarto de miocardio24.

Clulas progenitoras multipotenciales adultas (MAPC)Esta poblacin celular de la medula sea ha sido descrita

recientemente por el grupo de Catherine Verfaillie2. Su descu-brimiento ha suscitado la atencin del mundo cientfico yaque se han descrito como autnticas clulas pluripotencialescon una capacidad diferenciadora muy similar a las clulasmadre embrionarias. Las MAPCs han sido aisladas tanto demdula humana como murina. Estas MAPCs son capaces deproliferar in vitro ms de 120 divisiones celulares sin un apa-rente envejecimiento ya que mantienen unos niveles altos detelomerasa durante todo el tiempo de cultivo. Se ha descritoque las MAPCs no expresan CD34, CD44, MHC I, MHC II, CD45y c-kit; expresan niveles bajos de Flk-1, Sca-1 y Thy-1, y altos



de CD13, SSEA-1 (ratn/rata) y SSEA-4 (humano). Al igual quelas clulas madre embrionarias, en las MAPCs se detecta laactivacin de los factores de transcripcin Oct-4 nanog y Rex-1, factores que son necesarios para mantener la clula en unestado proliferativo e indiferenciado. Adems se han realizadoexperimentos de clonaje que prueban que es una nica clulala que es capaz de diferenciarse a tejidos procedentes de cual-quiera de las tres capas embrionarias (endodermo, mesoder-mo o ectodermo). In vitro, las MAPCs pueden ser inducidas adiferenciar a tejidos derivados del mesodermo como hueso,cartlago, adipocitos, msculo esqueltico, estroma hemato-poytico o endotelio. Pero de momento no han sido capacesde diferenciar a tejido hematopoytico maduro o cardiomioci-tos. Estas clulas tambin han sido capaces de diferenciar ahepatocitos y funcionar como tales, ya que son capaces deproducir urea, albmina, inducir el citocromo p450 con feno-barbital y almacenar glucgeno. La diferenciacin de lasMAPCs a tejidos derivados del ectodermo como neuronas,astrocitos y oligodendrocitos tambin ha sido demostrada invitro25.

Aunque el proceso de aislamiento de las MAPC todava eslargo y laborioso, y an no se han publicado experimentosque prueben que no existen fusiones celulares, estos experi-mentos con MAPCs son los que ms se han aproximado a lademostracin de la existencia de clulas madre pluripotencia-les, mostrando su potencialidad no slo en el campo terapu-tico, sino como un instrumento para poder comprender mejorlos eventos que inducen a las clulas madre a la diferenciase.

PLURIPOTENCIALIDAD Y CLULAS MADRE NODERIVADAS DE LA MDULA SEA

La existencia de clulas madre en diferentes tejidos comoel sistema nervioso central, hgado, corazn, piel y msculono admite controversia. La visin tradicional de que rganoscomo el corazn o el sistema nervioso central no son capacesde regenerarse ya que carecen de clulas con potencial deproliferar y diferenciarse han quedado claramente obsoletos.Sin embargo, por limitaciones de espacio, no vamos a entraren detalle en los distintos tipos de clulas madre, sino queexclusivamente vamos a hacer una breve referencia a algunosestudios que indican la posibilidad de que clulas madre obte-nidas de alguno de estos rganos tengan un mayor potencialdel esperado, es decir que existan clulas pluripotenciales enestos rganos. Los argumentos tanto contrarios como a favorde la versatilidad de las clulas madre derivadas de tejidosadultos, que hemos mencionado en el prrafo anterior, sontambin vlidos en este caso.

Uno de los mejores experimentos donde se prueba la exis-tencia de clulas madre adultas pluripotenciales de origen



neural y su capacidad diferenciadora fue el publicado por elgrupo de Clarke y col26. Este grupo inyect clulas madre neu-ronales o neuroesferas procedentes de un ratn transgnicopara el gen reportero LacZ en embrin de ratn. Aproximada-mente el 25% de los embriones presentaban quimerismo noslo en el tejido neuronal, sino tambin en tejidos del meso-dermo y del endodermo. Cuando estas mismas neuroesferasfueron inyectadas dentro de un blastocito de ratn, la contri-bucin se extendi al sistema nervioso central, corazn, hga-do, intestino y otros tejidos. Debido a que los animales no fue-ron evaluados despus del nacimiento, no se pudo realizaruna valoracin objetiva de la funcionalidad de las clulasdonadas.

El grupo de Qu-Petersen y col27 ha sido capaz de aislar dife-rentes poblaciones de clulas madre musculares murinasbasndose en su capacidad de adhesin y proliferacin. Estasclulas pueden mantenerse en cultivo durante ms de 60 divi-siones celulares sin anormalidades cromosmicas siendocapaces de diferenciarse in vitro e in vivo a endotelio, mscu-lo, y clulas del linaje neuronal. Una vez ms la crtica que losinvestigadores hacen es la ausencia de experimentos clonalesque prueben que es una nica clula y no una poblacin hete-rognea la causante del potencial diferenciador.

De la epidermis humana y murina se han aislado clulasmadre con capacidad de diferenciarse a clulas especializa-das procedentes de dos capas embrionarias distintas. Estasclulas se pueden mantener en cultivo durante ms de 12meses sin diferenciarse y se puede inducir diferenciacin invitro a neuroectodermo (neuronas y clulas de la gla) o a lina-jes mesodrmicos (adipocitos y msculo liso). Su potencial dediferenciacin a tejidos derivados del ectodermo y mesoder-mo ha sido demostrado a nivel clonal, pero no existen evi-dencias de una multipotencialidad in vivo y tampoco que lostejidos diferenciados sean funcionales. Adems el porcentajede las clulas con caractersticas morfolgicas neuronales omesodrmicas es menor al 10%28.

De forma casi continua aparecen nuevos estudios en losque se aslan clulas madre a partir de tejidos adultos concapacidad multipotencial. Uno de los trabajos que ms expec-tativas ha levantado sugiere que es posible aislar en el ms-culo cardaco, clulas madre multipotenciales capaces de dife-renciarse in vitro e in vivo a cualquiera de los tejidosnecesarios para reconstituir un corazn daado, esto es endo-telio, msculo liso y msculo cardaco29. Incluso ms sorpren-dente es el hecho de que dichas clulas son fcilmente identi-ficables en el corazn gracias a la expresin de c-kit junto conla ausencia de expresin de marcadores especficos de lnea(c-kit+, Lin-). Si estos resultados pudieran ser reproducidos



por otros grupos en animales as como en humanos, las pers-pectivas teraputicas seran enormes.

VERSATILIDAD, FUSION CLULAR Y CLULAS MADREADULTAS

A pesar de los mltiples estudios publicados que sugierenla existencia de clulas madre adultas pluripotenciales oincluso de la capacidad de ciertas clulas madre de transdife-renciarse, existen importantes interrogantes e incluso nuevasevidencias cientficas que han cuestionado la verdadera natu-raleza de estos fenmenos de diferenciacin: quiz la pregun-ta fundamental radica en cul es el posible mecanismo(s) quejustifica las observaciones que hemos comentado. Cuatroseran las hiptesis que se barajan en la actualidad (Fig. 2). 1-La mayor parte de los estudios publicados hasta el momentoque sugieren la existencia de clulas madre adultas pluripo-tenciales no han sido capaces de demostrar esta potenciali-dad a nivel clonal, es decir, una nica clula dando origen ados poblaciones celulares diferentes. En este sentido es posi-ble que muchas de las observaciones realizadas, correspon-dan realmente a la heterogeneidad de las clulas estudiadas,pudiendo existir diversas clulas madre en la misma pobla-cin, cada una con distintas capacidades. En este sentido, sinembargo, si existen trabajos en los que se demuestra a nivelclonal, la potencialidad de las clulas madre identificadas3,13. 2-Varios trabajos recientes han demostrado que al menos algu-nas de las observaciones de pluripotencialidad podran estar



Figura 2. Posibles mecanismos de potencialidad de las clulas madre adultas.

justificadas por procesos de fusin entre las clulas madretransplantadas y las clulas residentes7,9. El fenmeno defusin se suele acompaar con la formacin de clulas concaractersticas de ambas poblaciones fusionadas y general-mente con doble dotacin cromosmica, lo que induce unadesventaja proliferativa. La existencia del fenmeno de fusines indudable y la pregunta que cabe hacer es si podra justifi-car todas las observaciones de pluripotencialidad realizadashasta la fecha, lo cual parece poco probable, e incluso hastaqu punto este fenmeno puede ser ventajoso para la regene-racin de un rgano o tejido 8,30. 3- De igual forma que duranteel proceso de clonacin, el ncleo de la clula somtica sufreun proceso de reprogramacin, es posible que las clulasmadre adultas, en determinadas circunstancias, puede desdi-ferenciarse para posteriormente diferenciarse hacia clulasde distinta estirpe31,32. 4- Finalmente, es posible que en el orga-nismo adulto persistan clulas madre indiferenciadas, rema-nentes de tejido embrionario con capacidad pluripotencial.

CONCLUSINA pesar de todas las controversias existentes en este

campo, no cabe duda de que la utilizacin de clulas madre enel futuro ha despertado unas enormes expectativas. Biencomo materia prima para terapia regenerativa de enfermeda-des hasta ahora incurables como la enfermedad de Parkinson,diabetes o enfermedades cardacas crnica o bien como veh-culo de terapia gnica, slo hemos empezado a imaginar lasposibilidades teraputicas de las clulas madre. Sin embargo,es fundamental recordar que para conseguir que las clulasmadre se trasformen en una realidad teraputica es impres-cindible continuar haciendo investigacin rigurosa y estrictaque nos permita llegar a conclusiones. A pesar de la presinsocial, es imprescindible que ni los cientficos, ni los polticos,ni los periodistas ni la sociedad en general levanten expecta-tivas que lejos de la realidad, llevaran a la frustracin y desen-canto de los enfermos.

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