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Introducción

La calidad de un producto alimenticio en general, y de un queso en particular, se define por medio de una serie de características que se encuentran influenciadas y condicionadas por la aceptabilidad del consumidor, muchas de las cuales se cuantifican a través de índices técnicos y analíticos. Se puede decir que “calidad” es sinónimo de constancia en el tiempo. Sólo un queso que se pueda presentar al consumidor con unas características estructurales, de composición y organolépticas uniformes e invariables podría definirse realmente como un producto de calidad. En concreto, en la producción de leche de oveja, los criterios de calidad han ido siempre orientados hacia la obtención de un elevado rendimiento en la cuajada, valorándose principalmente la grasa media y el extracto seco total. Sin embargo la proteína, escasamente apreciada en la mayoría de los casos, presenta una incidencia mayor que la grasa en cuanto al rendimiento en queso por lo que, para conseguir una mejora de la calidad de la leche, se han tenido en cuenta, desde hace algunos años, otras características como pueden ser el contenido en caseínas, la proporción con que cada fracción caseínica contribuye a la composición proteica total y el polimorfismo bioquímico de las proteínas lácteas. Los clásicos criterios de porcentajes de grasa, proteína y extracto seco, deben verse ampliados con el análisis de las características tecnológicas de la leche, mas aún si tenemos en cuenta que más del 95% de la leche ordeñada de pequeños rumiantes (oveja y cabra) se destina a la elaboración de queso, lo que implica que la mejora del rendimiento económico de la producción de queso ha de pasar no sólo por el análisis de las características físico-químicas e higiosanitarias, sino también por el estudio de las características tecnológicas de la leche utilizada. Asimismo, las variantes genéticas de las proteínas lácteas han venido siendo objeto de numerosos estudios durante los últimos años, para intentar establecer una clara relación entre los distintos fenotipos encontrados y los diversos parámetros de calidad de la leche.

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Características generales de la leche Definición.-

Según la definición adoptada por el I Congreso Internacional para la Represión de los Fraudes en los Alimentos (Ginebra, 1908), la leche se define como "el producto íntegro del ordeño completo e ininterrumpido de una hembra lechera sana, bien alimentada y no fatigada, que debe ser recogida higiénicamente y que no debe contener calostro" (Veisseyre, 1988).

Esta definición coincide básicamente con la establecida en el Código

Alimentario Español (Real Decreto 2484/1967 de 21 de Septiembre) que, en su Capítulo V, señala que la leche es "el producto íntegro, no alterado ni adulterado y sin calostro del ordeño regular, higiénico, completo e ininterrumpido de las hembras mamíferas sanas y bien alimentadas" (Molina, 1987).

Características generales.

La leche es un líquido blanco, opaco, dos veces más denso que el agua, de sabor ligeramente azucarado y de olor poco acentuado. Constituye un sistema químico y fisico-químico muy complejo y, de modo esquemático, se puede considerar como una emulsión de materia grasa en una solución acuosa que contiene numerosos elementos, unos en disolución y otros en estado coloidal (Veisseyre, 1988).

Según Assenat (1991), la leche de oveja se diferencia de la de cabra y vaca

en algunas características, unas directamente observables y otras relacionadas con sus particularidades físicas y químicas. De modo general, estas características son:

- Su aspecto es blanco nacarado, semejante a la porcelana. - Su opacidad es mayor que la de la leche de otras especies. - Su viscosidad es más elevada, debido a su riqueza en materia grasa. - Tiene un olor característico, relativamente débil en la leche recogida en buenas condiciones. - Las características organolépticas de la leche de oveja la hacen distinta a otras leches de consumo. Así, frente al sabor azucarado que tiene en común con otras leches, presenta un aroma característico y una mayor cremosidad por su elevado contenido en grasa. - Con una resistencia a la proliferación de bacterias especialmente elevada en las primeras horas debido a la actividad inmunológica. A esto se añade que la leche de oveja tiene doble contenido en minerales que la leche de vaca, siendo su capacidad tampón claramente superior, lo que representa una ventaja de cara a su conservación. - Es una leche especialmente rica en componentes queseros (grasa y proteína). Normalmente, para la misma cantidad de leche, se obtiene de media dos veces más queso con la leche de oveja que con la de vaca. - Produce una cuajada dura,mucho más de lo que haría suponer la relación entre los rendimientos queseros de las leches de vaca y oveja (1/2).

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- Los productos queseros obtenidos de la leche de oveja tienen un aspecto y un sabor particulares: la pasta es más blanca en general, y es difícil la aparición de sabores amargos. Estas particularidades se atribuyen a la menor proporción de α-caseína respecto a la caseína total, y a que los triglicéridos de la leche de oveja tienen una diferente composición de ácidos grasos.

Características fisico-químicas. Diferencias con otras especies.

En general, se puede afirmar que las principales diferencias que se observan entre la leche de las tres especies se deben a la mayor riqueza de la de oveja en sus componentes fundamentales (grasa y proteína).

Así, el elevado valor medio de la viscosidad en leche de oveja (2.936 cp),

con respecto a la de las otras dos especies, es debida a su mayor contenido en materias grasas y nitrogenadas.

Del mismo modo, el valor de la acidez valorable, en grados Dornic, señala

una gran riqueza en materia seca, al igual que la densidad, ya que una leche pobre presentará una densidad menor que una leche rica. Sin embargo, hay que matizar que la grasa contenida en la leche hace disminuir el valor de la densidad, ya que su densidad es inferior a la unidad (0.93 a 20oC), de modo que una leche descremada presentará una densidad mayor que una leche enriquecida en grasa (Goursaud, 1991).

El pH de la leche de oveja, similar en su valor al de las otras leches, da

información precisa acerca de su estado de frescura. Una leche fresca normal es neutra o ligeramente ácida, pero si han actuado las bacterias lácticas, la lactosa se degrada transformándose en ácido láctico, y el pH disminuye (pH< 6.5). Por el contrario, valores de pH superiores a 7.0 indican que la leche presenta compuestos con características alcalinas, propios de leches mamíticas (Gourasud, 1991).

El punto crioscópico, de valor muy semejante en leche de las tres especies

comparadas, es un parámetro físico de gran interés para evaluar cuantitativamente la cantidad de agua añadida a una leche (aguado). La acidificación de la leche o la adición de sales minerales rebajan el punto crioscópico, mientras que el descremado no influye en su valor (Molina, 1987). En la práctica, una elevación de 0.005oC en el punto crioscópico equivale a un aguado del 1% (Alais, 1970).

La baja tensión superficial de la leche con respecto a la del agua (50

dinas/cm2 respecto a 79 dinas/cm2) se explica por la presencia de sustancias orgánicas en aquella (fundamentalmente caseínas). Las proteínas del lactosuero coagulables por el calor (albúminas y globulinas) y la materia grasa, tienen una escasa incidencia sobre la tensión superficial de la leche. Sin embargo, la alteración de esta última (lipolisis) o la adición de sustancias tensoactivas provocan una reducción de la tensión superficial y una tendencia mayor a la formación de espuma (Alais, 1970).

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Con respecto al índice de refracción, podemos señalar que se utiliza para medir la concentración de las sustancias disueltas. Así, el aumento de este índice será la suma de los aumentos debidos a cada componente. En este caso, la contribución de las sales es despreciable y la materia grasa que se encuentra fuera de la fase continua no interviene (Alais, 1970).

La conductividad eléctrica es algo mas baja en el caso de la leche de oveja

que en el de vaca o cabra. Este parámetro tiene un cierto interés práctico para el conocimiento indirecto del estado sanitario de la ubre, ya que los valores normales se ven incrementados cuando se producen infecciones mamíticas (Redaelli et al., 1984). Composición química global. Diferencias con otras especies.

La leche es un medio acuoso caracterizado por la presencia de diferentes fases en equilibrio inestable. En parte es una solución acuosa verdadera y estable, que contiene moléculas (lactosa) e iones (Ca2+) disueltos, pero también incluye soluciones coloidales, inestables por naturaleza, constituídas por dos tipos de coloides:

- Las albúminas y globulinas: coloides moleculares relativamente estables,

puesto que son hidrófilos. - El compuesto salino (PO4)2Ca3, asociado a un complejo orgánico de

caseinato de calcio, que es un coloide micelar muy inestable. En la leche fresca, estas micelas están cargadas negativamente y la repulsión electrostática entre ellas asegura la estabilidad, evitando su agregación.

Los glóbulos grasos de la leche son gotas de grasa rodeadas de una

membrana lipoproteica y se encuentran en emulsión gracias a la carga negativa de su envoltura que, al igual que ocurre con las caseínas, produce la repulsión electrostática entre ellas.

Como en el caso de otros mamíferos, la composición media de la leche de oveja es un concepto puramente teórico, ya que esta varía a lo largo de la lactación y, además, se ve afectada por diversos factores (raza, alimentación, manejo, etc.).

La leche de oveja se consume, en su mayoría, como derivados,

principalmente quesos. En este sentido, tiene gran importancia la riqueza en materia grasa y en proteínas, ya que están correlacionadas con el rendimiento quesero (Kg. de queso/l. de leche), siendo r = 0.7-0.8 para la grasa y r = 0.6-0.7 para las proteínas totales (Caja, 1978).

Al comparar los valores medios de composición de leche de oveja con los de

vaca y cabra, se observa que la primera presenta como promedio, dos veces mayor cantidad en grasa y casi el doble en Nitrógeno total. Así mismo, el contenido medio en materia seca se sitúa en torno al 19%, indicando una elevada concentración de este componente con respecto a otras leches de consumo. Este extracto seco está constituido, a su vez, por un 7.5% de materia grasa, un 4.4% de lactosa, un 6.0% de materias nitrogenadas, y un residuo mineral que oscila alrededor del 1% (Alais, 1970; Molina, 1987).

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Con respecto a las razas españolas, la calidad de la leche en cuanto a composición es uno de los puntos menos estudiados y que, sin embargo, pueden tener una mayor importancia en el futuro.

La leche de oveja en España presenta una buena aptitud para su

transformación en queso con respecto a su composición, aunque sea aún deficiente en cuanto al grado de calidad microbiológica, o de temperatura y acidez a la hora de su entrega (Caja, 1991; Montoro & Angulo, 1991).

Materias grasas.

La cantidad de materia grasa contenida en la leche se indica frecuentemente con el término de "tasa butírica" (TB). Con este término se sobreentiende el conjunto de sustancias lipídicas que, por hidrólisis de los ésteres, dan lugar a ácidos grasos. La TB varía mucho en función de la especie, siendo para ganado ovino de 7.19%, mientras que presenta un porcentaje muy inferior para ganado vacuno (3.87%) y para caprino (3.38%) (Goursaud, 1991). La composición global de la materia grasa en rumiantes (oveja, cabra y vaca) es muy semejante, presentando tres tipos de sustancias: triglicéridos (98.0%), fosfolípidos (0.5%) y otras sustancias liposolubles (1.0%)

Sin embargo, la grasa de los distintos tipos de leche presenta ciertas

constantes físicas y químicas que permiten caracterizarlas. De todos ellos, el más característico es, sin duda, el Indice de Polenske que indica la proporción de ácidos grasos volátiles insolubles, ya que su valor medio (5.3) es prácticamente el doble del obtenido para leche de vaca (2.75) (Assenat, 1991). Además, el color de la grasa de leche de oveja es característicamente blanco, debido a la práctica ausencia de carotenos, al contrario de lo que ocurre en leche de vaca (Laxminarayana et al., 1968). El diámetro medio de sus glóbulos grasos es netamente menor (3.30µ) que en vaca (4.55µ), aunque más similar al de cabra (3.49µ) (Parkash & Jennes, 1968).

Como comentamos anteriormente, la fracción mayoritaria en la grasa de

leche de oveja es la de los triglicéridos (98%). Su composición en la leche es específica para cada especie animal y, según Rotaboul (1981), la grasa de oveja presenta menor proporción de triglicéridos de cadena larga y mayor proporción de cadena corta que la grasa de vaca, destacando un elevado contenido en ácidos grasos saturados de 6 a 12 átomos de Carbono (ácidos cáprico caprílico)y una baja proporción en ácido mirístico (C14:0) y palmítico (C16:0). Con respecto al contenido en fosfolípidos, Baliga & Basu (1955) señalan que, en la leche de oveja, el 30.8% correspondería a lecitinas, el 45.0% a cefalinas y el 24.2% a esfingomielinas. En cuanto al contenido en colesterol, Wholt et al. (1981) encuentran un valor medio de 60 mg/100 g en la leche de oveja.

Por último, cabe destacar que la materia grasa de la leche es responsable de

algunos sabores y aromas de los productos fabricados con ella. En este sentido se puede afirmar que la leche de oveja es sensible a la lipolisis espontánea, como consecuencia de una alta concentración del enzima lipasa que, junto a la específica composición en lípidos de esta leche, confiere a los productos fabricados con ella unas características específicas de olor y sabor (Molina, 1987).

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Compuestos nitrogenados. En la leche se pueden distinguir dos grupos de compuestos nitrogenados:

las proteínas y las sustancias nitrogenadas no proteicas, también denominadas Nitrógeno no proteico (NNP) que, en general, representan el 95% y el 5% del Nitrógeno total, respectivamente. El NNP varía entre un 3.0% y un 7.0% del Nitrógeno total y la urea, componente mayoritario de esta fracción, varía del 36.0 al 80.0% , debido a que su contenido está fuertemente influenciado por el aporte alimenticio (Goursaud, 1991).

Las proteínas de la leche se diferencian del NNP por el tamaño de sus

moléculas, formadas por uniones complejas de aminoácidos y cuyas masas moleculares van de 12.000 hasta 380.000 Da. (Ribadeau-Dumas, 1988). En la leche se presentan en dos fases distintas:

- Fase micelar inestable: constituída por las caseínas, que se encuentran formando una estructura micelar (complejo orgánico de caseínas unidas a (PO4)2Ca3 coloidal). - Fase soluble estable: formada por diferentes polímeros proteicos hidrófilos que constituyen las proteínas solubles o proteínas del lactosuero. La leche de oveja presenta una relación relativamente baja en NNP

(aproximadamente del 5%), resultando una proporción de proteínas/materias nitrogenadas totales en torno al 95% .

La cantidad de proteínas contenida en la leche (tasa proteica) es una

característica esencial de su valor comercial, tecnológico y biológico. Además, cuanto mayor sea esta cantidad en la leche cruda, mayor será el rendimiento en la transformación tecnológica (Goursaud & Quinque, 1980). El valor medio de la tasa proteica en leche de oveja (55.15 g/Kg) es prácticamente el doble al de vaca o cabra, lo que confirma la buena aptitud quesera de este tipo de leche.

La fracción proteica más importante tanto cualitativa como

cuantitativamente, por cuanto determina el valor quesero de la leche de oveja, es la caseína, que representa en torno al 82.0-83.0% de la proteína total (Brochet, 1982).

Una cuestión de gran importancia en relación con el contenido en caseína es

la determinación de sus diferentes fracciones ya que algunas de estas, en particular la ß-Cn y la k-Cn, pueden hacer disminuir el rendimiento quesero al aparecer en una mayor proporción que otras fracciones en la caseína soluble (Molina, 1987).

El porcentaje de caseínas αs es claramente más elevado en la leche de oveja

que en la leche de cabra (30.2% frente al 12.6%), pero significativamente más bajo que en la leche de vaca (45.5%). Este bajo contenido en caseínas del grupo αs podría ser la causa, al igual que en caprino, de la ausencia de sabores amargos en quesos elaborados con leche de oveja, en contraposición a lo que sucede con los de leche de vaca (Assenat, 1991).

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Las proteínas solubles de leche de oveja (α-lactalbúminas, ß-lactoglobulinas, Inmunoglobulinas y Proteosas-peptonas) representan el 17.6% del total de proteínas. Este porcentaje, relativamente alto, indica que el lactosuero de oveja es especialmente rico en proteínas por lo que, sometido a procesos de termocoagulación, se utiliza frecuentemente en la fabricación de productos derivados (requesón, bruccio y ricotta) (Molina, 1987).

En el lactosuero de leche de oveja se observa que la ß-lactoglobulina es la

proteína mayoritaria (51.4%), representando el grupo de las albúminas (α-lactalbúmina, ß-lactoglobulina y albúmina sérica) el 76.5% del contenido total de las proteínas solubles. Esta distribución es semejante a la citada para leche de vaca por Alais (1970).

Un aspecto de interés económico y nutricional del lactosuero de oveja es la

relación entre Nitrógeno total y extracto seco, relación que es claramente más elevada que en lactosuero de vaca, de tal manera que el contenido en proteínas del lactosuero de oveja en polvo es casi doble que en vaca (Assenat, 1991).

Con respecto a los componentes proteicos minoritarios del lactosuero, cabe

destacar que las proteosas-peptonas son péptidos que provienen de la proteolisis de la ß-lactoglobulina por la plasmina y que las Inmunoglobulinas, al igual que la albúmina sérica, no son proteínas específicas de la secrección láctea , sino que son transportadas por la sangre a todos los fluídos del organismo.

Glúcidos.

Los glúcidos de la leche están esencialmente representados por la lactosa, uno de los componentes mayoritarios del extracto seco total, cuyo valor medio. En leche de oveja, se sitúa en torno al 4.44%, y su intervalo de variación oscila entre el 3.70 y el 5.01% (Molina, 1987).

Según Assenat (1991), la tasa media de lactosa de la leche de oveja es un

poco inferior (22-27% del extracto seco total) a la de leche de vaca (33-40%). Sin embargo, este hecho no es un inconveniente en la práctica quesera, ya que la lactosa tiene un valor alimentario y tecnológico relativo y su contenido en leche de oveja es más que suficiente para asegurar las fermentaciones lácticas.

Otros componentes.

La cantidad de sales y minerales de la leche se determina por incineración en horno-mufla, aunque esta determinación no da una idea exacta de los componentes minerales en su estado original puesto que, durante la calcinación, se destruye o se transforma un cierto porcentaje de sales, dando como resultado un contenido en cenizas inferior al contenido real de sales de la leche (Molina, 1987).

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Las sales se encuentran en la leche tanto disueltas (moléculas e iones) como en estado coloidal. La mayoría son de tipo mineral (fosfato de calcio), aunque también existen sales de tipo orgánico cuya fracción aniónica suele ser el citrato, siendo el catión siempre de origen mineral (Gorsaud, 1991).

Con respecto a los citratos, las tasas medias observadas en leche de oveja

son algo mas elevadas que en las de vaca o cabra (2.00 g/Kg, 1.70 g/Kg y 1.10 g/Kg, respectivamente) (Kanar et al., 1971).

Según Molina (1987), la leche de oveja es especialmente pobre en hierro,

selenio y cobre, lo que da origen a ciertas enfermedades carenciales en el cordero lactante (anemia ferropénica, miodistrofia y ataxia enzoótica respectivamente).

El fósforo y el calcio desempeñan un papel fundamental en el

mantenimiento de la estabilidad y estado físico de las proteínas de la leche, al estar asociados a la micela de caseína. La fracción coloidal de las sales de calcio y fósforo es la mas abundante en la leche de oveja, representando entre el 75-91% del calcio total y entre el 61-70% del fósforo total (Holt & Jennes, 1984; Polychroniadou & Vafopoulou, 1986).

En general, las formas solubles y coloidales de las materias salinas de la

leche se encuentran en un equilibrio muy frágil que puede ser alterado fácilmente por numerosos tratamientos tecnológicos (acidificación, calentamiento) (Veisseyre, 1988).

En relación con las vitaminas existentes en la leche, su composición ha sido

escasamente estudiada en leche de oveja. Cabe destacar que este tipo de leche presenta cantidades importantes de vitamina A (1.460 UI/l), riboflavina (3.82 mg/l) y ácido pantoténico (3.64 mg/l), así como ausencia de vitamina D y de vitamina B6.

En condiciones normales, la leche contiene una gran variedad de enzimas.

Sin embargo, la distinción entre los componentes nativos y los procedentes de aportes extraños no es fácil, ya que la leche contiene células (leucocitos, microorganismos) que elaboran sus propios enzimas. La mayoría de los enzimas presentes en la leche pertenecen a las oxido-reductasas, transferasas e hidrolasas. Según Boudier (1991), estas sustancias juegan un papel importante en la leche por varios motivos:

- Son factores de degradación de los constituyentes originales de la leche, induciendo modificaciones en el plano tecnológico (pérdida de rendimiento) y sobre las cualidades organolépticas de los productos transformados (malos sabores). En esta categoría se encuentran las lipasas y proteasas.

- Algunos tienen actividad antibacteriana (lactoperoxidasa y lisozima), aportando una limitada protección a la leche.

- Otros enzimas se pueden utilizar como indicadores de la calidad higiénica (catalasas), ya que los leucocitos y algunos gérmenes aumentan las cantidades de enzimas presentes en la leche; de tratamiento térmico (fosfatasa alcalina, oxidasa), debido a su termosensibilidad; y de especie, ya que las leches de diferentes especies no contienen los mismos enzimas.

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Factores de variación en la producción y composición de la leche.

La producción y composición de leche pueden verse afectadas por un amplio

conjunto de factores que ejercen su acción durante cada uno de los ciclos productivos del animal. Así, los valores adoptados de forma general deben considerarse como valores medios orientativos, y la leche así constituida, como leche estándar o de referencia (Molina, 1987).

Existe un gran número de factores que pueden influir sobre la cantidad y la

calidad de la leche producida, ya sea sólo sobre uno de estos aspectos o sobre ambos simultáneamente que, de modo general, se pueden dividir en dos tipos: - Factores intrínsecos: que dependen directamente del animal y no pueden ser modificados fácilmente.

- Factores extrínsecos: que pueden modificarse, mediante prácticas de manejo, por la acción del hombre. . Factores intrínsecos.

a/ Genotipo y potencial reproductivo. Efecto raza. En general, es un hecho conocido la existencia de grandes diferencias en

cuanto a cantidad y composición de la leche producida por distintas razas ovinas sometidas a ordeño. Aunque gran parte de estas diferencias se pueden atribuir a efectos del medio, hay una parte importante que se debe a efectos genéticos. Según molina (1987), se considera "potencial genético" de una raza para la producción de leche,a la cantidad que es capaz de producir cuando su genotipo se manifiesta en óptimas condiciones ambienta- les.

b/ Estado de lactación. La producción diaria de leche de oveja evoluciona a lo largo de la lactación

siguiendo una curva que alcanza su máximo en las primeras semanas después del parto, para disminuir a continuación de forma más o menos acusada, hasta el secado. Los principales componentes de la leche de oveja también varían a medida que avanza la lactación, siguiendo una curva similar a la de producción, pero de sentido inverso, de modo que ambas curvas son casi simétricas, coincidiendo el máximo de producción con el mínimo de composición (Gallego,1991).

c/ Edad y número de lactación. Según Purroy (1982), las ovejas aumentan de forma considerable su

producción lechera de la 1ª a la 2ª lactación, algo menos de la 2ª a la 3ª, y se estabilizan a partir de la 3ª o 4ª lactación hasta la 6ª-8ª, momento en el cual la producción comienza a decrecer.

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En ovejas Manchegas, este aumento es de alrededor de un 38% entre la 1ª y la 5ª lactación, a partir de la cual se produce un descenso de la producción (Gallego, 1991).

La edad al primer parto también puede influir sobre la producción de leche,

aumentando esta última a medida que el parto se produce a una edad más avan- zada. Este efecto puede mantenerse hasta el 2º parto, desapareciendo prácticamente a partir del 3º,y es consecuencia de la coincidencia en el tiempo de dos periodos de altas necesidades alimenticias, como son el crecimiento y el ordeño (Gallego, 1991).

d/ Tipo de parto. Este efecto se manifiesta más a través del número de corderos

amamantados que del número de corderos nacidos. Así, las ovejas que crían un cordero producen menos leche que aquellas que amamantaban dos o más (Molina, 1987). Esto se debe a que la tetada imultánea de dos o más corderos induce un mayor reflejo nervioso y descarga hormonal, lo que provoca un vaciado más completo de la ubre, traduciéndo- se en una mayor síntesis de leche (Gallego, 1991).

e/ Anatomía y morfología de la ubre. Los principales factores anatómicos que influyen n la aptitud al ordeño de

las ovejas son el tamaño de la ubre, el tamaño de las cisternas y las características de los pezones. Generalmente se admite que, a mayor volumen de la ubre, corresponde una mayor producción láctea (Gallego, 1991).

Factores extrínsecos.

a/ Relaciones madre-cría y destete. La oveja está considerada como un animal de ordeño de tipo "primitivo", es

decir que su leche resulta difícilmente extraíble en el ordeño, y que su liberación está muy condicionada por la presencia de la cría (Molina, 1987).

El destete provoca un descenso en la producción de leche debido al stress

originado por la separación de madre y cría, así como por la existencia de una fase de adaptación de la oveja al ordeño. Esta reducción ha sido evaluada en un 30-40% para la raza Manchega, porcentaje que se recupera una vez superado el periodo de adaptación de la oveja al ordeño (Caja, 1990).

b/ Método e intervalo de ordeño. El ordeño tiene una gran importancia en la cantidad y composición de la

leche producida puesto que la extracción de leche es necesaria para el manteni- miento de la lactación.

En ganado ovino, la síntesis de la leche en la ubre se ve disminuída

cuando el periodo entre ordeños es superior a las 16 horas, inhibiéndose a partir de las 24 horas (Molina, 1987).

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En algunas ocasiones se ha indicado que el ordeño mecánico, en comparación con el ordeño manual, produce un vaciado incompleto de la ubre de la oveja, haciendo disminuir la cantidad y calidad de la leche ordeñada. Sin embargo, Gallego (1991) pone de manifiesto que sólo se perjudica la composición en grasa de la leche, que queda reducida en un porcentaje variable según se realice o no el repaso manual.

La mayor diferencia observable entre el ordeño mecánico y el manual se

refiere al contenido microbiológico de la leche, en donde la intervención de las manos del ordeñador aumenta el número de gérmenes casi en un 50% (Gallego, 1991).

c/ Alimentación. Según Molina (1987), es el más importante de todos los factores

extrínsecos que afectan a la lactación, ya que con ella se cubren las necesidades de conservación y producción, y se reconstituyen las reservas corporales.

La influencia de la alimentación sobre la producción de leche se manifiesta

en el último tercio de la gestación (aumento de las reservas que se movilizarán durante la lactación) y, obviamente, durante el periodo de lactación (cobertura de necesida- des). En este sentido, alimentación y producción de leche están íntimamente relacionadas ya que, para que una oveja desarrolle todo su potencial productivo es necesario suministrarle una ración completa y equilibrada.

La alimentación afecta en mucha mayor medida a la producción que a la

composición láctea y, de esta última, casi exclusivamente a la fracción grasa.

Variación en la composición. Se observa una correlación negativa entre la producción total de leche y los

porcentajes relativos de materias grasa y de proteína.

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Concepto de calidad de leche. Es difícil definir el concepto de calidad, ya que es el consumidor final el que,

en definitiva, decide la validez o no de un determinado producto. Además, este juicio se basa a menudo en factores que no pueden calibrarse de una manera objetiva. Según Esteban (1991), se puede intentar definir la calidad de la leche y de los productos lácteos como "su capacidad para satisfacer las expectativas del consumidor".

Además, se han desarrollado una serie de métodos objetivos destinados a

determinar la calidad de la leche, según sean sus características y propiedades. De este modo, se puede hablar de:

- Calidad química o de composición: que incluye parámetros como porcentajes de grasa, proteína, lactosa, calcio, etc; pH (capacidad tampón) y detección de sustancias extrañas (antibióticos, pesticidas, sangre y gases). - Calidad física: sobre la que influyen propiedades de la leche tales como densidad, viscosidad, conductividad, puntos de ebullición y congelación, estabilidad al calor y al alcohol y características tecnológicas (rendimiento).

- Calidad bacteriológica: se establecería de acuerdo al número total de bacterias, patógenos, productores de ácido láctico, psicotrofos, formas coli, formadores de esporas y contenido en células somáticas. - Propiedades organolépticas: olor, sabor, textura y color.

Los criterios de valoración utilizados en España son muy distintos,

dependiendo de la zona productora, sin que se pueda hablar de un único concepto de calidad. En general, el pago por calidad ha sido más utilizado en Castilla-La Mancha que en Castilla-León o en el País Vasco, dependiendo fundamentalmente de las relaciones productor-comprador y del tipo de industria quesera que se tratara (industrial o artesana).

Tradicionalmente, y en las queserías artesanales, sólo se controlaba la acidez

de la leche o su contenido en agua, pagando la leche por un precio único según la cantidad total aceptada. Esta situación está cambiando y, en la actualidad, aunque aún están poco desarrollados, se han establecido criterios de calidad de la leche en función de su contenido en extracto seco y grasa bruta o, menos frecuentemente, según su carga microbiana (recuento total de bacterias) o su contenido en proteína bruta.

En general, los criterios de calidad predominantes en el sector ovino español

corresponden a aquellos que tienden a aumentar los rendimientos de transformación industrial y que hacen disminuir los riesgos sanitarios mayores, sin que exista un atento control sobre otros parámetros (Caja & Such, 1991).

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En los casos de pagos de leche por calidad se tiende actualmente a la formalización de acuerdos interprofesionales y de "contratos-tipo" homologados, de carácter anual y publicación en el B.O.E. (Caja & Such, 1991), en los que la calidad queda determinada por:

- La composición química de la leche ( grasa, extracto seco y proteína). - La carga microbiana (contenido total de células y de colonias o gérmenes) y la acidez de la leche (grados Dornic). - La oferta estacional de la leche (se prima la leche producida entre Julio y Febrero, durante los cuales la producción nacional es reducida). - La raza ovina y la zona de producción-recogida (en particular, en el caso de los quesos con Denominación de Origen). La práctica totalidad de la producción de leche de oveja se destina a la

elaboración de queso (99.44% en 1990) y, de esta cantidad, aproximadamente un 15% se utiliza en la fabricación de queso con Denominación de Origen. Así, los principales criterios establecidos en relación a la calidad de leche de oveja derivan de lo establecido en los Reglamentos de cada Denominación de Origen.

Sin embargo, en la campaña de 1989, se estableció por primera vez un acuerdo

interprofesional según el cual el pago de la leche había de realizarse en base a los siguientes criterios de calidad (Guillou, 1989):

- "Grado" o punto de porcentaje de grasa bruta - Prima de estacionalidad: variable dependiendo de la época de ordeño. - Prima por producción en Denominación de Origen . De este contrato-tipo se desprende que la proteína está aún escasamente

valorada en el pago por calidad de la leche de oveja, dada su mayor complejidad y coste de análisis, pese a afectar en mayor medida (aproximadamente el doble) que la grasa al rendimiento quesero (Caja, 1991).

En cuanto a la evolución de la calidad de este tipo de leche, Caja & Such

(1991) señalan que, en el futuro, debe esperarse una inevitable reducción de la calidad analítica, estimada a partir de los valores medios de composición química (grasa y proteína principalmente). Ello es debido a la mejora de las condiciones de explotación y a la elevación de los niveles de producción, tanto a nivel de los animales como de las explotaciones, lo que hace descender los contenidos relativos de grasa y proteína. En la actualidad, en los países con razas ovinas en las que la elevación de la producción de leche ha comprometido su calidad, ya se han iniciado programas de mejora por la composición en grasa y, más especialmente, en proteína (Guillouet & Barillet, 1991).

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Aptitud quesera.

La composición media de la leche de oveja, tal como ha sido expuesta

anteriormente, da a entender la posibilidad de un rendimiento quesero más importante que el que cabría esperar con las leches de vaca y de cabra. La práctica normal de la quesería demuestra que, con una misma cantidad de leche, se obtiene dos veces más queso con leche de oveja que con leche de vaca (Assenat, 1991).

Las tasas de recuperación de los elementos queseros (materia grasa y

compuestos nitrogenados) son parámetros habituales para apreciar el rendimiento quesero de la leche. Brochet (1982) ha obtenido, como valor medio del contenido de proteínas coagulables en relación al contenido de Nitrógeno total, la cifra del 74.8% . Expresado con respecto al contenido de proteínas totales, este valor aumenta hasta el 78.5% .

Estas tasas de recuperación varían en función del tipo de fabricación. Así, en

la fabricación de queso Roquefort, la tasa de recuperación de compuestos nitrogenados totales es del orden del 75%, y la de materia grasa de un 93%.

Para el queso Manchego, el Reglamento de su Denominación de Origen

(1984) exige un extracto seco mínimo del 55% y un porcentaje de grasa mínimo del 50% sobre el extracto seco total, sin hacer referencia expresa acerca del porcentaje mínimo exigible de proteína.

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Variabilidad genética de las proteínas lácteas.

1.- Caseínas Como ya hemos señalado en anteriores apartados, la fracción proteica de la

leche difiere de una especie a otra tanto cualitativa como cuantitativamente Esta fracción se divide en dos tipos principales de proteínas: las caseínas, que

coagulan a pH 4.6, y las proteínas del lactosuero, que permanecen en el sobrenadante. Las caseínas, cuya cantidad es cercana al 80% en leche de vaca, y en torno al

83% en leche de oveja, sufren una fosforilación en el Aparato de Golgi de las células del epitelio mamario cuando se estructuran, por medio de puentes de calcio, como copolímeros gandes y estables denominados micelas. Como veremos posteriormente, la k-Cn juega un papel principal en la estabilidad de la micela caseínica, al evitar la precipitación de las otras caseínas (αs-Cn y ß-Cn) por el Calcio.

La función de las caseínas es proporcionar a la progenie una fuente de

aminoácidos, fosfato, calcio y, posiblemente, de péptidos biológicamente activos. Además, son la materia prima para realizar los procesos clásicos de manofactura en la industria quesera (Mercier et al., 1990).

Las principales proteínas del lactosuero son la ß-lactoglobulina, un posible

transportador de moléculas hidrofóbicas como el retinol (Hambling et al., 1992) y la α-lactoalbúmina, que está involucrada en la síntesis de la lactosa (Brew & Grobler, 1992).

La estructura, secuencia de aminoácidos, características fisico-químicas, etc.

de las proteínas lácteas ha sido ampliamente estudiada en rumiantes, fundamentalmente en ganado vacuno (Swaisgood, 1992; Hambling et al., 1992; Brew & Grobler, 1992), así como las diferencias estructurales de un gran número de variantes genéticas. Las técnicas de electroforesis en gel se han utilizado profusamente para revelar la identidad de distintos tipos de caseínas y de proteínas del lactosuero, y para establecer la presencia de proteínas homólogas en distintas especies: vacuno (Aschaffenburg, 1968; Thompson, 1970; Thompson & Farrell, 1974; Baker & Manwell, 1980; Ng-Kwai-Hang, 1992); ovino (King, 1969; Erhardt, 1989; López-Gálvez et al., 1990); caprino (Casu et al., 1989; DiStasio et al., 1990; Serradilla et al., 1992).

Hace 40 años, Aschaffenburg y Drewry (1955) descubrieron, en ganado

vacuno, dos formas distintas de la ß-lactoglobulina que se diferenciaban en su composición, en sus pesos moleculares y en sus propiedades. Se trataba de dos formas genéticas de la misma proteína, es decir, de dos variantes cuya síntesis estaba regida por el gen original en una de las formas, y por el mismo gen, que había sufrido una ligera mutación, en la segunda forma.

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De modo general, las variantes de las proteínas lácteas sólo se distinguen por mínimas diferencias, debidas a sustituciones o deleciones de alguno de los aminoácidos que las componen. Estos cambios entrañan una modificación de la carga neta de la proteína, de tal modo que pueden ser separadas por electroforesis. Los progresos en las técnicas electroforéticas han podido revelar un número de variantes cada vez mayor para cada una de las principales proteínas de la leche (Laloux & Erhardt, 1990).

Estas técnicas se han utilizado para revelar la identidad de los distintos tipos

de caseínas y de proteínas del lactosuero, y para establecer la presencia de proteínas homólogas en las distintas especies. Así, el descubrimiento realizado por Aschaffenburg & Drewry en 1955, fué el inicio de una investigación muy activa en el campo del polimorfismo genético de las proteínas lácteas, en muchos países.

Aunque se han publicado muchos trabajos sobre la aparición de polimorfismo

en las principales proteínas lácteas, se debe hacer una distinción entre el polimorfismo genético, que se debe a una mutación que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína, y el polimorfismo que se debe a una modificación post-transcripcional, como puede ser el grado de fosforilación o de glicosilación de esta proteína (Ng-Kwai-Hang & Grosclaude, 1992).

La mayor parte de la investigación desarrollada en este campo se ha realizado

en la especie bovina, obviamente por razones de tipo económico.

Caseínas. Las caseínas son fosfoproteínas específicas de la leche cuyos grupos fosfato

se localizan sobre residuos de Serina o de Treonina. A diferencia de muchas proteínas globulares típicas, como son las proteínas

del lactosuero, las caseínas no se presentan en la leche como estructuras moleculares individuales, sino como grandes complejos proteicos de forma esférica que incorporan un 92% de proteínas y un 8% de sales inorgánicas (Cuadro 3), fundamentalmente Fosfato Cálcico (Schmidt, 1980). Así, su estructura "nativa" es, de hecho, un complejo proteico, resultado de la interacción de los distintos tipos de caseínas individuales (αs-, ß- y k-Cn), que se denomina micela caseínica (Swaisgood, 1992).

Las propiedades tecnológicas de la leche están fuertemente influenciadas por

la estabilidad de las micelas de caseína, cuya estructura ha sido objeto de numerosas investigaciones.

En 1965, Wangh y Noble emitieron una hipótesis basada en el mayor

contenido en k-Cn de las micelas de menor tamaño. Según estos autores, la micela estaría constituída por una capa periférica de αs1-Cn y ß-Cn. Esta estructura, considerada rígida, estaría justificada por el hecho de que el cuajo sólo ataca la k-Cn que, por tanto, debería encontrarse en la superficie para poder ser modificada por el enzima. Además, la ß-lg reacciona con la k-Cn durante el calentamiento de la leche y se fija sobre la micela.

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Sería difícil, por tanto, que una molécula de gran tamaño, como es la ß-lag pudiera penetrar en el interior de una micela rígida y compacta, lo que apoya la hipótesis de la situación de la k-Cn en la periferia de la micela.

Sin embargo, Ribadeau-Dumas y Garnier (1969), demostraron

posteriormente que todas las caseínas presentes en las micelas son accesibles para la Carboxipeptidasa A, una molécula de gran tamaño, con un peso molecular de 34.000 Da. En estas condiciones no se podía seguir atribuyendo a la micela una estructura rígida y compacta, sino que ésta presentaría una organización alveolar y esponjosa que explicaría la penetración de moléculas de gran tamaño. Por otra parte, la gran hidratación de la micela caseínica (75% de agua en volumen) es un factor que corrobora esta hipótesis.

En la actualidad se acepta que las micelas están compuestas por submicelas

esféricas de entre 10 y 15 nm. de diámetro y que poseen una estructura porosa. Según Schmidt (1982), la micela estaría formada por un conjunto de subunidades, de naturaleza proteica, que se asocian entre sí a través de elementos minerales (Ca, Mg y Fosfato) .

La composición de las subunidades no es uniforme sino que éstas poseen un

interior de naturaleza hidrofóbica, formado por las partes apolares de las caseínas, y una cubierta, de naturaleza polar, formada por los segmentos altamente cargados con residuos de fosfoserina de las caseínas αs1, αs2 y ß. por una parte, y con la cadena COOH- terminal de la k-Cn.

Estas subunidades se unen entre sí a través de Ca y Fosfato mineral

constituyendo la micela de caseína, cuya estructura tampoco es uniforme ya que la proporción relativa de las distintas caseínas, y especialmente de la k-Cn varía dentro de cada submicela. El área superficial de la micela estaría ocupada por subunidades ricas en k-Cn, que carece de radicales de fijación de grupos fosfato y que, por tanto, limitarían de forma natural el crecimiento de la micela. Las submicelas con bajo contenido en k-Cn, o que carecen de ésta,

se localizan en el interior de la micela, cuya naturaleza es hidrófoba . Este modelo de estructura responde bien a las características conocidas de la

micela caseínica y a su comportamiento, y da una respuesta satisfactoria a las relaciones entre las dimensiones de las micelas, su carga mineral y su riqueza en k-Cn. En efecto, se ha podido demostrar que las micelas de mayor tamaño son más ricas en Fosfato Cálcico y las pequeñas en k-Cn (Dalgleish et al., 1989).

Así mismo, explica la gran variación existente en cuanto al tamaño de las

micelas (30-300 nm.), formadas por un número de submicelas que puede variar entre 100 y 1.000. Además, la localización superficial de la k-Cn queda apoyada por el hecho demostrado por Brule y Lenoir (1990) de que la quimosina inmovilizada y, en consecuencia, incapaz de penetrar en la micela, hidroliza la casi totalidad de la proteína.

Las micelas de caseína presentan una gran estabilidad, siendo capaces de

soportar largos periodos de conservación y tratamientos térmicos o mecánicos relativamente severos.

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Esta estabilidad se debe, en primer lugar, a su carga eléctrica neta, que es

negativa debido a su carácter ácido, por lo que se crean repulsiones electrostáticas que se oponen a la aproximación entre las micelas y, en consecuencia, a su agregación, contribuyendo al mantenimiento de la dispersión micelar a pesar de la alta densidad de población y de la escasa distancia entre las micelas (Pearce, 1976).

En segundo lugar interviene el grado de hidratación de la micela, ya que

parte de la gran cantidad de agua que fija la micela es inmovilizada en su superficie formando una envuelta que la protege y le da estabilidad (Payens, 1979; Brule & Lenoir, 1990).

Estos dos factores primarios de la estabilidad de la micela dependen a su vez

de diversos factores secundarios: unos ligados a la composición salina de la fase acuosa (concentración de iones H+, Ca++, fosfato, citrato) y otros que dependen de la misma composición micelar (proporciones relativas de caseínas, en especial de la k-Cn, contenido en Fosfato de Calcio). De aquí se deduce que determinados factores que intervienen a nivel de la micela y/o de su entorno pueden ser el origen de la desestabilización de la micela, lo que da lugar a la coagulación de la leche (Brule & Lenoir, 1990).

La coagulación de la leche es el proceso por el cual se producen

modificaciones físico-químicas en las micelas de caseínas bajo la acción de enzimas proteolíticos o de ácido láctico y que determina la formación de un entramado proteico denominado coágulo o gel.

La acidificación de la leche por adición de un ácido determina la floculación

de las caseínas, a pH 4.6, en forma de un precipitado granuloso que se separa del lactosuero. La coagulación ácida de la leche se produce porque el descenso de pH hace disminuir la ionización de los radicales ácidos de las caseínas y aumenta la solubilidad de las sales cálcicas, dando como resultado un desplazamiento progresivo del Calcio y el Fosfato inorgánico de la micela hacia la fase acuosa, produciéndose una desmineralización de las micelas que se ve acompañada de una desintegración de éstas.

La coagulación enzimática de la leche determina, por el contrario, una

acidificación progresiva que da lugar a la formación de un coágulo liso, homogéneo y que ocupa totalmente el volumen inicial de la leche. Según Garnier (1963) y Alais & Lagrange (1972), la coagulación de la leche por el cuajo ocurre en dos fases:

- Fase primaria, enzimática, durante la cual el cuajo ataca al componente

estabilizante de la micela, la k-Cn, liberándose un péptido denominado casein-macropéptido.

- Fase secundaria, que es la fase de coagulación en sí y que corresponde a la formación del gel por asociación de las micelas que han sido modificadas previamente por la acción del enzima.

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Durante la fase enzimática se produce la hidrólisis de k-Cn, en el enlace Phe105-Met106 (Garnier et al., 1968), de modo que la k-Cn queda cortada en dos segmentos desiguales: el segmento1-105, que corresponde a la para-k-caseína y el 106-169, que se denomina caseinmacropéptido.

La para-k-caseína, ligada a las caseínas αS- y ß-, permanece integrada dentro

de la micela, mientras que el caseinmacropéptido, que contiene todos los radicales glucídicos presentes en la molécula de k-Cn, pasa al lactosuero.

La fase secundaria de la coagulación enzimática presenta un mecanismo

poco conocido. Se puede destacar que la liberación del caseinmacropéptido y su paso al suero determina una disminución importante de la carga de las micelas y, posiblemente también, su grado de hidratación. Los dos factores de estabilidad se ven entonces afectados y se podrían establecer, en esta nueva situación, enlaces intermicelares que conducirían a la formación del gel (Payens, 1979).

Con respecto a las micelas de caseína ovinas, fueron estudiadas por Ohno et

al. (1989), por cromatografía de alta resolución (HPGC). Comparando los patrones de elución con los de las caseínas bovinas obtenidos en un trabajo anterior (Ohno et al., 1983) observaron que los tres picos de retención de las caseínas de ovino eran similares a los de vacuno y que, por tanto, correspondían a los complejos αs1-k-, αs1-ß- y αs1- caseína.

Como hemos señalado a lo largo de este capítulo, las caseínas son el

componente proteico más abundante en la leche y se definen como las fosfoproteínas lácteas que precipitan por acidificación de la leche a pH 4.6 y a 200C (Jennes et al., 1956).

Los distintos tipos de caseínas se diferencian por su movilidad electroforética

en geles de almidón o poliacrilamida con urea (Swaissgood, 1975). La considerable heterogeneidad que presentan se debe a la variación genética, a su grado de fosforilación y/o de glicosilación y al grado de proteolisis.

Según la homología de su estructura primaria, las caseínas se clasifican en 4

tipos distintos: αS1-Cn, αS2-Cn, ß-Cn y k-Cn (Eigel et al., 1984) y, en general, todas presentan variantes genéticas que se transmiten por herencia Mendeliana simple, sin dominancia. Estas variantes han sido detectadas normanlmente por electroforesis, ya que la sustitución o deleción de aminoácidos ha dado lugar a un cambio en la carga eléctrica de su molécula (McLean, 1987). Como se expondrá a continuación, el polimorfismo bioquímico de las distintas fracciones caseínicas se encuentra claramente determinado en ganado bovino. Sin embargo, a pesar de que en ganado ovino se han identificado los 4 tipos principales de caseínas así como algunas de sus variantes genéticas, no existe una nomenclatura clara a este respecto (Serradilla et al., 1992).

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AlfaS-caseínas (αS1-Cn y αS2-Cn). La estructura primaria de la αs1-Cn bovina fué elucidada en 1971 (Mercier

et al., 1971). Está formada por una cadena peptídica simple con 199 residuos que no contienen Cisteína o Cistina, y su peso molecular es de 23.000 D. Su forma principal en leche de vaca contiene 8 grupos fosfato unidos a residuos de Serina, lo que le da una gran sensibilidad al Calcio. En presencia de este elemento, la αs-Cn es insoluble en leche y se encuentra estabilizada por la presencia de k-Cn.

En su molécula se distinguen tres regiones hidrofóbicas (secuencias 1-44;

90-113 y 132-199). La secuencia 47-77 contiene residuos de Serina unidos a grupos fosfato, 8 residuos de Glutámico y 3 ASP, que hacen que presente una carga neta negativa muy alta al pH de la leche. El resto de la molécula no presenta carga neta a ese pH. Se considera que la αs1-Cn es la proteína que presenta mayor carga al pH de la leche y, con excepción de la αs2-Cn, la menos hidrofóbica entre las caseínas.

En 1984, dos grupos de investigadores determinaron, de modo

independiente, la secuencia del ADNc de la αs1-Cn bovina (Nagao et al., 19884; Stewart et al., 1984). La secuencia proteica correspondiente era idéntica a la determinada anteriormente, con la excepción del residuo 30, determinado en principio como Glicina, que en realidad corresponde a Glutámico.

La αs1-Cn muestra una progresiva autoasociación en dímeros, tetrámeros,

hexámeros, etc. que depende en gran medida de del pH y de la fuerza iónica de la solución. Con una fuerza iónica baja (0.003-0.01 M), y a pH neutro o alcalino, la molécula aparece como monómero (Schmidt, 1970), y la autoasociación comienza al aumentar la fuerza iónica, y es pH-dependiente en el sentido de que un aumento del pH reduce el grado de asociación. La temperatura apenas tiene efecto sobre este fenómeno (Rollema & Brinkhuis, 1989).

Tanto la estructura primaria de esta proteína como sus propiedades fisico-

químicas confirman una estructura anfipática compuesta por una zona hidrofóbica y una zona polar. Ambas zonas muestran una mayor flexibilidad de la que cabría esperar en una proteína globular típica, en especial la zona polar que se encuentra fuertemente cargada. Los grupos fosfoseril de esta zona son, probablemente, los responsables de la sensibilidad de la αs1-Caseína al pH y a la fuerza iónica y las interacciones de la zona hidrofóbica serían la causa de las características asocativas de esta proteína (Swaissgood, 1992).

Con respecto a su polimorfismo bioquímico, hasta ahora se conocen 6

variantes genéticas de la αs1-Cn bovina, designadas como A, D, B, C, F y E, en orden de movilidad electroforética decreciente, en geles alcalinos que contenían Urea y 2-Mercaptoetanol. Las variantes A, B y C fueron descubiertas por Thompson et al. (1962), mientras que la variante D fué observada por primera vez en ganado French Flamade (Grosclaude et al., 1966). Diez años después se publicó el descubrimiento de la quinta: αs1-Cn E, en leche de yak de Nepal (Grosclaude et al., 1979a). La existencia de una nueva variante de la αs1-Cn con una menor movilidad electroforética que la de la variante C se puso de manifiesto en ganado vacuno de Bali,Bos javanicus, (Bell et al., 1981c).

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Sin embargo, esta última variante podría ser idéntica a las variantes D ó E previamente citadas (Ng-Kwai-Hang & Grosclaude, 1992). En 1993, Erhardt señaló la existencia de una nueva variante, denominada αs1-Cn F, con una frecuencia muy baja (0.009) que, en condiciones alcalinas presenta una movilidad electroforética menor que la αs1-Cn C.

La αs2-Cn ha sido la última caseína bovina caracterizada y secuenciada.

Aparece en la leche en varias formas, denominadas αs2-Cn, αs3-Cn, αs4-Cn y αs6-Cn (la αs5-Cn representa el dímero formado por αs3-αs4), que difieren en el grado de fosforilación.

Su estructura primaria se determinó en 1977 (Bignon et al., 1977). La

cadena peptídica contiene 207 residuos que incluyen dos Cisteínas cercanas, en las posiciones 36 y 40. El número de residuos de Prolina es más bajo que el encontrado en otras caseínas y el de Lisina mas alto. Se han localizado 13 grupos fosfato, 12 sobre Serina y 1 sobre Treonina, agrupados en tres áreas de la molécula (7-31; 55-66 y 129-143), lo que le da una gran sensibilidad a la acción del Calcio.

El ADNc de la molécula de αs2-Cn bovina se secuenció en 1987 (Stewart et

al., 1987). La secuencia proteica correspondiente mostró una única diferencia con la secuencia anteriormente establecida: Glicina en lugar de Glutámico en la posición 87.

En comparación con la αs1-Cn, la caseína αs2- es más hidrofílica, contiene 3

grupos fosfoseril, puede contener puentes disulfuro inter- o intramoleculares, y presenta un menor porcentaje de residuos de Prolina.

Su estructura primaria sugiere la existencia de una zona polar N-terminal

negativamente cargada, que contiene dos grupos fosfoseril, una zona interna hidrofóbica seguida de otra zona polar, con un grupo fosfoseril y, finalmente, una zona C-terminal hidrofóbica positivamente cargada. Esta estructura anfipática, debida a la distribución no uniforme de cargas positivas y negativas a lo largo de la cadena polipeptídica, hace que las características de asociación entre moléculas de αs2-Cn dependan, en gran medida, de la fuerza iónica del medio (Snoeren et al., 1980). Sin embargo, su grado de asociación es menos extenso que en el caso de la αs1-Cn, probablemente como resultado de fuerzas de repulsión mayores y de una menor hidrofobicidad.

La primera publicación acerca del polimorfismo genético de la αs2-Cn se

realizó en 1976 (Grosclaude et al., 1976b). Se designó como A la variante más frecuente en las razas europeas, y con la letra B a una nueva variante descubierta en bovino (Bos taurus) y zebú (Bos indicus). Así mismo, se observó una nueva variante en yaks (Bos grunniens) que fué designada como C.

Entre las razas europeas de Bos taurus en Francia, se identificó

posteriormente una nueva variante, denominada D, en las razas Vosgienne y Montbéliarde (Grosclaude et al., 1979).

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En 1972, Shalichev & Taniev compararon la composición en aminoácidos de la αs-Cn ovina con la misma fracción de bovino indicando que, en la primera, también predomina el Acido Glutámico y que la Alanina y la Glicina se encuentran en la misma proporción. Así mismo señalaron que la cantidad de aminoácidos polares era mayor en la αs-Cn ovina que en la bovina.

Utilizando la cromatografía de intercambio de iones para analizar una

mezcla de caseínas procedente de leche de 6 ovejas Romney-Border x Leicester, Richardson & Creamer (1976) aislaron los componentes de la αs-Cn ovina, denominándolos αs1-, αs2- y αs3-Cn, según su movilidad electroforética en geles de almidón-urea a pH 8.6, observando además que su composición en aminoácidos era muy similar a la αs1-Cn bovina.

Posteriormente, Davoli et al. (1986) señalaron que la leche de oveja

contenía dos fracciones de αs-Cn que podían separarse, mediante electroforesis en gel de almidón-urea a pH ácido, en dos zonas bien diferenciadas, pero que no se separaban si se utilizaba un pH alcalino. Estas dos zonas podían atribuirse a las fracciones αs1- y αs2-Cn, cuya existencia fué demostrada por Mercier et al. (1985) mediante la preparación de ADNc a partir de ARNm aislado en la ubre de oveja.

En 1990, utilizando técnicas de cromatografía de afinidad y posterior

electroforesis en geles de Poliacrilamida-SDS se consiguió la separación de la caseína ovina en dos fracciones: la fracción I comprendía las proteínas que no se unían a la columna por no contener residuos de Cisteína o de Cistina, y estaba representada por la ß-Cn y la αs1-Cn; y la fracción II, que se obtenía por elución al añadir un agente reductor a la columna de cromatografía, ya que estaba formada por proteínas unidas al gel por enlaces -S-, y que consistían en las fracciones k-Cn y αs2-Cn (Dall'Olio et al., 1990) .

El polimorfismo bioquímico de la αs-Cn ovina se evidenció por vez primera

en 1966 (King, 1966), utilizando la técnica de elcetroforesis horizontal en gel de almidón-urea a pH alcalino. Este autor observó tres patrones electroforéticos diferentes en la zona de la αs-Cn: un primer tipo, el observado con mayor frecuencia, correspondía a un desarrollo formado por tres bandas de migración rápida; el segundo tipo, denominado "variante Welsh" por ser en esta raza donde se observó por vez primera, presenta dos bandas adicionales que migran inmediatamente detrás de las tres más comunes, en la zona entre la αs- y la ß-Cn y una tercera variante que presenta una banda adicional, de migración más rápida respecto a las 3 bandas más comunes de αs-Cn.

La presencia de la variante Welsh ha sido confirmada por distintos autores

en casi todas las razas ovinas estudiadas (Arave et al., 1973; DiStasio, 1983; Rossi & Clementi, 1984; Micari et al., 1986; Chiofalo & Micari, 1987), aunque existen también varios trabajos sobre distintas razas ovinas en los que no se observa la existencia de variantes genéticas de esta fracción caseínica (Russo et al., 1979; Davoli et al., 1986; Tejedor et al., 1990).

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Según Arave et al. (1973), la variante Welsh correspondería a un heterozigoto de la αs1-Cn, denominado AB/+, mientras que el fenotipo más común, con tres bandas y denominado +/+, correspondería al homozigoto.

En 1982, Chiofalo & Micari señalan la existencia de otra variante de la αs-

Cn que presenta únicamente 2 bandas, estando ausente la banda más rápida del fenotipo más común, en la raza ovina Barbaresca-Siciliana. Se8gún Richardson & Creamer (1976), esta banda más rápida podría corresponder a la αs1-Cn tratándose, en este caso, de un componente menor de la Ós-Cn ya que, según estos autores, su presencia no es constante en todos los trazados electroforéticos. Sin embargo, otros autores opinan que que no queda suficientemente claro el que la irregular frecuencia de esta fracción se deba a un problema de presencia/ausencia, o a una cuestión de mínima concentración de la fracción, de modo que no siempre se puede evidenciar, ya que esta variante se encontró en el 52.84% de los individuos estudiados en una población de raza ovina Siciliana (Chiofalo et al., 1982) y en el 62.38% de la población estudiada de la raza griega Chios (Micari et al., 1986). Este mismo grupo de autores señala, además, la existencia de una nueva variante de la αs-Cn que presenta una única banda adicional, más catódica, tras las tres bandas comunes de esta fracción caseínica.

Realizando un estudio sobre el polimorfismo bioquímico de la αs-Cn ovina,

en las razas italianas Massa y Biella, DiStasio (1983) describe un nuevo fenotipo, que sería similar al cuadro electroforético de la variante Welsh pero en el que las bandas 2ª y 5ª de este fenotipo estarían ausentes. Asumiendo con King (1966) que la variante Welsh es una forma heterozigota formada por un alelo común y un alelo mutante, este autor concluye que el nuevo fenotipo correspondería al heterozigoto del alelo mutante, que no pudo ser observado por King (1966). La frecuencia de esta forma homozigota es muy baja (0.01), y sólo ha sido descrito en la raza Biella.

Como ya hemos señalado, la aparición de un mínimo de 6 patrones

electroforéticos distintos en el grupo de la αs-Cn ha sido confirmada por distintos autores (Arave et al., 1973; DiStasio, 1983; Micari et al., 1986; Chiofalo & Micari, 1987). Todos estos autores identificaron la variante Welsh en distintas razas, sin establecer si se trataba de la αs1- o de la αs2-Cn. De hecho, según Mauriello et al. (1990), se trataría de la αs1-Cn. Davoli et al. (1990b), mediante técnicas de cromatografía de afinidad con muestras de caseínas pertenecientes al fenotipo común y al fenotipo Welsh, y posterior electroforesis de las fracciones obtenidas, observan que las dos bandas adicionales del tipo Welsh aparecen en la fracción que no queda retenida en la columna de cromatografía (Fracción I), junto a las tres bandas más comunes de αs1-Cn y a las dos bandas que constituyen la fracción ß-Cn..

En los últimos años, se ha comenzado a utilizar la técnica de

Isoelectroenfoque (IEF) para determinar las variantes genéticas de las caseínas ovinas y, en particular, de la αs-Cn (Caroli et al., 1989; Pieragostini et al., 1989; Mauriello et al., 1990; Chianese et al., 1992). Así, en un estudio realizado sobre 207 muestras de leche de oveja Sarda se describen tres fenotipos: una variante más común, constituída por tres bandas, y con una frecuencia del 62.2% , denominada αs-Cn NN; una segunda variante que presenta 2 bandas adicionales más catódicas (αs-Cn NW), y que correspondería al fenotipo Welsh,

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con una frecuencia del 32.1% y una tercera variante que únicamente presenta las dos bandas más catódicas y que correspondería al homozigoto mutante αs-Cn WW, con una frecuencia del 5.7% (Caroli et al., 1989). Los estudios familiares realizados por estos autores confirman la hipótesis del control genético de la variante Welsh por medio de de 2 alelos autosómicos codominantes a los que denominan αs-Cn N y αs-Cn W.

Beta-caseína (ß-Cn). Esta molécula está constituída por una cadena simple con 209 residuos

y tiene un peso molecular de 24.100 D. No presenta Cisteína ni Cistina, es especialmente rica en Prolina y se localizan 5 Serinas fosforiladas en los 35 primeros residuos, lo que la hace sensible al Calcio.

Es la más hidrofóbica de todas las caseínas. A pH normal de la leche, el

segmento que contiene el residuo 21-N-terminal presenta una carga neta negativa muy alta, mientras el resto de la molécula, que es altamente hidrofóbica, no presenta carga neta. Esta es la razón por la que la ß-Cn forma agregados micelares cuando se encuentra en solución (Ribadeau-Dumas, 1988).

La ß-Cn bovina fué secuenciada en 1972 (Ribadeau-Dumas, 1972) y

resecuenciada de nuevo en 1988 (Carles et al., 1988), encontrándose 4 errores en la primera secuencia que correspondían, 3 de ellos, a un cambio de Glicina por Glutámico. El cuarto error consistía en una inversión de dos residuos.

En 1987, tres grupos de investigadores obtuvieron, de forma independiente,

la secuencia de la ß-Cn bovina deduciéndola de su ADNc (Stewart et al., 1987; Bayev et al., 1987; Jiménez-Flores et al., 1987). Mientras los dos primeros grupos coinciden plenamente con la secuencia original obtenida de la proteína (Carles et al., 1988), el tercer grupo encuentra algunas diferencias: Leucina en vez de Metionina en la posición 93.

Al igual que ocurre en la k-Cn, la presencia de una zona polar y de otra

zona hidrofóbica se encuentra claramente diferenciada. Sin embargo, la ß-Cn es la más hidrofóbica y contiene un mayor número de residuos de Prolina que cualquier otro tipo de caseínas. Además, la zona polar presenta un único grupo fosfoseril. Así, se puede esperar una estructura molecular dominada por interacciones hidrofóbicas en su superficie y menos sensible a la fuerza iónica que las caseínas αs1 y αs2. Estas características parecen manifestarse en las propiedades fisico-químicas de la proteína, ya que los fenómenos de autoasociación en la ß-Cn dependen fundamentalmente de la temperatura (Payens & van Markwijk, 1963).

De la estructura y características de esta proteína se podría deducir que la

asociación de la zona hidrofóbica constituye el núcleo del polímero micelar, existiendo un equilibrio de asociación monómero-polímero micelar que depende en gran medida de la temperatura (Takase et al., 1980).

25

Excepto por el grupo fosfoseril que se presenta en la zona polar, existe una gran similaridad de la estructura anfipática de la ß-Cn con la de la k-Cn. Estas dos proteínas se caracterizan por presentar un equilibrio de asociación monómero-polímero micelar y, además, la ß-Cn desfosforilada, al igual que la k-Cn, estabiliza la αs1-Cn en presencia de Calcio (Yoshikawa et al., 1975).

Con respecto a la ß-Cn ovina, Richardson & Creamer (1979) publicaron un

trabajo sobre su estructura primaria, señalando que esta fracción caseínica contiene 2 componentes multifosforilados denominados ß1- y ß2-Cn, que presentan la misma cadena polipeptídica y que parecen diferir únicamente en el grado de fosforilación: 6 grupos fosfato en la ß1-Cn y 5 en la ß2-Cn.

La composición de aminoácidos de la ß1-Cn ovina difiere de la bovina en la

deleción de dos residuos (ya sea Pro179-Tyr180 o Tyr180-Pro181) y en la sustitución de 20 aminoácidos. El contenido en Prolina de la ß-Cn ovina es similar al de la proteína bovina (aproximadamente de un 16%).

El conjunto formado por 4 residuos de Serina fosforilados y la naturaleza

altamente polar de la región amino-terminal observada en la ß-Cn bovina, se conserva en la ß-Cn ovina. La sustitución de Ile12 (bovino) por Thr12 (ovino) da lugar a un nuevo punto de fosforilación. Este lugar se encuentra parcialmente fosforilado según se trate de la ß1-Cn o de la ß2-Cn ovina.

Posteriormente, se analizó la secuencia completa de nucleótidos del ADNc

de la ß-Cn ovina (Provot et al., 1989). Estos autores señalan que la secuencia de aminoácidos, deducida de la secuencia nucleotídica, difiere en tres posiciones de aquella determinada anteriormente por secuenciación directa de la proteína. Además, señalan que existe una gran homología entre esta proteína ovina y su correspondiente bovina, en particular en la zona del péptido-señal y en los principales lugares de fosforilación.

Investigando el polimorfismo genético de las proteínas lácteas en varias

razas bovinas, Aschaffenburg (1961) descubrió 3 variantes, denominadas A, B y C, para la ß-Cn. La variante A podía, a su vez, dividirse en A1, A2 y A3 mediante electroforésis en gel bajo condiciones ácidas (Peterson & Kopfer, 1966).

Posteriormente, Aschaffenburg et al. (1968) evidenciaron una variante poco

frecuente en las razas bovinas Deshis (India) y Boran (Kenia), que designaron como ß-Cn D.

Una séptima variante (ß-Cn E) fué descubierta por Voglino (1972), en la

raza italiana Piamontesa. En geles alcalinos con urea, el orden decreciente de movilidad

electroforética para las siete variantes genéticas de la ß-Cn sería: A1 = A2 = A3 > B > D > E > C (Kiddy, 1975).

26

Además, se han descrito al menos 4 variantes de la ß-Cn con una frecuencia muy baja. Así, Abe et al. (1975) detectaron la ß-Cn A', que presenta una movilidad electroforética significativamente menor que A1, A2, o A3 a pH 1.7, en vacas de razas japonesas. En el mismo año se señaló la aparición de la variante B2 en dos vacas, de raza no identificada, en Nueva Zelanda (Creamer & Richardson, 1975).

Una nueva variante de la ß-Cn, denominada provisionalmente ß-Cn A4, fué

observada en ganado vacuno de Bali (Bell et al., 1981b) y de Corea (Han et al., 1983; 1984).

Además, se ha observado la variante denominada ß-Cn A3mongolia en

ganado vacuno de Mongolia (Grosclaude et al., 1982). A diferencia de lo que ocurre en bovino, el polimorfismo bioquímico de la

ß-Cn ovina no es tan aparente. En 1966, King demostró la existencia de una variante de la ß-Cn, que presentaba una banda adicional,de migración más rápida que el tipo más común, representado por dos bandas. Esta variante se ha encontrado también en las razas Sarda, Comissana, Ile de France y Apenina (Rossi & Clementi, 1984).

En 1973, Arave et al. encontraron que, en condiciones de pH alcalino, la

mayoría de las muestras analizadas presentaban tres bandas en la zona de ß-Cn, observando, en algunas muestras, la existencia de de una 4ª banda adicional que se correspondería con la variante descrita por King (1966), a la que denominaron ß-Cn AB. Sin embargo, en condiciones de pH ácido, el patrón más frecuente consistía en 2 bandas y la variante ß-Cn AB presentaba una banda adicional de migración más lenta. Esta variante ha sido también observada en la raza ovina italiana Barbaresca-Siciliana (Chiofalo & Micari, 1982).

En general, sea a pH alcalino o a pH ácido, la ß-Cn ovina da origen a un

desarrollo electroforético más frecuente que consiste en dos bandas de igual intensidad y de menor movilidad electroforética que la αs-Cn, sin que se observen variantes genéticas en esta fracción ( Russo et al., 1979; Russo et al., 1981; Chiofalo et al., 1982; Micari et al., 1986; Davoli et al., 1986; Chiofalo y Micari, 1987; Dall'Olio et al., 1989; Tejedor et al, 1990).

Kappa-caseína (k-Cn). Es la proteína más extensamente estudiada debido, sobre todo, a que el

cuajo actúa directamente sobre ella en el inicio de la coagulación ácida de la leche. En leche, esta proteína presenta una glicosilación en varios segmentos

presentando galactosamina, galactosa y ácido siálico en su molécula, en una proporción del 5% . Su peso molecular es de 19.000 D. La estructura primaria de la fracción libre de carbohidratos fué determinada en 1973 (Mercier et al., 1973). El enlace sensible a la Quimosina se determinó anteriormente a partir de la caracterización de un péptido que sobrelapaba la para-k-Cn y el caseín-macropéptido (Jollès et al., 1968).

Los carbohidratos están unidos por enlaces -O-glicosídicos a residuos de Serina

o de Treonina del caseín-macropéptido (Zebaco & Ribadeau-Dumas, 1984).

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La k-Cn bovina presenta dos residuos de Cisteína en la región para-k-Caseína (1-105). Esta región es altamente hidrofóbica e insoluble. En la zona del caseín-macropéptido (106-169) pueden existir uno o dos grupos fosfato unidos a serina. Se trata de una región altamente polar, que se encuentra cargada negativamente y que es soluble. Este carácter anfipático hace que la k-Cn forme micelas en solución (Ribadeau-Dumas, 1988).

La secuencia inicial de la k-Cn bovina fué confirmada en 1984 con el

estudio de su correspondiente ADNc (Stewart et al., 1984). Su papel fisiológico es la estabilización de las proteínas sensibles al Calcio,

en presencia de sales de Calcio, en la leche. Su estructura es claramente anfipática pero, al carecer de grupos fosfato en la zona polar, la k-Cn permanece soluble en presencia de Calcio y a cualquier temperatura.

Además, en comparación con la ß-Cn, la k-Cn es menos hidrofóbica y

presenta una menor frecuencia de residuos de Prolina de modo que, aunque forma polímeros micelares como la ß-Cn, su equilibrio no es tan sensible a la temperatura o a la fuerza iónica (Vreeman et al., 1981).

En 1974 se determinó la secuencia de aminoácidos de la k-Cn ovina (Jollès

et al., 1974), señalándose la existencia de 26 sustituciones y 2 deleciones, al compararla con la k-Cn bovina. 10 de estas sustituciones se sitúan en la región para-k-caseína (105 aminoácidos), que presenta un comportamiento más hidrofóbico y el resto, 16 sustituciones y 2 deleciones, se sitúan en la zona del caseinmacropéptido (66 y 64 aminoácidos para oveja y vaca, respectivamente). El enlace sensible a la quimosina (Phe105-Met106) está situado, en ambas k-Cn, en secuencias largas idénticas (residuos 95-120). Estos autores demuestran además la existencia de un residuo adicional de Cisteína en la proteína ovina, que no existe en la k-Cn bovina.

El polimorfismo de la k-Cn bovina fué descubierto al incluir 2-

Mercaptoetanol en la preparación de los geles que contenían urea (Grosclaude et al., 1965), considerándose que esta proteína presentaba dos variantes, denominadas A y B. Cada una de las dos variantes se revela en bandas múltiples cuando se somete a electroforesis alcalina debido a que presenta distintos grados de glicosilación (Pujolle et al., 1966; Doi et al., 1979). Estos dos alelos fueron identificados utilizando la técnica del Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (Leveziel et al., 1988).

Una tercera variante, k-Cn C, ha sido descrita por DiStasio & Merlin

(1979), y dos bandas adicionales, k-Cn D y k-Cn E, fueron detectadas por Seibert et al. (1987) y por Erhardt (1989b), mediante técnicas de Isoelectroenfoque. Más recientemente, el resultado de las secuenciación de aminoácidos de las variantes C, D y E ha revelado que las dos primeras (C y D) son la misma proteína (Ribadeau-Dumas & Grosclaude, 1992; Miranda et al., 1993).

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Al realizar la electroforesis de las caseínas ovinas en geles de almidón-urea a pH alcalino, Richardson & Creamer señalaron que esta fracción se sitúa sobre la banda más lenta de la ß-Cn de modo que no es posible identificarla por este método. Al aislar esta fracción, mediante técnicas cromatográficas, y someterla posteriormente a electroforesis, estos autores observaron que la k-Cn daba origen a un desarrollo electroforético formado por 5 bandas que presentaban la misma composición en aminoácidos, pero con distinto grado de glicosilación, lo que les hace presentar distinta movilidad electroforética (Alais & Jòlles, 1967; Jòlles et al, 1974; Soulier et al, 1975).

En 1992, Chianese et al. realizan un estudio sobre caseínas ovinas

utilizando técnicas de IEF y de Inmunoblotting para identificar las distintas fracciones. Con respecto a la k-Cn, estos autores señalan que esta fracción presenta un gran número de componentes (12-14) que se teñían inmunoespecíficamente con suero anti-k-Cn, mostrando una heterogeneidad mucho mayor a la esperada para esta fracción, pero indican que esta heterogeneidad se debería a un distinto grado de glicosilaciónde los componentes de la k-Cn y no a un verdadero polimorfismo genético.

Según Ribadeau-Dumas y Grosclaude (1992), la K-Cn no es polimórfica en

ganado ovino.

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Variabilidad genética de las proteínas lácteas. 2.- Proteínas del lactosuero

Alfa-lactalbúmina (α-lalb). Es una proteína globular del lactosuero, de bajo peso molecular (14.200 D.),

que fué cristalizada por primera vez en el siglo pasado y que ha sido objeto de numerosos trabajos durante los primeros años de investigación de la química de proteínas (McKenzie, 1967; Gordon, 1971).

Durante los años 60 se descubrió su papel como regulador específico de la

lactosa sintetasa (Brodbeck & Ebner, 1966; Brodbeck et al., 1967; Brew et al., 1968), así como su homología con lisozimas de tipo C (Brew & Campbell, 1967; Brew et al., 1968) y, más recientemente, se demostró que se trata de una metaloproteína cálcica (Hiroaka et al., 1980).

La estructura primaria de la α-lalb bovina fué elucidada en 1970 como una

cadena peptídica simple, de 123 residuos, con 4 puentes disulfuro (Brew et al., 1970). Posteriormente se realizaron algunas correciones a la secuencia publicada inicialmente (Shewale, 1984). Su secuencia de aminoácidos fué deducida pocos años después de aquella correspondiente al DNAc (Hurley & Schuler, 1987).

La estructura primaria de la α-lalb ovina ha sido escasamente estudiada,

aunque se conoce que es muy similar a la bovina (Soulier et al., 1989; Brew & Grobler, 1992), e idéntica a la de caprino (Mercier et al., 1990).

Con respecto al polimorfismo bioquímico de esta proteína, aunque

Aschaffenburg y Drewry (1957) sospechaban su existencia, no pudieron demostrarlo, ya que todas las muestras individuales de leche analizadas por ellos contenían una única variante, la denominada en la actualidad α-lalb B. Fueron Blumberg y Thombs (1958) quienes descubrieron la presencia de la variante A en el Zebú. La diferenciación electroforética entre ambas variantes es debida a que la Arginina 10 de la variante B está sustituída por un residuo de Acido Glutámico en la variante A (Gordon et al., 1968). Una tercera variante, de menor movilidad electroforética que la α-lalb B, ha sido identificada en ganado vacuno de Bali por Bell et al. (1981), y ha sido designada provisionalmente como α-lalb C, pendiente de su secuenciación de aminoácidos.

En la especie ovina también se han encontrado dos variantes genéticas de

esta proteína: α-lalb A y α-lalb B, de las cuales la primera se presenta con una frecuencia génica cercana a la unidad, siendo la variante B de muy rara aparición.

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Beta-lactoglobulina (ß-lg). Es la principal proteína del lactosuero secretada en la leche de rumiantes.

Fué aislada por vez primera por Palmer, en 1934, y ha sido ampliamente estudiada desde entonces. A pesar de esto, aún no se ha determinado totalmente su función biológica (Hambling et al., 1992). Se trata de una holoproteína formada por dos monómeros idénticos que presentan, cada uno, un peso molecular de 18.000 D. (Tejedor, 1986).

La estructura primaria de la ß-lg se determinó en 1972. Es una cadena

polipeptídica que contiene 162 residuos de aminoácidos, 2 puentes disulfuro y un grupo SH- libre en la posición 21 (Braunitzer et al., 1972). Su estructura y propiedades fisico-químicas han sido estudiadas en profundidad por numerosos autores (Swaisgood, 1982; Jennes, 1985; Ribadeau-Dumas, 1988; Mercier et al., 1990).

Con respecto a su papel biológico, se obtuvo una indicación clara cuando,

en 1985, dos grupos de investigadores observaron una limitada homología con la proteína plasmática transportadora de retinol (Retinol-Binding Protein o RBP) (Pervaiz & Brew, 1985; Godovac-Zimmermann, 1985), confirmada posteriormente al analizar la estructura terciaria de esta proteína (Papiz et al., 1986). La RBP es la proteína que transporta retinol en el plasma para su almacenamiento en el hígado. Tanto la ß-lg como la RBP tienen estructuras terciarias similares y se sabe que la ß-lg posee dos moléculas de retinol fuertemente ligadas, una sobre cada promotor (Fugate & Song, 1980). Además, se conoce que esta la ß-lg pertenece a una familia de proteínas capaces de transportar pequeñas moléculas hidrofóbicas (Prevaiz & Brew, 1985; Mercier et al., 1990), por lo que algunos autores sugieren que se encuentra involucrada en el transporte de la vitamina A, al haberse encontrado receptores específicos del complejo ß-lg-retinol en el intestino de terneros neonatos (Papiz et al., 1986).

La ß-lg fué la primera proteína láctea en la que se descubrió un

polimorfismo genético (Aschaffenburg & Drewry, 1955). Al someter a electroforesis en papel de filtro, en un tampón Barbitol a pH 8.6 y a 230 V durante 16 horas, una serie de muestras individuales de leche de vaca, éstas producían dos bandas distintas de ß-lg, o se presentaban ambas bandas en la misma muestra. Estas bandas fueron denominadas ß1- y ß2-lg en orden de movilidad decreciente. Esta nomenclatura fué reemplazada poco después por ß-lg A y ß-lg B, respectivamente, cuando se descubrió (Aschaffenburg & Drewry, 1957) que la síntesis de estos dos tipos de proteína estaba controlada genéticamente y determinada por un gen con dos alelos autosómicos. En 1992, Wilkins & Kuis desarrollaron un método simple, mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) para analizar el polimorfismo de la ß-lg en ganado vacuno.

En ganado ovino, el polimorfismo de la ß-lg es el que se encuentra mejor

documentado. Fué descubierto por Bell y Mckenzie (1964) y por King (1969). En todas las razas investigadas se han encontrado dos variantes, ß-lg A y B, siendo la ß-lg A normalmente predominante. Estas dos variantes difieren en una sustitución de Tirosina, para la variante A, por Histidina para la variante B, en la posición 20 (Gaye et al., 1986).

31

Se ha señalado la existencia de una tercera variante, la ß-lg C, en dos razas ovinas: Tajik (Aliev & Koloteva, 1975) y Merino alemán (Erhardt et al., 1989a). Según este último grupo de investigadores, la variante C difiere de la variante A en una única sustitución (Glicina por Arginina en la posición 148), por lo que aquella podría considerarse como una mutación de la variante A, que se considera probablemente la forma original de la ß-lg ovina, por su similitud con la de caprino y bovino, y por presentar un frecuencia mas alta que la variante B.

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Influencia de las variantes genéticas de las proteínas lácteas sobre la producción y composición de la leche. I.

Algunos aspectos que resultan del estudio del polimorfismo genético de las

proteínas lácteas parecen tener aplicaciones prácticas para la mejora de la eficiencia global en algunos sectores de la industria láctea.

Debido a que las distintas formas de las principales proteínas lácteas están

controladas por genes autosómicos que se rigen por herencia mendeliana, la selección del ganado hacia un tipo específico de proteínas lácteas es posible, y es posible también la cría de animales que presenten unas variantes genéticas específicas y deseables.

Consecuentemente, un gran número de investigadores ha mostrado un

considerable interés en utilizar las proteínas lácteas como marcadores genéticos para conseguir el aumento de la producción de leche, la mejora de algunos aspectos relacionados con la producción, y la alteración de la composición láctea. De hecho, en estos últimos años se han llevado a cabo numerosas investigaciones acerca de las posibles asociaciones entre los tipos de proteínas lácteas y los caracteres de producción de importancia económica, debido al uso potencial de las variantes genéticas de estas proteínas como herramienta en la selección genética (Lin et al., 1992; Jakob & Puhan, 1992).

Debe hacerse énfasis en señalar que cualquier efecto que una cierta variante

genética de una proteína láctea específica pueda tener sobre algún aspecto relacionado con la producción es, en sentido estricto, sólo un efecto estadístico, es decir, que cualquier diferencia observada es una mera asociación y, en la mayoría de los casos, no se conoce nada acerca de la relación causa-efecto. Por el contrario, el efecto de una variante genética sobre la composición proteica de la leche puede considerarse un efecto más directo, ya que la mutación de la proteína en cuestión se localiza en la "zona codificadora" de su gen y podría alterar su tasa de biosíntesis (Ng-Kwai-Hang & Grosclaude, 1992).

La mayor parte de los trabajos acerca de la asociación existente entre las

distintas variantes genéticas lácteas y la producción y/o calidad de la leche se han realizado en ganado vacuno, existiendo muy poca bibliografía sobre este tema sobre ganado ovino. Así, únicamente podemos señalar algunos trabajos que relacionan las variantes de la ß-lg con un mejora en cuanto a la producción total de leche (Bolla et al., 1986; 1989) y con respecto a algunos parámetros tecnológicos (Bolla et al., 1990), o la relación entre las variantes de la αs-Cn y la cantidad de grasa y proteínas en ovejas de raza Sarda (Bolla et al.,1989; Piredda et al., 1993).

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Producción de leche. Resumir la gran cantidad de literatura que existe acerca de la relación entre el

polimorfismo genético de la leche y la producción láctea podría ser bastante difícil, debido a las distintas tendencias y, algunas veces, a los resultados conflictivos que se han publicado. En muchos casos, estos resultados no son comparables por razones como el tamaño de la población, las razas estudiadas, la frecuencia de las variantes genéticas objeto de consideración, el método utilizado para medir la producción (medida diaria o lactación completa) y, el más importante, el rigor del análisis estadístico para el ajuste de otros factores de importancia que influyen en la producción de leche (edad, época del año, estadío de lactación, condiciones higio-sanitarias, efecto de otras variantes genéticas, etc.) y que deberían considerarse antes de elaborar una conclusión acerca de la asociación entre el polimorfismo lácteo y la cantidad de leche producida (Ng-Kwai-Hang & Grosclaude, 1992).

Como ejemplo puede servir la relación entre las variantes genéticas de la ß-lg y la producción de leche en ganado vacuno. Distintos estudios (Ng-Kwai-Hang et al., 1990a; Rizzi et al., 1991; Bolla et al., 1992) han señalado que no existe relación alguna entre el polimorfismo de la ß-lg y la producción de leche, mientras que otros autores (Jairam & Nair, 1983) observaron una mayor producción en vacas con fenotipo ß-lg BB. Otros autores consideran que el fenotipo que influencia de modo favorable la producción de leche es el homozigoto ß-lg AA (Aleandri et al., 1990; Bovenhuis, 1991; Mao et al., 1991). Además, Bolla et al. (1992) señalan que las vacas con fenotipo ß-lg AA alcanzan más tarde el máximo de producción y, en consecuencia, presentan una mayor persistencia de la lactación, al compararlas con animales de fenotipo ß-lg BB. También se ha publicado algún trabajo sobre la asociación del fenotipo ß-lg AB con una mayor producción de leche en ganado vacuno (Pupkova, 1980).

Los efectos de las variantes de caseínas sobre la producción de leche

tampoco están bien establecidos y la información obtenida no es concluyente y depende de la naturaleza del estudio. No se observaron asociaciones significativas entre la cantidad de leche ordeñada y las variantes genéticas de la αs1-Cn, ß-Cn y k-Cn (McLean et al., 1984).

Para el locus de la αs1-Cn se ha demostrado, sin embargo, la superioridad del

fenotipo αs1-Cn BB sobre el αs1-Cn AB ó BC en cuanto a producción de leche (Aleandri et al., 1990), aunque otros autores (Graml et al, 1989) consideran que el fenotipo αs1-Cn CC produce un aumento significativo de la cantidad de leche con respecto al fenotipo αs1-Cn BB.

Con respecto a la ß-Cn bovina, normalmente las mayores producciones se asocian a su variante A (Ng-Kwai-Hang et al., 1986, 1990ª). Lin et al. (1986) señalan que sería posible incrementar la producción de leche en ganado vacuno aumentando la frecuencia de los alelos αs1-Cn B y ß-Cn A2.

No pueden presentarse conclusiones definitivas con respecto a la asociación

entre la producción de leche y la k-Cn. Algunos estudios indican que no existe relación (Ng-Kwai-Hang et al., 1984, 1990a), mientras que otros sugieren que la k-Cn AA (Bovenhuis, 1991), ó la k-Cn AB (Ng-Kwai-Hang et al., 1984), ó la k-Cn BB (Mao et al., 1991) están positivamente relacionadas con la producción de leche.

34

En concreto, Lin et al. (1989) y Eenennam & Medrano (1991) afirman que el alelo k-Cn B está asociado a un aumento de la cantidad de leche durante la primera lactación.

Composición de leche. Los contenidos absolutos y las proporciones relativas de los distintos

constituyentes presentes en la leche son los que determinan el valor total de este producto en términos de características económicas, nutricionales y tecnológicas. Existen numerosos trabajos que relacionan el polimorfismo genético de las proteínas lácteas con el contenido en grasa y proteina y, en menor medida, con la cantidad de minerales y de otros iones orgánicos que tienen un profundo efecto sobre las características tecnológicas de la leche. Parece que este tipo de asociación no presenta tanta controversia como la que relaciona las variantes genéticas lácteas con la producción total de leche.

Porcentaje de grasa. Aunque algunos estudios (Cerbulis & Farrell, 1975; Lin et al., 1986)

indican que no existen correlaciones significativas entre las variantes genéticas de la ß-lg y el contenido en grasa de la leche, otros tienden a mostrar lo contrario (Aleandri et al., 1989, 1990; Kristiansen & Bech, 1990; Bovenhius, 1991). En la mayoría de los casos, es la ß-lg B, ya sea como homozigoto o en su forma heterozigota (ß-lg AB), la que se relaciona con un porcentaje más alto de grasa en leche.

Con respecto a la αs1-Cn, algunos trabajos muestran que los valores más

altos de contenido en grasa están asociados a la variante αs1-Cn BC (Kristiansen & Bech, 1990), o αs1-Cn BB (Aleandri et al., 1990).

Lo mismo ocurre con la variante B de la ß-Cn (Bovenhuis, 1991). Según

Ng-Kwai-Hang et al. (1986), el contenido en grasa de la leche iría en el siguiente orden decreciente, según los fenotipos de ß-Cn encontrados:

A1B > A1A1 > A1A2 > A2A2 >A1A3 > A2A3 > A2B También se ha relacionado un mayor porcentaje de grasa con el fenotipo

BB de la k-Cn (3.76%), comparado con el 3.67% obtenido para animales con el fenotipo k-Cn AA (Ng-Kwai-Hang et al., 1986). Estos resultados han sido confirmados por otros autores (Bovenhuis, 1991), aunque también existen trabajos que consideran que es el heterozigoto k-Cn AB el más favorable con respecto a la cantidad y porcentaje de grasa en leche (Kristiansen & Bech, 1990).

Sin embargo, otros autores no encuentran que las variantes genéticas de los

distintos tipos de caseínas tengan algún efecto sobre la cantidad o el porcentaje de grasa (Rizzi et al., 1991; Bolla et al., 1992).

35

Porcentaje de proteina. El descubrimiento original de Aschaffenburg & Drewry (1957) de que la

leche de tipo ß-lg AA contenía una mayor cantidad de proteína que la de tipo AB o BB, ha sido confirmado posteriormente por otros investigadores (Moustgaard et al., 1960; Feagan et al., 1972; Cerbulis & Farrell, 1975; Janicki, 1978; Mariani et al., 1979a; McLean et al., 1984; Ng-Kwai-Hang et al., 1984, 1986; Al2eandri et al., 1989; Ng-Kwai-Hang et al., 1990a; Mao et al., 1991), aunque existen otros trabajos que señalan que es el fenotipo ß-lg B el asociado a un aumento en la cantidad de proteínas del lactosuero (Rizzi et al., 1991).

La diferencia en cuanto al contenido se debería, en gran medida, a una

alteración en la tasa de síntesis de la ß-lg (Aschaffenburg & Drewry, 1957; Cerbulis & Farrell, 1975; McLean et al., 1984; Ng-Kwai-Hang et al., 1987). Así, el mayor contenido de ß-lg en muestras de leche con fenotipo ß-lg AA daría como resultado un aumento en la fracción proteica del suero lácteo y, si la tasa de síntesis de caseína no se ve alterada, se produciría una variación en la fracción caseínica con respecto al total de proteínas. Este porcentaje, que frecuentemente se conoce con el término "número de caseínas", es una importante medida de la capacidad de coagulación de la leche para la fabricación de queso.

Aunque algunos trabajos señalan que no existe ninguna influencia del

fenotipo de la ß-lg sobre el contenido total de caseínas (Cerbulis & Farrell, 1975; Mityukov, 1982), la mayoría de los autores coinciden en afirmar que el fenotipo ß-lg AA está asociado a un menor contenido en caseínas que el fenotipo BB (Grosclaude, 1988; Kristiansen & Bech, 1990; Rahali & Menard, 1991), aunque otros autores indican que el fenotipo BB de la ß-lg se encuentra asociado a un menor contenido en proteínas lácteas (Bovenhuis, 1991).

Los estudios acerca del polimorfismo de la ß-lg sobre los contenidos de

caseínas y proteínas del lactosuero en muestras individuales de leche (Ng-Kwai-Hang, 1987) indican que la ß-lg AA está asociada a un menor contenido en αs1-Cn, α-lalb, albúmina sérica e inmunoglobulina, pero presentan un contenido más alto en ß-lg. Algunos autores (Kristiansen & Bech, 1990; De Lange et al., 1991) encuentran que el homozigoto ß-lg BB está asociado a una menor cantidad de proteínas del lactosuero y a un aumento en la cantidad de proteínas totales, sin embargo, no encuentran diferencias significativas en cuanto a los distintos fenotipos de la ß-lg bovina y la concentración de proteínas totales.

Algunos autores señalan que no existe ninguna asociación entre el

polimorfismo bioquímico de las caseínas y la cantidad y el porcentaje de proteínas (Kristiansen & Bech, 1990; Rizzi et al., 1991; Bolla et al., 1992). Sin embargo, otros autores consideran que las variantes genéticas de la αs1-Cn, ß-Cn y k-Cn están asociadas con el contenido total de la caseína correspondiente, o con el de otras fracciones caseínicas o de proteínas del suero lácteo, de modo que existe una alteración del contenido en caseínas o proteínas totales de la leche.

El fenotipo BC de la αs1-Cn se asocia a mayores contenidos de αs1-Cn, de

caseínas totales y de proteínas totales; y a un menor contenido de ß-lg y de proteínas del lactosuero, al contrario de lo que ocurre con los fenotipos BB ó AB (McLean et al., 1984).

36

Para las variantes de la ß-Cn, los tipos A1 y A2 parecen estar asociados a

una proporción más alta de αs1-Cn y más baja de ß-Cn y k-Cn, al contrario de lo que ocurre con el fenotipo ß-Cn B. Este último tipo se encuentra asociado a una menor cantidad de proteínas totales (Bovenhuis, 1991). Así, el fenotipo A1B se asocia a los contenidos más altos de caseína y proteína total (Ng-Kwai-Hang, 1986), mientras que el fenotipo A2A2 se relaciona con contenidos menores para estas dos fracciones lácteas.

Varios trabajos han mostrado consistentemente que la variante B de la k-Cn

está asociada a un contenido más alto de esta fracción láctea y a un contenido menor en ß-lg que la variante k-Cn AA (Mariani & Pecorari, 1991; Imafidon et al., 1991. La variante k-Cn B se asocia a un mayor contenido en caseínas y proteínas totales (Mariani et al., 1976; McLean et al., 1984; Kroeker et al., 1985; Ng-Kwai-Hang, 1986, 1987; Rampilli et al., 1988; Aleandri et al., 1989, 1990; Van Eenennam & Medrano, 1991; Mao et al., 1991).

Otros componentes de la leche. La mayor parte de la investigación en este campo se ha centrado en el

estudio de la asociación entre el polimorfismo bioquímico de las proteínas lácteas y los dos constituyentes principales de la leche: grasa y proteína. Sin embargo, existen también algunos trabajos que relacionan este polimorfismo bioquímico con constituyentes menores.

Acido cítrico y citratos Mariani et al. (1979b) han señalado que el contenido de ácido cítrico en

muestras de leche de fenotipo K-Cn A eran mayores (165 mg/100 ml) que las existentes en muestras de fenotipo k-Cn B (135 mg/100 ml), resultados confirmados posteriormente por otros autores (Mariani & Pecorari, 1991). Sin embargo, Kristiansen & Bech (1990) encuentran que es el fenotipo BB de la k-Cn y de la ß-lg el asociado a una mayor cantidad de citratos.

Acido siálico

El mismo grupo de investigadores (Mariani et al., 1984) señalaron la existencia de un menor contenido en ácido siálico de la fracción caseínica que contenía la k-Cn A, comparada con la k-Cn B. Sin embargo, Rabasa et al. (1983) no habían encontrado una asociación clara entre las variantes genéticas de la k-Cn y el contenido de ácido siálico en leche.

Lactosa

Kristiansen & Bech (1990) no obtienen ningún tipo de asociación entre las variantes genéticas lácteas y el contenido de lactosa en leche.

Nitrógeno

Tampoco se ha encontrado asociación con respecto a la concentración de Nitrógeno no proteico (NNP) (Kristiansen & Bech, 1990). Sin embargo, Rahali & Menard (1991) señalan que el fenotipo BB de la ß-lg se halla asociado a un aumento de la cantidad de Nitrógeno total retenido en el coágulo, en un estudio realizado con muestras de leche de vacas de raza Pied Noir, para la fabricación de queso de tipo Camembert.

37

Influencia de las variantes genéticas de las proteínas lácteas sobre la producción y calidad de la leche. II.

Caracteres relacionados con la producción lechera.

Crecimiento y peso corporal. Según algunos autores (Kriventsov, 1978; Singh et al., 1981), las tasas de

crecimiento desde el nacimiento hasta el comienzo de la edad productiva fueron más altas en terneras alimentadas con leche de tipo ß-lg AA que en aquellas que se alimentaron con leche de tipo ß-lg BB. Una posible explicación para esta observación sería el hecho de que la ß-lg AA está asociada a un mayor contenido en proteínas siendo, por tanto, una leche más nutritiva.

Otros estudios (Pokalov, 1975; Lin et al., 1987) demostraron que las

terneras con el gen ß-lg A eran de mayor peso que las que poseían el gen ß-lg B, manteniendo a los dos grupos de animales en las mismas condiciones experimentales, incluído el mismo régimen nutricional.

Mastitis. La mastitis es una enfermedad infecciosa que produce la inflamación de la

glándula mamaria y que tiene una gran importancia en la industria lechera. Aparte de afectar a la salud del animal, esta enfermedad incide drásticamente tanto sobre la producción como sobre la calidad de la leche.

El aumento del número de células somáticas en leche es un índice

comúnmente utilizado para determinar la existencia de mastitis en ganado lechero. Este aumento produce una disminución significativa del contenido en caseínas totales y un incremento, también significativo, del contenido total de proteínas del lactosuero así como un aumento de pH de la leche. Además, se observa una disminución de los porcentajes relativos de αs-Cn, ß-Cn y k-Cn y un aumento en el tiempo de coagulación y en la velocidad de endurecimiento del coágulo (Duranti & Caroli, 1991).

Con respecto a la asociación entre el polimorfismo genético de las

proteínas lácteas y la incidencia de la mastitis no existe una conclusión definitiva. En un estudio realizado sobre 2.000 vacas, a lo largo de 2 lactaciones (Jansen et al., 1981), no se observaron diferencias en la incidencia de mastitis en vacas con distintas variantes para la ß-lg, ß-Cn y k-Cn. Sin embargo, en otros trabajos se observó una menor incidencia de mastitis en vacas con ß-lg AB (Giesecke & Osterhoff, 1975; Stur et al., 1976), pero no se encontró relación entre el polimorfismo de la αs1-Cn, ß-Cn y k-Cn y la incidencia de mastitis.

Mientras Leonard-Kluz & Kaminska (1981) y Atroshi et al. (1982) señalan

en sus trabajos que existe una mayor resistencia a la mastitis asociada a la ß-lg BB, Han et al. (1986) señalan lo contrario.

38

Características fisico-químicas.

Estabilidad de la leche al calor La estabilidad de la leche y de las proteínas lácteas ante el calentamiento fué

la primera característica estudiada en relación al polimorfismo genético de estas proteínas. Gough & Jennes (1961) y Dupondt (1965) publicaron que la ß-lg B se

desnaturalizaba con más rapidez que la ß-lg A cuando las proteínas aisladas se calentaban a 67-75oC, en un tampón fosfsto a pH 6.86.

Los resultados obtenidos con leche procedente de vacas homozigotas para las

variantes de la ß-lg, mostraron que esto también era cierto para la tasa de desnaturalización de la ß-lg en leche (Gough & Jennes, 1962; Lyster, 1970). La menor estabilidad al calor de la ß-lg B, en relación a la variante A, a temperaturas entre 90-95oC ha sido confirmada por otros autores (Dannenberg & Kessler, 1988).

Ma et al. (1990) estudiaron la desnaturalización de las variantes genéticas de

la ß-lg por calorimetría, utilizando distintos tampones y encontraron que la ß-lg BB presentaba la más alta temperatura de desnaturalización y la ß-lg AA la más baja. Por el contrario, Manji & Kakuda (1986) no habían encontrado diferencias significativas entre las dos variantes a temperaturas de 80oC.

Para temperaturas superiores a los 90-95oC, los resultados existentes son más

conflictivos: Hillier & Lyster (1979) y Hillier et al. (1979) demostraron que la ß-lg B era algo más estable que la variante A. En contraste con estas conclusiones, Manji & Kakuda (1986) señalaron una mayor estabilidad al calentamiento para la variante A, en leche desnatada, entre 90-140oC. Resultados confirmados por Dannenberg & Kessler (1988) que concluyen que la ß-lg A presenta una mayor estabilidad al calentamiento a cualquier temperatura entre 70-150oC.

La estabilidad térmica de la ß-lg C bovina fué estudiada por Sawyer (1968)

que concluye que esta variante es mucho menos estable que las variantes ß-lg A ó B, cuando se calienta a 97oC. Al contrario que la ß-lg, las variantes genéticas de las distintas caseínas apenas han sido estudiadas en relación a este carácter. Sólo Ma et al. (1990) estudiaron el comportamiento de las variantes de la k-Cn (A y B) en soluciones de cloruro cálcico, señalando que la temperatura de desnaturalización difería en el orden: k-Cn AA>K-Cn AB>k_Cn BB.

Se ha demostrado que durante el calentamiento de la leche la k-Cn y la ß-lg

interactúan formando un complejo (Sawyer, 1969; Fox, 1982). McKenzie et al. (1971), que estudiaron las tasas de reacción de la ß-lg A y B con la k-Cn, en tampón cacodilato, a pH 6.6 y a 74oC, concluyen que la k-Cn reacciona más rápidamente con la variante ß-lg B que con la A.

Ma et al. (1990) e Imafidon et al. (1991) señalan que los fenotipos k-Cn

AA/ß-lg BB y k-Cn AA/ß-lg AB formaban los sistemas más estables con respecto a la alteración por el calor.

39

Estabilidad de la micela de caseína La estabilidad de la micela de caseína en presencia de calcio, lactato, citrato

y fosfato depende de las variantes genéticas de la αs1-Cn, ß-Cn y k-Cn (El-Negoumy, 1974; Imafidon, 1990; Ng-Kwai-Hang & Imafidon, 1990). Así, las micelas que contienen la combinación αs1-Cn BB, ß-Cn AB y k-Cn AB parecen ser más estables que aquellas que contienen la combinación BB-AA-BB para las tres caseínas respectivas.

Sin embargo, en un estudio realizado para determinar la solubilidad de 8

tipos genéticos de la ß-Cn (A1A1, A1A2, A1A3, A2A2, A2A3, A1B, A2B y BB), con concentraciones variables de cloruro cálcico a pH 6.8 y a 37oC, el análisis de mínimos cuadrados indicó que la presencia de k-Cn protegía contra la precipitación de la ß-Cn tras la adición de cloruro cálcico, siendo el fenotipo ß-Cn A1A1 el mejor protegido, y el tipo ß-Cn BB el menos protegido. En la mayoría de los casos era la variante k-Cn AB la mejor estabilizadora de la ß-Cn, en comparación con los tipos k-Cn AA y k-Cn BB (Imafidon & Ng-Kwai-Hang, 1992). Además, en este mismo trabajo se señala que la capacidad estabilizadora de la k-Cn depende, no sólo del tipo de ß-Cn presente, sino de la tasa k-Cn/ß-Cn.

Dimensión de las micelas de caseínas Se han realizado algunos estudios relacionando el tamaño de la micela de

caseína y los fenotipos de la k-Cn(Niki & Arima, 1984; Remeuf et al., 1989; Mariani & Pecorari, 1991), encontrándose en todos ellos que la variante B de la k-Cn presenta una estructura micelar más uniforme y un tamaño de la micela menor que la leche de tipo k-Cn AA, que presenta un mayor número de micelas de gran tamaño y un mayor porcentaje de submicelas.

Coagulación de la leche La tasa y la extensión de la coagulación de la leche por la acción del cuajo y

las características del coágulo resultante son factores muy importantes a considerar durante el proceso de fabricación de queso. La reactividad de la leche con el cuajo determina el desarrollo completo del proceso de coagulación.

Así, las leches anómalas, pobres en caseína y, especialmente las de

coagulación lenta no pueden emplearse de una forma útil en la coagulación, en especial en la fabricación de quesos con un largo periodo de maduración, dotados de características fisico-químicas y estructurales peculiares, ya que determinan la formación de un coágulo con escasa masa caseínica y no uniformemente deshidratada, del que deriva un queso estructural y organolépticamente defectuoso (Mariani & Pecorari, 1991).

40

Aptitud a la coagulación Las primeras indicaciones acerca de los efectos del polimorfismo genético

sobre las propiedades de coagulación de la leche (Sheborn et al., 1967) demostraron que: - La leche con ß-lg B presentaba una dureza del coágulo mayor que la que contenía la variante ß-lg A. - La variante AA de la k-Cn daba un tiempo de coagulación mayor y un coágulo más blando que la leche de tipo k-Cn AB o k-Cn BB. La mayoría de las investigaciones han confirmado estos descubrimientos

originales y la mayor parte de las publicaciones se han centrado en el efecto del polimorfismo de la k-Cn sobre el tiempo de coagulación (El Negoumy, 1972), la velocidad de endurecimiento y la dureza del coágulo (Feagan et al., 1970, 1972).

Todos los autores coinciden, en general, en que la leche que posee la variante

k-Cn B es mejor que la que presenta la variante A, al tener la primera un tiempo de coagulación menor, una velocidad de endurecimiento mayor y producir un coágulo más firme (Losi et al., 1973; Mariani et al., 1974; Losi et al., 1975; Schaar, 1984; Mariani & Leoni, 1985; Jacob & Puhan, 1986; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986a; Aaltonen & Antila, 1987; Rampilli et al., 1988; Davoli et al., 1990a; Kristiansen & Bech, 1990; Langrud et al., 1991; Mariani & Pecorari, 1991; Rahali & Menard, 1991; Delacroix-Buchet et al., 1993).

Este efecto de la k-Cn B podría deberse, en parte, al mayor contenido en

grasa y caseínas que presenta la leche con esta variante. Sin embargo, Marziali & Ng-Kwai-Hang (1986a) demostraron el efecto directo de las variantes de la k-Cn después de realizar ajustes para eliminar los efectos debidos a la composición de la leche. Manteniendo la misma tasa de caseína total o un tiempo de coagulación ajustado, según la cantidad de cuajo añadido, otros autores (Delacroix-Buchet et al., 1993; Macheboeuf et al., 1993) confirman los resultados anteriores, al observar que las muestras de tipo k-Cn BB siempre presentan una mejor aptitud a la coagulación que el homozigoto k-Cn AA y los heterozigotos k-Cn AC, BC ó AB. Este resultado podría explicarse porque el fenotipo BB presenta una mayor riqueza en k-Cn y un tamaño mediano de las micelas, lo que provocaría una organización más rápida del gel durante la sinéresis (Niki & Arima, 1984; Remeuf et al., 1989).

Sin embargo, otros autores no encuentran diferencias significativas entre las

variantes de la k-Cn, con respecto al tiempo de coagulación (Schaar, 1984; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986b; Politis & Ng-Kwai-Hang, 1988).

En general, el efecto de las variantes genéticas sobre el tiempo de

coagulación parece ser menos pronunciado que el efecto sobre la firmeza del coágulo o sobre la velocidad de endurecimiento (Jakob & Puhan, 1992).

Con respecto a la variante k-Cn E bovina, los trabajos de Gravert (1991)

indican que su efecto sobre las propiedades de coagulación de la leche es muy similar al de la k-Cn A.

41

Schaar et al. (1985) mostraron que la leche de tipo k-Cn A presenta también un efecto negativo en la coagulación de la leche sometida a tratamiento térmico, necesitando un 47% más de tiempo de coagulación para poder realizar el corte de la cuajada.

Con respecto a otras caseínas, parece que la leche que contiene αs1-Cn BC es

mejor, en términos de aptitud técnológica, que la que presenta la variante BB (Mariani et al., 1988) y que la ß-Cn BB es mejor también que la de tipo ß-Cn AA (Mariani et al., 1986; Kristiansen & Bech, 1990; Pecorari & Mariani, 1990), estando este último fenotipo asociado a la formación de un coágulo extremadamente blando (Sadler et al., 1968).

Según McLean (1987), las fuerzas repulsivas entre las micelas de caseínas

que contienen variantes en las que la sustitución de aminoácidos ha dado como resultado una menor carga negativa (αs1-Cn C; ß-Cn B; k-Cn B) disminuyen en comparación con las micelas que presentan variantes cargadas más negativamente (αs1-Cn B; ß-Cn A; k-Cn A). Esto hace que mejore la agregación de las micelas hidrolizadas, disminuyendo así el tiempo de coagulación y aumentando la dureza del coágulo. Según este mismo autor (McLean, 1987), estos efectos también podrían explicarse por diferencias en cuanto a la concentración de las variantes de la ß- y K-Cn, de la concentración de las caseínas solubles y por la tasa Calcio/Citrato en la leche.

Como se señala en distintos trabajos, tanto el tiempo de coagulación como la

dureza del coágulo parecen estar afectados por las variantes de la ß-Cn al menos tan significativamente como por las variantes de la k-Cn. Así, la leche que contiene la variante ß-Cn B, en particular en su forma homozigota, muestra, de modo consistente, un tiempo de coagulación menor (El Negoumy, 1972; Mariani & Leoni, 1985; Mariani et al., 1986), así como un coágulo más firme (Sherbon et al., 1967; Feagan et al., 1972; Corradini & Bergamaschi, 1974; Pagnacco & Caroli, 1987; Rampilli et al., 1988) que el tipo ß-Cn AA.

De modo similar, también se ha demostrado que la variante ß-Cn C presenta

tiempos de coagulación menores que los de la variante A (El Negoumy, 1972; Mariani & Leoni, 1985). Sin embargo, la indicación de una mayor firmeza del coágulo para la leche de tipo ß-Cn AC señalada por Jakob & Puhan (1986) no fué confirmada posteriormente (Pagnacco & Caroli, 1987).

Langrud et al. (1991) señalan que el fenotipo A1B de la ß-Cn presenta una

mejor aptitud de la leche a la coagulación que el resto de los fenotipos existentes. Marziali et al. (1992), señalan también que el alelo ß-Cn B está asociado a un tiempo de coagulación menor, a una mayor velocidad de endurecimiento y a una mayor firmeza del coágulo.

Aunque la ß-lg, en sí misma, no está relacionada con el proceso enzimático

de coagulación de la leche, se ha demostrado que sus variantes genéticas están asociadas a las propiedades tecnológicas de la leche cruda. En contraste con algunos autores (Mariani et al., 1982; Liberatori et al., 1990; Rahali & Menard, 1991), otros indican que la ß-lg AA presenta tiempos de coagulación menores que la ß-lg BB (Tervala et al., 1985; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986a; Rampilli et al., 1988;Kristiansen, 1990).

42

Algunos autores señalan una mayor dureza del coágulo para la ß-lg BB que para la ß-lg AA (Sherbon et al., 1967; Feagan et al., 1972; Mariani et al., 1982; Liberatori et al., 1990; Rahali & Menard, 1991), mientras que otros no encuentran diferencias a este respecto (Tervala et al, 1985; Rampilli et al., 1988). Una dureza del coágulo significativamente más alta obtenida con leche de fenotipo ß-Lg AA ha sido señalada por Marziali & Ng-Kwai-Hang (1986a).

Otros autores no encuentran ningún tipo de asociación entre las variantes de

la ß-lg y el tiempo de coagulación (Morini et al., 1982) o sobre la formación del coágulo (Tervala et al., 1983; Aaltonen & Antila, 1987; Pagnacco & Caroli, 1987; Politis & Ng-Kwai-Hang, 1988).

Sinéresis La sinéresis es el proceso en la fabricación de queso por el cual los

componentes del lactosuero se expulsan tras el proceso de coagulación enzimática. Inicialmente el coágulo contiene completamente la fase acuosa de la leche y, tras el corte de la cuajada y su agitación posterior, elcoágulo se contrae y el lactosuero es expulsado. Los factores que interfieren durante este proceso afectan, en general, al contenido en humedad y, por tanto, a la calidad del producto final.

Según Pearse & MacKinlay (1989), este proceso es sensible a la

concentración de ß-Cn y, también, a bajos niveles de desfosforilación de la ß-Cn, pero no es sensible a una desfosforilación parcial de αs1- ó de k-Cn.

Probablemente debido a la inexistencia de métodos adecuados de análisis,

existen pocos trabajos relacionados con el proceso de sinéresis del coágulo hecho con leche que presentaba diferentes fenotipos para las distintas proteínas lácteas.

Mariani et al. (1976) observaron que los quesos fabricados con leche de tipo

k-Cn BB perdían alrededor de un 15% más de peso en las primeras 24 horas que aquellos fabricados con leche de tipo k-Cn AA, indicando que los quesos delprimer tipo presentaban una sinéresis más intensa.

Vegarud et al. (1990) señalan una mayor sinéresis de los coágulos de tipo k-

Cn AB al compararlos con los de tipo k-Cn AA. En general, y según Pecorari & Mariani (1990) la leche de tipo k-Cn B da

lugar a un coágulo más elástico, que presenta un retículo más adecuado para la sinéresis, es más compacto y manifiesta una mayor fuerza de retracción, por lo cual desuera más fácilmente. Así mismo, Van der Berg (1991) señala la mejora del proceso de coagulación y de sinéresis del coágulo al utilizar leche de tipo k-Cn B. Utilizando pequeñas cantidades de cloruro sódico en muestras de leche con distintos tipos genéticos de k-Cn, los tiempos de coagulación se igualaban pero, sin embargo, las pérdidas de proteína y grasa durante el desuerado eran mayores en geles fabricados con leche de tipo k-Cn A que en aquellos fabricados con leche de tipo k-Cn B.

43

Fabricación de quesos Después de su producción, la leche generalmente se somete a distintos

procesos tecnológicos. Los factores que influencian las propiedades de manufacturación de la leche han sido investigados intensamente durante varias décadas. Aunque numerosos autores demostraron que el comportamiento tecnológico de la leche estaba relacionado con su composición (contenido en proteína, concentración de sales, etc.), esto no explicaba por completo las diferencias en cuanto a las propiedades tecnológicas de la leche procedente de distintas razas o de animales individuales (Jakob & Puhan, 1992).

Desde hace mucho tiempo se sabe que las denominadas "leches de

coagulación lenta" dan problemas en cuanto a producción y calidad del queso, por lo que se han realizado muchos estudios para revelar el efecto del polimorfismo genético de las proteínas lácteas sobre la fabricación de distintos tipos de queso.

Multitud de trabajos han demostrado que las variantes genéticas de las

principales proteínas lácteas influencian claramente la composición y/o el comportamiento tecnológico de la leche y existen, además, numerosos estudios que han demostrado que los efectos del polimorfismo genético de las proteínas lácteas sobre las propiedades de coagulación se reflejan también en la producción y composición de queso, factores determinantes de la calidad quesera.

Los primeros trabajos sobre fabricación experimental de quesos en relación

al polimorfismo bioquímico de las proteínas lácteas fueron realizados por Mariani et al. (1976), que fabricaron queso Parminiano-Reggiano con leche procedente de vacas de fenotipo k-Cn AA y k-Cn BB. Con respecto a la ß-Cn, todas las muestras analizadas de tipo k-Cn AA eran ß-Cn AA, mientras que las k-Cn BB ß-Cn AA, AB ó BB. Comparándolas con el grupo de muestras k-Cn AA, el grupo k-Cn BB presentaba unas propiedades tecnológicas significativamente mejores, dando como resultado un coágulo más firme, de tamaño más uniforme y con una producción de queso superior en un 10% . Además, las pérdidas de grasa en el desuerado fueron menores en un 50% .

Los análisis de estos mismos quesos tras la maduración (Morini et al., 1979)

revelaron, para el grupo de k-Cn BB, un 4% menos de humedad y una proteolisis más lenta, obteniendo un aumento de aproximadamente el 8% en la producción de queso.

Este aumento diferencial de la producción a favor de la variante k-Cn B fué

de un 4% en el caso de la fabricación de queso tipo Cheddar, con unas pérdidas de proteína y grasa en el suero significativamente menores que en los quesos de tipo k-Cn A (Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986b).

Graham et al. (1986) fabricaron quesos de tipo Cheddara escala de

laboratorio con muestras individuales de leche de vacas de fenotipo ß-Cn AA/k-Cn AA/ß-lg AA (Leche A) o ß-Cn AA ó AB/k-Cn BB/ß-lg AA ó AB (Leche B). La leche tipo B produjo un 5% más de queso/unidad de proteína láctea, que la de tipo A. Además, la recuperación de proteína y grasa fué significativamente mejor en la leche de tipo B. Resultados similares se han publicado en relación a la fabricación de queso de tipo Camembert (Rahali & Menard, 1990;1991).

44

Sin embargo, Schaar (1986) no observa diferencias significativas entre las dos variantes de la k-Cn en cuanto a la producción de queso Svecia, recuperación de los constituyentes lácteos, y composición de queso.

El aumento de la producción de queso al utilizar leche de tipo k-Cn B se

asocia también a un aumento del contenido en grasa y proteína total en el queso (Morini et al., 1979; Schaar et al., 1985; Graham et al., 1986; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986c; Rahali & Menard, 1991; Van der Berg, 1991). Sin embargo, Aleandri et al. (1990) obtienen que el fenotipo ß-lg AA/αs1-Cn BB/k-Cn BB está asociado a una mayor producción de queso, manteniendo constante la cantidad de grasa.

Según Morini et al. (1979), el queso fabricado con leche con fenotipo k-Cn

BB presenta mejores propiedades fisico-químicas y organolépticas, ya que este tipo de leche produce una mayor sinéresis en las primeras 24 horas, pierde menos agua durante la maduración y presenta una mayor proporción de grasa/proteína. Además, Mariani & Pecorari (1991) señalan que los quesos fabricados con leche de tipo k-Cn BB presentan una proteolisis mayor y más rápida que los de tipo k-Cn AA durante el proceso de maduración, es decir, son quesos que maduran más rápidamente.

Al comparar quesos producidos con leche de tipo ß-Cn A1A1 y ß-Cn A1A2,

Marziali & Ng-Kwai-Hang (1986b, 1986c) señalaron la superioridad del primer tipo, debido a que presenta una mayor retención de grasa y proteína en el coágulo, y menos pérdida de componentes lácteos durante el desuerado. Sin embargo, Aleandri et al. (1990) no encuentran asociación entre el polimorfismo de la ß-Cn y la producción de queso.

En ganado vacuno, la calidad del queso fabricado con leche que contiene αs1-

Cn A es inferior a la del queso fabricado con leche que contiene la variante B (Sadler et al., 1968), siendo este último tipo de leche más difícil de procesar (Thompson et al., 1969). La deleción de 13 residuos de aminoácidos en la αs1-Cn A reduce la naturaleza hidrofóbica de esta proteína en comparación con la variante B (Creamer et al., 1982) dando lugar a un cambio en la tasa de proteolisis durante la maduración del queso.

Al igual que la k-Cn BB, la leche de vacas homozigotas para la ß-lg B

parecen presentar mejores características tecnológicas, particularmente con respecto a la cantidad de queso producido (Morini et al., 1982; Schaar et al., 1985; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986b, 1986c; Aleandri et al., 1990; Rahali & Menard, 1990, 1991).

En la fabricación de queso Parmesano, Morini et al. (1982) obtuvieron un 1%

más de producción de queso utilizando leche ß-lg BB, en comparación con la de tipo ß-lg AA.

Con los mismos tipos de leche, Schaar et al. (1985) registraron aumentos de

la cantidad de queso de un 3.4% (real) y un 4.5% (en materia seca). en la fabricación de queso Svezia, utilizando leche pasteurizada. Para el tipo ß-lg AB, los valores correspondientes fueron del 1.8% y del 3%, respectivamente.

45

Marziali & Ng-Kwai-Hang (1986b) registraron un aumento en la cantidad de cuajada del 1.3% al utilizar leche de tipo ß-lg BB, en comparación con la de tipo ß-lg AB, pero no encontraron diferencias significativas entre los tipos ß-lg BB y ß-lg AA.

También se ha señalado que la recuperación de proteína en queso era

significativamente mayor en leche de tipo ß-lg BB que para el tipo ß-lg AA (Schaar et al., 1985; Marziali & Ng-Kwai-Hang, 1986c; Rahali & Menard, 1991), diferencia que fué atribuída a un contenido relativo de caseínas más alto en leche de vacas con fenotipo ß-lg BB (Grosclaude, 1988).

Basándose en cálculos de producción teórica de queso Parmesano, Aleandri

et al. (1990) estimaron que el fenotipo BB de la k-Cn y de la ß-lg daba lugar a la síntesis de un tipo de leche con una mayor capacidad de producción de queso que el fenotipo AA para ambas proteínas. Además, señalaron que el fenotipo αs1-Cn BC era más adecuado que el tipo αs1-Cn BB. Los incrementos estimados en la producción de queso por 1000 Kg de leche, utilizando leche de tipo k-Cn BB y αs1-Cn BC fueron de 0.92 y 0.75 Kg de queso, respectivamente.

Además, los mismos autores estimaron la producción teórica de queso según

el contenido en grasa y proteína de la leche, como fué señalado por Mariani et al. (1976) y por Morini et al. (1982). La producción esperada de queso para el tipo K-Cn BB se ajustó casi perfectamente a la producción real mientras que, para la k-Cn AA, la producción real fué mucho menor que la calculada. Los autores señalan que este efecto se debería probablemente a una menor retención de grasa en el coágulo de tipo k-Cn AA, dando como resultado una cuajada más débil.

Basándose en los resultados de un estudio preliminar, Graham et al. (1984,

1986) sugieren que la combinación k-Cn AB, ß-Cn BB y ß-lg BB resultaría más favorable, con respecto a contenido en caseínas, propiedades de coagulación y producción de queso, que la combinación formada por los tipos k-Cn AA, ß-Cn AA y ß-lg AA.

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EL LABORATORIO LECHERO PARA

PEQUEÑOS RUMIANTES El Laboratorio lechero para pequeños rumiantes, perteneciente al Departamento de

Producción Animal de la Universidad de Córdoba, tiene como línea de investigación principal el estudio de aquellos parámetros que afectan a la calidad tecnológica de la leche de ovino y caprino, ya que consideramos que es necesario contemplar el avance de la producción lechera desde una perspectiva que facilite la mejora de las características tecnológicas lácteas, al objeto de incrementar tanto su eficiencia transformadora como la calidad del producto final.

Este Laboratorio fue creadoo en el año 2003 con financiación con cargo al

Programa P.O. 2000-06 (zonas Objetivo 1. Periodo 2000-02) para Equipamiento Científico y Técnico, según la Convocatoria del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Secretaría de Estado de Política Científica y Tecnológica, con cargo a Fondos FEDER.

Los objetivos generales del Laboratorio son: 1.- El estudio de la composición y de los parámetros tecnológicos de la leche de rumiantes. 2.- El análisis del efecto de distintos factores de variación sobre la composición de la leche y sobre su aptitud para la elaboración de quesos y derivados lácteos, haciendo especial hincapié en el estudio de la variabilidad genética de las proteínas lácteas. De acuerdo con estos objetivos, las líneas de investigación principales que se siguen

en este Laboratorio son: 1.- Análisis de la composición y de los parámetros tecnológicos de la leche de ovino y caprino. 2.- Estudio del efecto de los principales factores de variación sobre la composición de la leche y sobre su aptitud frente a la coagulación por el cuajo. 3.- Estudio de la variabilidad genética de las proteínas lácteas. 4.- Determinar el grado de asociación entre estas variantes genéticas y los índices reológicos que definen la aptitud tecnológica de la leche. Siguiendo estas líneas, se han realizado diversos estudios sobre amplias poblaciones

de ovino Manchego (1055 ovejas pertenecientes a 8 ganaderías), Merino del Valle de los Pedroches (169 ovejas pertenecientes a 4 ganaderías) y se está comenzando a estudiar la población de Merino de Grazalema.

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Organización y funcionamiento Funcionalmente, el laboratorio se divide en tres zonas diferenciadas según los

análisis que se realizan en cada una de ellas: 1.- Laboratorio lechero:

- Parámetros fisico-químicos - Parámetros de calidad tecnológica - Parámetros de calidad higiénica

2.- Laboratorio de variantes genéticas

- Variabilidad genética de proteínas lácteas (IEF): Proteínas del lactosuero Caseínas

3.- Laboratorio NIR y densitometría:

- Metodología NIR - Densitometría de proteínas lácteas

El procedimiento a seguir cuando se recibe una muestra (50 ml de leche) en el

Laboratorio es el siguiente: 1.- Al recibir la muestra, se toman los datos referentes al animal:

Nombre y siglas de la ganadería Número de tatuaje del animal Año de nacimiento del animal Número de parto Tipo de parto (número de crías nacidas) Número de crías amamantadas Número y fecha del control realizado Cantidad total de leche ordeñada

2.- En segundo lugar, se mide el pH de la muestra de leche:

El pH normal de la leche fresca se encuentra siempre cercano a un valor de 6.70. Valores inferiores indican que en la leche se está llevando a cabo el proceso de acidificación, que produce la coagulación espontánea de la muestra.

Por el contrario, valores de pH superiores a 6.70 pueden ser indicativos de algún tipo de infección de la mama y, por lo general, son leches que no coagulan con la adición de cuajo.

Por tanto, ni las muestras de leche con valores de pH excesivamente altos (alcalinos) , ni aquellas con pH bajo (ácido) son incluidas en el estudio, ya que se trata de leches alteradas en las que no se puede medir ningún parámetro tecnológico.

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3.- Por último, y una vez establecido que la muestra está en condiciones para ser analizada, se divide en tres submuestras:

- Para análisis de composición láctea - Para análisis de parámetros tecnológicos - Para análisis de variantes genéticas.

Análisis de composición láctea.

Los parámetros de composición láctea analizados en el Laboratorio son los siguientes:

- Porcentaje de grasa - Porcentaje de proteína - Porcentaje de lactosa - Extracto seco total

Para ello, se utilizan 20ml de leche a los que se añade una pastilla de conservante

(bromopol). El análisis de composición se realiza midiendo directamente los distintos

porcentajes expresados anteriormente con un Milko scan FT 120 (Foss Electric). Este equipo basa su funcionamiento en la espectroscopia de infrarrojo,cuyo

principio radica en que todas las sustancias orgánicas absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la región infrarroja del espectro. De este modo, al incidir el haz de luz sobre la muestra objeto de análisis se recoge un espectro determinado que se compara con el espectro patrón, dando como resultado una cifra, en porcentaje, para cada uno de los componentes

Análisis de calidad higiénica.

Para su análisis se utiliza el Foss-ó-matic minor, un equipo específico para realizar el recuento de células somáticas en leche de forma automática. El equipo consta de un sistema de válvulas que mezcla la muestra de leche con un colorante específico que tiñe únicamente el ADN del núcleo celular. Un vez teñida, la muestra de leche pasa a una cubeta sobre la que se sitúa una cámara que realiza el recuento, exclusivamente de las zonas teñidas, de modo que es imposible que se recuenten glóbulos grasos o cualquier otra sustancia, ya que no pueden quedar teñidos, porque carecen de ADN nuclear. Una vez realizado el recuento, y también de forma automática, se realiza el lavado de todo el sistema, y se inyecta aire para separar una muestra de otra. Los recuentos aparecen directamente en el monitor del ordenador y el número real de células somáticas es el valor numérico que aparece multiplicado por 103.

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Análisis de parámetros tecnológicos.

Los parámetros analizados en este laboratorio son los siguientes:

Tiempo de coagulación (r) Velocidad de endurecimiento (k20) Dureza media de la cuajada (a30) Dureza máxima de la cuajada (a60) Rendimiento

Para ello, se utiliza el Formagraph (Foss-electric). Es un instrumento diseñado para medir las propiedades de coagulación de la leche bajo distintas condiciones de laboratorio y su funcionamiento está basado en el movimiento oscilatorio de pequeños péndulos inmersos en muestras de leche en proceso de coagulación.

Esta compuesto por:

- Un módulo de servicio, que calienta las cubetas que contienen las muestras de leche y que controla así la temperatura del análisis

- Un módulo de análisis y registro de datos donde se sitúan 10 péndulos que quedan sumergidos en cada pocillo de la cubeta. Esta cubeta se coloca sobre una placa, controlada por el termostato del módulo de servicio, que oscila horizontalmente a una velocidad constante.

Las oscilaciones de los péndulos quedan registradas en el ordenador : cuando la

leche está líquida, los péndulos no se mueven, ya que la leche no los arrastra, dando como resultado una línea continua en el esquema que aparece en la pantalla del ordenador.

Cuando la coagulación comienza, aumenta la viscosidad de la leche, de modo que

esta arrastra el péndulo y la línea dibujada en el ordenador se bifurca, obteniendo la siguiente figura:

En la que se miden directamente los parámetros de coagulación:

r = Tiempo de coagulación. Medido desde el inicio del análisis hasta que la leche comienza a coagular. K20 = Velocidad de endurecimiento de la cuajada. Tiempo que tarda la campana en alcanzar una amplitud de 2 cm. A30 y A60 = Dureza media y máxima de la cuajada a los 30 y 60 minutos de análisis. Se expresa en milímetros.

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Una vez la leche ha cuajado en los pocillos, se procede a medir el rendimiento en cuajada. Para ello se retira toda la cuajada contenida en un pocillo y se lleva a un tubo de centrífuga previamente pesado.

La cuajada se corta entonces con una espátula hasta conseguir un grano de

tamaño similar al obtenido durante el corte de la cuajada en las cubas de quesería. Una vez cortada, la cuajada se centrífuga separando el suero, que se desprecia. La cuajada, así desuerada, se pesa directamente.

Análisis de variantes genéticas.

1.- Separación de las proteínas del lactosuero y de las caseínas. Las muestras de leche se calientan en baño termostático a 36ºC y se agitan para

homogeneizar sus componentes. De cada muestra de leche se toman 10 ml y se ponen en tubos de centrífuga identificados con el número de muestra correspondiente.

Las muestras se centrifugan durante 15 minutos, a 3.500 r.p.m y 36ºC, para separar

la fracción grasa. Esta fracción se retira de cada tubo aspirándola con una trompa de agua. Una vez desnatada, la leche se acidifica hasta pH 4.6, utilizando una solución de

ácido acético al 10% y una solución 1M de acetato sódico. Al alcanzar un pH de 4.6, la caseína precipita y, para su total separación del lactosuero, se centrífuga durante 25 minutos, a 3.500 r.p.m y 15ºC. Esta centrifugación se realiza en tubos de 25 ml, identificados con el número de cada muestra y previamente pesados.

Después de la centrifugación, el lactosuero se pipetea en tubos de 3 ml,

identificados con el número de muestra, y se congela para su análisis posterior. La fracción caseínica, precipitada, se deshidrata mediante lavados sucesivos en

agua destilada, alcohol etílico, acetona y éter etílico, obteniendo así la caseína como un polvo blanco que se recoge en tubos identificados con el número de muestra correspondiente. Posteriormente se pesa directamente para obtener el dato “cantidad de caseína/ 10 ml de leche”.

2.- Isoelectroenfoque de proteínas lácteas. El isoelectroenfoque es una técnica electroforética donde la separación de

proteínas se lleva a caboen un gradiente de pH establecido entre los dos electrodos, y estabilizado por medio de anfolitos transportadores.

Mediante esta técnica, las proteínas migran hasta quedar alineadas en la zona

de su punto isoeléctrico, donde no presentan carga neta, quedando alineadas en este punto cuando cesa la migración.

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La característica principal de esta técnica es que, bajo el efecto de una corriente eléctrica, el ánodo adquiere un carácter ácido, (H3O+), mientras que el cátodo se hace alcalino (OH-). De este modo, al someter la proteína objeto de análisis a la acción de un campo eléctrico, ésta adquirirá un carga eléctrica neta debido a su carácter anfótero y migrará hacia el ánodo o hacia el cátodo hasta alcanzar su punto de isopH , en la zona central del gel, donde la carga eléctrica queda anulada y cesa la migración (punto isoeléctrico de la proteína objeto de estudio). Así, en estas condiciones, cualquier sustancia anfótera migrará siempre hacia su punto isoeléctrico, donde se concentrará formando una pequeña zona de pH alrededor de la zona de máxima concentración de proteína.

Si en este sistema hay varias sustancias anfóteras con distinto punto

isoeléctrico tenderá a generarse un gradiente de pH en el gel. La existencia de los anfolitos transportadores, cada uno de ellos con un punto isoeléctrico suficientemente separado, creará un gradiente continuo de pH en el gel, de modo que son estos los que dictan el gradiente de pH continuo donde las proteínas se pueden separar y enfocar según su punto isoeléctrico.

En general, losvalores de punto isoeléctrico de las proteínas se encuentran en un

rango de pH entre 4.0-7.0. 2.1.- Preparación de las muestras: El lactosuero se diluye en 500 µl de una solución de urea al 40% y para realizar el isoelectroenfoque se utilizan 5 µl de esta disolución. Las caseínas se diluyen en una solución de urea 7M, con unas gotas de azul de bromofenol como indicador y se toman 5 ml de esta solución para el isoelectroenfoque. 2.2.- El isoelectroenfoque se realiza en geles ultrafinos de Acrilamida, con desarrollo horizontal. El gradiente de pH está comprendido entre 4.0-6.5, y las condiciones generales de voltaje y amperaje dependerán del tipo de proteínas que se quieran desarrollar. 2.3.- Una vez realizado el isoelectroenfoque se procede a la tinción y conservación de los geles para su análisis densitométrico. 2.4.- Cuantificación de las proteínas lácteas: Para medir los porcentajes totales de la proteína objeto de estudio, así como los porcentajes relativos de cada una de las fracciones proteicas los geles se digitalizan electrónicamente con un escáner de alta resolución. Después se mide el área de cada una de las fracciones proteicas mediante el programa “Image master 1D” (Amersham Pharmacia), que trabaja de la misma forma que un densitómetro convencional pero teniendo la ventaja de de poder ampliar determinadas zonas o aclarar el fondo del gel para eliminar la zona de “ruido”.

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Una vez marcada la muestra a analizar, el programa muestra su imagen densitométrica, señalando los picos que corresponden a cada una de las fracciones proteicas. Por último, se realiza la integración del área de cada una de las fracciones proteicas dando como resultado el porcentaje de cada una de las áreas con respecto al total analizado (suma total de todas las áreas estudiadas).

Análisis estadístico. Por último, se realiza el análisis estadístico de los resultados obtenidos, observándose fundamentalmente las correlaciones existentes entre los parámetros analizados y las características tecnológicas de las muestras de leche analizadas.