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Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
Tesis para obtener el grado de:
Presenta:
Asesores:
Colima, Col., a 30 de Julio del 2002
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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Guadalajara, Jalisco a 10 de Julio del 2002.
C. Dr. Benjamín Trujillo
Coordinador de Posgrado
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas Universidad de Colima
Por medio de la presente, le informo que el médico especialista José Manuel
Ornelas Aguirre, alumno del programa de posgrado de la Maestría en Ciencias Médicas de la
generación 2000-2002 ha concluido la escritura de su tesis y otorgo mi autorización para su
presentación y de defensa de la misma.
Sin otro asunto por el momento, me despido de usted y quedo a sus órdenes para
cualquier aclaración al respecto.
Atentamente
Investigador asociado "D"
Unidad de Investigación en Epidemiología Clínica.IMSS
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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"ALTERACIONES MORFOLÓGICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS EN HIPERTENSIÓN ARTERIAL PULMONAR EN AUTOPSIAS DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO"
Tesis para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias Médicas
Presenta:
Médico Patólogo José Manuel Ornelas Aguirre. Asesores:
M. en C. Jorge Iván Gamez Nava (Clínico) D. en C. José Clemente Vázquez Jiménez (Básico)
Co-asesores: Médico Patólogo Gonzalo Vázquez Camacho.
Médico Patólogo Teresita Plasencia. M. en C. Laura del Carmen González López
Colima, Col. A 30 de Julio del 2002.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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AGRADECIMIENTOS:
Con todo respeto a mis profesores y asesores a quien agradezco su apoyo incondicional e
invaluables enseñanzas en los muchas veces difíciles caminos de la investigación
M. en C. Jorge Iván Gamez Nava D. en C. José Clemente Vásquez Jiménez
Muy especialmente a quienes viven entregados a la investigación científica en el Instituto
Mexicano del Seguro Social
Dr. Jesús García Pérez, Dra. Ana María Contreras y M. en C. Mario Salazar Páramo
De manera muy especial a mis profesores en el departamento de Patología del Hospital de Especialidades en el Centro Médico de Occidente (HECMNO) del IMSS:
Médicos Patólogos Dr. Gonzalo Vázquez Camacho, Dra. Teresita J. Plasencia y Dra.
Claudia Velásquez García
Con mucho agradecimiento a quien apoyó en el Hospital General Regional #110 del IMSS y colaboró con sus importantes consejos y observaciones estadísticas en la realización de esta
tesis:
M. en C. Laura del Carmen González López
Respetuosamente a mis profesores en el Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima:
D. en C. Benjamín Trujillo Hernández, M. en C. Cuauhtémoc Acoltzin Vidal, M. en C.
Oscar Uribarren Berrueta y al médico Hematólogo Dr. Ernesto Reynoso Zuñiga
Un agradecimiento muy especial a quienes colaboraron de forma importante en la técnica de inmunohistoquímica en el laboratorio del departamento de Patología del HECMNO:
Tec. Hist. Gabriela Blancas
Tec. Hist. Juan Manuel Álvarez Pérez
Tec. Hist. Brenda Eunice Martínez Romero
Por último, la realización de éste trabajo hubiera sido imposible sin el apoyo económico
proporcionado por el Fondo de Fomento a la Investigación Científica (FOFOI) del IMSS, en el programa de apoyo a Maestrías y Doctorados (FP-0038-240)
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ÍNDICE Índice de cuadros y figuras……………………………………………………………………………………6
Abreviaturas ……………………………………………………………………………………………..8
Resumen / Abstract………………………………………………………………………………9-10
Introducción....................................................................................................................................................11
Antecedentes..................................................................................................................................................12
Justificación................................................................................................................................................... 22
Pregunta de Investigación e hipótesis.......................................................................................................23
Objetivo general y particulares .................................................................................................................. 23
Material y métodos ......................................................................................................................................24
Resultados................................................................................................................................................ 3 0
Discusión....................................................................................................................................................... 48
Conclusiones .................................................................................................................................................54
Anexos..................................................................................................................................................... 55
Bibliografía................................................................................................................................................... 6 7
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS: Cuadro 1. Constituyentes de la matriz extracelular del parénquima pulmonar…………………...13 Cuadro 2. Principales causas del desarrollo de la Hipertensión Arterial Pulmonar…………………..14
Figuras 1-4. Diversos grados de Hipertensión Arterial Pulmonar……………………………….15
Cuadro 3. Principales Características Histopatológicas en la HAP………………………………….17
Figura 5. Representación de la técnica inmunohistoquímica para la avidina-biotina…………….19
Tabla 1. Características de los pacientes estudiado……………………………………………30
Figura 6. Principales síntomas encontrados en los casos con LES estudiados………………………31
Tabla 2. Principales características pulmonares en los pacientes estudiados……………………...32
Figura 7. Principales características pulmonares en los casos de LES/HAP estudiados…………….. 33
Tabla 3. Grado de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en los pacientes con LES……………….34 Figura 8. Grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según Heat-Edwards………………………….34 Tabla 4. Características de la inmunohistoquímica en el intersticio del tejido pulmonar de los casos con y sin HAP…………………………………………………………………….35 Figura 9. Positividad intersticial para los reactivos estudiado…………………………………...36 Tabla 5. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP……………………………………………………37 Figura 10. Grados de positividad intersticial en la inmunohistoquímica (a/b)……………………38 Tabla 6. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP……………………………………39 Figura 11. Grados de positividad intersticial en la inmunohistoquímica. (a/b)…………………...40 Tabla 7. Características de la inmunohistoquímica en las arterias del tejido pulmonar de los casos con y sin HAP…………………………………………………………………………………… 41 Figura 12. Positividad arterial para los reactivos estudiados…………………………………….42 Tabla 8. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP…………………………………43
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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Figura 13. Grados de positividad arterial en la inmunohistoquímica(a/b)…………………………44 Tabla 9. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP ………………………………………………...45 Figura 14. Grados de positividad arterial en la inmunohistoquímica.(a/b) ……………………46 Tabla 10. Correlación entre el grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según la gradificación de Heat-Edwards y el grado de la tinción intersticial de los diferentes reactivos entre los casos con LES estudiados………………………………………………………………………………………… 47 Anexo I. Criterios revisados para la clasificación de Lupus Eritematoso Sistémico……………...55 Anexo II. Clasificación de Heat-Edwards para la arteriopatía pulmonar plexogénica……………..56 Anexo III. Hoja de recolección de datos………………………………………………………57 Anexo IV. Fotografías microscópicas………………………………………............................63
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ABREVIATURAS: APP; Arteriopatía plexogénica pulmonar FCVE: Factor de Crecimiento Vascular Endotelial HAP; Hipertensión arterial sistémica HPP; Hipertensión arterial primaria gr.; Peso en gr. IgG; Inmunoglobulina-G IgM; Inmunoglobulina-M LES; Lupus eritematoso sistémico OR: Odds ratio (razón de momios) (r); Prueba de correlación de Sperman (rho) X2; prueba de Ji cuadrada
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RESUMEN:
INTRODUCCIÓN: Pocos estudios han evaluado las características inmunohistoquímicas de la
Hipertensión Arterial Pulmonar en el Lupus Eritematoso Sistémico (HAP-LES).
OBJETIVO: Evaluar las características inmunohistoquímicas de la HAP-LES.
MÉTODOS: En un estudio de casos y controles, seleccionamos de las autopsies de 1984 al
2001, 11 casos con HAP-LES, 7 controles con LES sin HAP y 9 controles sin enfermedad
pulmonar. Se realizó un análisis morfológico e inmunohistoquímico para Tenascina-C, Laminina,
Fibronectina, Inmunoglobulinas, Serotonina y CD-34.
RESULTADOS: Los casos con LES-HAP se diferenciaron de los controles sin LES en la
frecuencia e intensidad para la Tenascina-C (p=0.003) y Serotonina (p=0.035). La tinción para
Tenascina-C se incrementó en pacientes con HAP-LES en comparación con casos de
LES sin HAP (p=0.025). Una correlación positiva se observó entre el grado de HAP (Heat-
Edwards) con la intensidad para la Tenascina-C (rho=0.43, p=0.03) y Colágena IV (rho--0.47,
p=0.02) en la inmunohistoquímica arterial.
DISCUSIÓN: La Tenascina-C puede jugar un papel importante en la patogénesis de la HAP
en LES. Se requieren otros estudios, para evaluar la consistencia de nuestros hallazgos.
PALABRAS CLAVE:
Hipertensión Arterial Pulmonar, Lupus Eritematoso Sistémico, Inmunohistoquímica, Tenascina-C.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ABSTRACT:
INTRODUCTION: Few studies have evaluated the immunohistochemical characteristics of the
Pulmonary Hypertension secondary to Systemic Lupus Erythematosus (PH-SLE).
OBJECTIVE: To evaluate the immunohistochemical characteristics of PH- SLE.
METHODS: In a case-control study, we selected from the autopsies of 1984 to 2001, 11 cases
with PH-SLE, 7 controls with SLE non-PH, and 9 controls without pulmonary disease.
Morphological and immunohistochemical studies were performed. We compared presence and
intensity of Tenascin-C, Colagen IV, Laminin, Fibronectin, Immunoglobulins, Serotonin, and
CD-34, among cases and controls.
RESULTS: PH-SLE differed from controls without SLE in the frequency and intensity of
Tenascin-C (p=0.003) and Serotonin (p=0.035). The stain for Tenascin-C was increased in
patients with PH associated to SLE in comparison with non-PH SLE (p=0.025). A positive
correlation was observed between the grade of PH in the Heat-Edwards scale with the grade of
Tenascin-C (rho=0.43, p=0.03) and Collagen IV (rho=0.47, p=0.02) in the arterial
immunohistochemical stain.
DISCUSSION: Tenascin-C and Collagen IV may play an important role in the pathogenesis of
PH-SLE. Further studies are required to evaluate the consistency of our findings.
KEY WORDS:
Arterial Pulmonary Hypertension, Systemic Lupus Erythematosus, Immunohistochemical stain,
Tenascin-C.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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INTRODUCCIÓN:
El Lupus Eritematoso Sistémico (LES) es una enfermedad multisistémica del tejido
conectivo que en sus complicaciones frecuentemente engloba diversos sistemas y órganos
blanco1. A este respecto, la afección del sistema cardiovascular se asocia a desenlaces más
graves y provoca una mayor morbi-mortalidad. Una de las complicaciones en estos pacientes es el
desarrollo de Hipertensión Arterial Pulmonar con desenlaces fatales a corto plazo.
La inquietud por la realización de esta tesis se dirigió a dilucidar las características
morfológicas e inmunohistoquímicas relacionadas al desarrollo de la Hipertensión Arterial
Pulmonar en estos pacientes.
El presente estudio se realizó en tejidos procedentes de autopsias con diagnóstico de
LES. Diversos fueron los factores en contra que tuvimos que afrontar en la realización de este
trabajo, siendo principalmente: 1) el trabajar con tejidos fijados en parafina por largo tiempo
que podía haber causado una pérdida en la respuesta a los anticuerpos ensayados, y 2) pérdida de
información en expedientes clínicos.
El primer factor se logró vencer con la búsqueda sistematizada de los casos, tratando
de contar con tejidos en el mejor estado de conservación y lo más reciente posible; además
de una adecuada estandarización en la técnica de inmunohistoquímica y el desenmascaramiento
por calor a presión que devolviera la antigenicidad perdida a los tejidos analizados, por último, el
segundo factor en contra se solucionó creando una hoja de recolección adecuada que nos
permitiera capturar de una manera sistemática y eficiente la información requerida.
Es por lo tanto, la presente tesis el producto del esfuerzo conjunto del investigador
principal y colaboradores que contribuyeron en gran medida para el éxito en su realización.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ANTECEDENTES:
1. Generalidades del Lupus Eritematoso Sistémico:
Dentro de las enfermedades difusas del tejido conectivo, el Lupus Eritematoso
Sistémico (LES) es el prototipo clásico de una enfermedad multisistémica de origen
autoinmunitario y crónica, de causa desconocida y que en su desarrollo involucra a
cualquier órgano vinculado a fenómenos de autoinmunidad 1.
El comienzo puede ser agudo, siendo generalmente una enfermedad crónica,
recidivante y a menudo febril. Se caracteriza principalmente por lesiones cutáneas, articulares,
renales y serosas2. La expresión clínica de la enfermedad tiene un amplio rango de severidad
y una alta mortalidad, en esta última las infecciones oportunistas y la afección a órgano
mayor son los principales factores implicados3. Alrededor del 50-70% de los casos con
LES desarrollan manifestaciones pleuropulmonares durante el curso de su enfermedad las
cuales incluyen: pleuritis con o sin derrame, neumonitis intersticial y alveolitis fibrosante 4.
2. Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus Eritematoso Sistémico
Diversos estudios demuestran que la presencia de afección del sistema
cardiovascular y respiratorio en estos pacientes, juega un impacto negativo en la
sobrevida y se acompaña de forma frecuente de complicaciones severas a los pocos años
de padecer la enfermedad dentro de las cuales, se encuentra el desarrollo de la Hipertensión
Arterial Pulmonar (HAP) cuya principal característica es la resistencia al flujo de la
circulación en el lecho pulmonar.
La HAP asociada a enfermedades autoinmunes ha sido más frecuentemente descrita en
la enfermedad mixta del tejido conectivo y esclerodermia (CREST). Sin embargo; su
relación con el LES ha sido considerada como rara 5. Algunos estudios transversales y de
cohorte han mostrado que la HAP se presenta del 9 al 25% de los pacientes con LES 5-7.
Alguna vez fue considerada como una entidad raramente diagnosticada en vida, debido a
que en fases iniciales los pacientes se muestran asintomáticos y no es sospechada esta entidad
hasta que se presentan grados mayores de severidad durante el curso de su enfermedad 8-10.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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Actualmente, la prevalencia de HAP se ha obtenido en estudios más amplios usando
ecocardiograma Doppler como método no invasivo, se considera que está en personas que sufren
la enfermedad, va desde el 9 al 43% 5,11.
2. El Pulmón en la Hipertensión Arterial Pulmonar:
El pulmón es un órgano clave en la génesis de la hipertensión pulmonar de origen
secundario. El pulmón normal microscópicamente tiene una estructura característica. Tanto el
intersticio, el epitelio bronquial, el endotelio vascular y la pleura tienen su principal función en
servir como medio de separación y sustentación de la estructura del pulmón, su principal
constituyente es el tejido conectivo. Los componentes normales del pulmón y las substancias que
son liberadas del mismo pueden verse modificadas durante los procesos inflamatorios. Estos
componentes y sustancias son mencionadas en el Cuadro 1: un desequilibrio de estos
componentes puede modificar algunos aspectos de la función normal pulmonar.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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4. Etiología de la Hipertensión Arterial Pulmonar:
Para entender la Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en lupus eritematoso
sistémico, es primero necesario revisar los conceptos generales de la HAP y sus causas. La
HAP es un síndrome cuya característica es el incremento sostenido de presión en las
arterias pulmonares que lleva a una resistencia al flujo de la circulación del lecho
pulmonar 5 y que puede ocurrir como resultado de diversas enfermedades, las principales se
encuentran referidas en el cuadro 2. Resulta de una gran variedad de estímulos iniciadores,
histológicamente se encuentra (1) muscularización de arteria periféricas, normalmente no
musculares y debido a la diferenciación de pericitos, (2) hipertrófia de la túnica media y
formación una neoíntima en arteria musculares, como consecuencia de la hipertrófia,
proliferación y migración de células musculares lisas residentes con un incremento en la
producción de los componentes de la matriz extracelular (colágena, elastina, fibronectina y
tenascina-C) 12-13,. Todo lo anterior, conlleva a un incremento de los componentes normales
del vaso sanguíneo, con una disminución en su luz, así como lesiones plexiformes
(rugosidades y tortuosidades del vaso sanguíneo con cambios angiomatoides-
neovascularización) las cuales están constituidas primariamente por células endoteliales. (Ver
figuras 1-4).
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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En el caso de lupus eritematoso sistémico, la causa de la hipertensión arterial
pulmonar aún no ha sido totalmente dilucidada. Son 4 las principales teorías acerca
de su patogénesis: 1)La teoría del fenómeno de inmunocomplejos, en la cual la
presencia de autoanticuerpos inicia una reacción inflamatoria al depositarse en la luz
arterial; 2)La teoría de la enfermedad trombótica arterial, en la cual anticuerpos como
el anticardiolipina y el anticoagulante lúpico desarrollan fenómenos de microtrombos
que ocluyen la luz de arteriolas pulmonares, generando mayor resistencia al flujo.
3)La teoría de la liberación de substancias vasoconstrictoras y proliferativas del endotelio
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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vascular y la túnica media, que desencadena una respuesta proliferativa que gradualmente
ocluye las arteriolas y arterias pulmonares con fenómenos de neoformación vascular e
incremento de la presión pulmonar. Por último, 4)La teoría de la respuesta proliferativa vascular
en respuesta a un aumento de la resistencia a nivel alveolar, en esta teoría la fibrosis pulmonar
que desarrollan algunos pacientes lleva a un aumento en la resistencia al flujo vascular y al
desarrollo de hipertensión pulmonar secundaria. Más que una sola teoría estos aspectos
pueden ser complementarios y todos ellos constituyen una hipótesis de un proceso
autoinmune desconocido aún, que lleva al desarrollo de la hipertensión.
5. Detección de Hipertensión Arterial Pulmonar en Clínica
Las manifestaciones clínicas de los pacientes con HAP en LES son similares a las
de los de otros tipos de Hipertensión Pulmonar, inicialmente pueden ser asintomáticos, ser
detectados por estudios de gabinete especiales o de forma tardía por medio de la realización
de cateterismo cardíaco, cuando ya se han desarrollado síntomas de una insuficiencia
cardiaca derecha(ICD)5,9,11. Entre los síntomas que sugieren HAP se encuentran la disnea,
ortopnea, síncope de esfuerzo, dolor torácico y de manera menos frecuente aparece tos,
hemoptisis y muerte súbita, que se pueden presentar sobre todo en aquellos pacientes con
HAP muy grave12. Uno de los graves problemas relacionados a la HAP en LES, es su
asociación con una mayor mortalidad a corto plazo; sugiriéndose en la actualidad que, una
vez establecido el diagnóstico de HAP el promedio de vida es de 2 años 12-14.
6. Características Microscópicas de la HAP:
En estudios de microscopia de luz, la HAP de los pacientes con lupus eritematoso
sistémico es muy similar a la forma primaria de la HAP. La forma primaria ha sido clasificada en
3 tipos los cuales son descritos en el Cuadro número 3:
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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Dentro de las características microscópicas observadas en la HAP primaria se
incluye el daño vascular a pequeñas y medianas arteriolas manifestada por una
Arteriopatía Plexogénica Pulmonar caracterizada por la presencia de necrosis fibrinoide
en la pared arterial 15-17. La Hipertensión Pulmonar Primaria (HPP) puede presentar una
elevada frecuencia de anticuerpos antinucleares y dirigidos a las colágenas tipos I, III y
IV 18-19 . Las teorías actuales en relación a la patogénesis de la HPP han sido
enfocadas a las anormalidades de la interacción entre las células endoteliales y
musculares de los vasos sanguíneos pulmonares, con un desequilibrio de los mediadores
inflamatorios, favoreciendo la vasoconstricción y otras alteraciones 20-22.
A este respecto, los estudios inmunohistoquímicos que han sido realizados a
nivel vascular pulmonar en la HPP sugieren, que tanto la expresión de la síntesis del óxido
nítrico y la excreción de metabolitos activos de la prostaciclina, se encuentra disminuida en
las arterias pulmonares de pacientes con HPP.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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Otros estudios en cambio señalan, un incremento en la expresión de otras
substancias como la endotelina-1 23, la cual puede producir un incremento en el tono
arterial, con el desarrollo de vasoconstricción y proliferación de células musculares lisas,
lo que ya ha sido demostrado por la presencia de endotelina-1 en células alveolares de
pacientes con fibrosis pulmonar. Otras sustancias como Serotonina, Fenfluramina,
Dexfenfluramina, Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (FCVE), Mitógeno
Endotelial Celular Específico, Citocinas y diversos factores de crecimiento celular han
sido también asociadas al desarrollo de HPP, debido a que pueden provocar
estimulación en la emigración y multiplicación y elaboración de la matriz extracelular de
las células musculares lisas en los vasos sanguíneos1,14,24.
7. El diagnóstico inmunohistoquímico:
Desde los inicios de la patología, se ha reconocido la necesidad de una adecuada
validación de los juicios morfológicos, para lo cual diversos métodos especiales han sido
desarrollados para facilitar el reconocimiento celular y establecer mejores diagnósticos.
Inicialmente se desarrolla la inmunofluorescencia por Conos y cols. (1941),
posteriormente fue utilizada por Fagraeus en 1948 y otros investigadores, cimentaron las
bases para el desarrollo de la inmunopatología. En un principio, la inmunofluorescencia no
tuvo gran difusión debido a su baja resolución morfológica y a la imposibilidad de aplicarse
como método de rutina en el estudio de tejidos fijados en parafina (Taylor y cols, 1983). Lo
anterior, obligó a la búsqueda de nuevas técnicas que pudieran evitar los problemas
antes referidos y fue hasta el año de 1974 cuando fue realizada la técnica de
inmunohistoquímica por Taylor y Burns, que podía ser utilizada en tejidos fijados en
parafina 25. Estos métodos inmunoenzimáticos se basan en la unión entre una enzima
activa a un anticuerpo específico (avidina), que posteriormente y mediante la utilización
de otra enzima (biotina) producen una reacción colorimétrica visible en el substrato y en
los sitios de localización del complejo enzima-anticuerpo dentro del tejido de estudio. Las
enzimas más utilizadas para este fin son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa-
oxidasa 26.
Las ventajas que ofrece la inmunohistoquímica son una sensibilidad y
especificidad de más del 75% a pruebas de material de rutina y su compatibilidad con la
mayoría de las sustancias de fijación de tejidos26-27 .En teoría, cualquier sustancia que sea
antigénica y que dicha antigenicidad sea al menos parcialmente retenida en los cortes
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
19
de tejido puede ser determinada por inmunohistoquímica. Para la tinción de
inmunohistoquímica varios procedimientos son disponibles actualmente, los dos más
comúnmente utilizados son: 1)peroxidasa-antiperoxidasa y 2)avidina-biotina (Fig. 5).
La avidina es una glucoproteína básica con un peso molecular de 68,000
daltons y cuatro sitios de alta afinidad para la biotina (vitamina de un peso molecular de
244,000), éstas al unirse a la peroxidasa le confieren una reacción de tinción más intensa
debido a la actividad de la peroxidasa.
Figura 5. Representación de la técnica inmunohistoquímica para la avidina-biotina.
Modificado de: Shan-Rong S, Richard JC, Clive RT. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry
1997;45: 327-344.
Un problema común en la realización de estas técnicas lo constituyen la
desnaturalización, la naturaleza y estructura tridimensional de los receptores antigénicos
por los métodos comunes de fijación, procesamiento y conservación del tejido en
parafina 27. En general, los antígenos que se encuentran presentes en una alta
concentración dentro del citoplasma son mejor preservados durante la fijación con
formol, en cambio los de superficie son más comúnmente enmascarados o
desnaturalizados y esto puede ir aumentando en relación directamente proporcional al
tiempo de fijación y de almacenamiento utilizados. Sumado a lo anterior, en los tejidos
de autopsia, la presencia de la anoxia terminal al momento de la muerte con disminución
del pH intracelular provoca la desnaturalización de algunas proteínas estructurales.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
20
No todos los antígenos son susceptibles de esta desnaturalización por anoxia, lo
cual depende principalmente de: l) una adecuada difusión del fijador (4-6hrs) dentro del
tejido (a este respecto el pulmón tiene una adecuada capacidad de fijación) y 2) el tipo
y tamaño del tejido (mejores resultados se obtienen con fragmentos pequeños).
Para tratar de disminuir los efectos deletéreos en los antígenos, se utilizan en
la actualidad diferentes métodos para lograr una recuperación antigénica
(desenmascaramiento o restauración) con un aumento de su expresión inmunológica
mediante la incubación con enzimas proteo-líticas (Tripsina), tratamiento con álcalis
fuertes (solución de Hidróxido de sodio-NaOH y metanol) o la elevación de la
temperatura de los tejidos mediante calor a presión (el método más efectivo) 28-29.
8. Inmunohistoquímica en la Hipertensión Arterial Pulmonar y Lupus eritematoso
Sistémico:
Poca información existe acerca de las características inmunohistoquímicas de los
pulmones y arterias pulmonares de pacientes con lupus eritematoso sistémico, menos
información existe acerca de estas características en pacientes con hipertensión pulmonar
en esta patología. Esta falta de información se debe a que fue considerada una entidad
rara y pocos esfuerzos se han realizado para su estudio.
Los estudios de autopsias pulmonares hacen énfasis principalmente en
características histomorfológicas y no en las características inmunohistoquímicas.
Quismorio y sus colaboradores reportaron en 3 pacientes con lupus e hipertensión arterial
pulmonar, el depósito de inmunocomplejos en el endotelio arterial pulmonar, lo que
constituye un apoyo a la hipótesis de autoinmunidad. Otros autores han encontrado el
inmunocomplejo DNA-antiDNA en estas paredes, en autopsias de pacientes con
hipertensión arterial pulmonar y lupus eritematoso sistémico. Aun en otras
enfermedades con hipertensión pulmonar, solo poca información existe de sus
características inmunohistoquímicas.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
21
La substancia más estudiada ha sido la endotelina-1, donde algunos datos sugieren
un incremento de la endotelina-1 en las células endoteliales de las arterias pulmonares de
pacientes con engrosamiento de la media y fibrosis de la íntima. Sin embargo, otras
substancias como la Tenascina-C, la cual es una glicoproteína de la matriz
extracelular que predomina en tejidos embriónicos y adultos en constante
remodelación (Chiquet-Ehrismann et al, 1995), han sido relacionada a proliferación,
diferenciación, migración celular y apoptósis 30, así como participación en la
neoformación vascular en tumores y otros procesos 31-32 no ha sido estudiada por
inmunohistoquímica en la hipertensión pulmonar.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
22
JUSTIFICACIÓN
El LES puede cursar con afectación vascular pulmonar durante su evolución, los
pacientes suelen cursar con diferentes manifestaciones clínicas que hacen diferente el
pronóstico, destacando por su severidad la HAP, considerada de mal pronóstico, con un
promedio de vida de 2 años posterior al diagnóstico. Recientes estudios denotan que
algunos pacientes pueden tener un pronóstico medianamente más favorable, si son
detectados en etapas tempranas de la enfermedad 11,14. Sin embargo, a pesar de que
cada vez se diagnostica con mayor frecuencia, no es conocido porque en algunos
pacientes con LES se encuentra el desarrollo de HAP mientras que en otros no 5.
Se han postulado diversas teorías para el desarrollo de HAP en lupus eritematoso
sistémico, dentro de los que se ha sugerido la intervención de diferentes mecanismos
productores de la lesión vascular. Desde el punto de vista inmunohistoquímico
y morfológico la comparación entre pacientes que habían desarrollado HAP y los que no
la desarrollaron no se ha establecido claramente 33.
Este trabajo evalúa las características morfológicas e inmunohistoquímicas en
tejido vascular y del parénquima pulmonar proveniente de autopsias de pacientes con lupus
eritematoso sistémico con HAP y las compara con pacientes con LES sin HAP y con controles sin
patología autoinmune. El hallazgo de las diferencias inmunohistoquímicas en algunas
substancias potencialmente implicadas en la teoría de formación neovascular y
proliferación de células endoteliales tales como; Tenascina-C y Endotelina-1, pueden
llevar a un mejor entendimiento de la patogénesis de la hipertensión pulmonar y la lesión
parenquimatosa pulmonar en LES, que a futuro pueda brindar un soporte a tratamientos
más tempranos, que puedan detener la progresión de la hipertensión pulmonar en estos
pacientes.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:
¿Cuáles son las características inmunohistoquímicas intersticiales y vasculares
del parénquima pulmonar que distinguen a pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico
con Hipertensión Arterial Pulmonar de pacientes sin hipertensión arterial pulmonar?
HIPÓTESIS:
Existen alteraciones inmunohistoquímicas distintivas en los pacientes con lupus
eritematoso sistémico que tienen hipertensión arterial pulmonar de pacientes que no
presentaron esta entidad.
OBJETIVO GENERAL:
Comparar características morfológicas e inmunohistoquímicas del parénquima y
tejido vascular pulmonar en pacientes con lupus eritematoso sistémico con hipertensión
pulmonar comparado a pacientes sin hipertensión pulmonar.
OBJETIVOS PARTICULARES:
1.- Evaluar las características morfológicas del daño vascular pulmonar en
pacientes con LES asociados a HAP y compararlas con las encontradas en pulmones sanos.
2.- Evaluar las características inmunohistoquímicas del daño vascular pulmonar
en pacientes con LES, su asociación al desarrollo de HAP y en comparación con pulmones sanos.
3.- Analizar los cambios morfológicos e inmunohistoquímicos en el parénquima pulmonar
(Neumonitis, Infecciones oportunistas, poliserosítis, etc.) en LES asociado al desarrollo de
HAP y en comparación con pulmones sanos.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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MATERIAL Y MÉTODOS:
1. Tipo de estudio y selección de los sujetos de estudio:
En un estudio de casos y controles se seleccionaron para el grupo a estudiar a todas las
autopsias realizadas en un periodo de 17 años (1984-2001) con diagnóstico de LES con o
sin diagnóstico previo de HAP según los criterios del Colegio Americano de Reumatología
de 1982 34. Lo anterior, debido a que la presencia del desarrollo de HAP en enfermos
con Lupus Eritematoso Sistémico es de alrededor del 1% y en la población sana (HAP de origen
no autoinmune) es de alrededor del 0.0002%.
Para el grupo control sin enfermedad autoinmune se seleccionaron autopsias de
pacientes sin diagnóstico de enfermedad autoinmune en el expediente clínico, donde la
causa de muerte hubiera sido algún proceso que no hubiera comprometido a pulmones o
algún proceso infeccioso agudo y cuyos tejidos se encontrarán en el archivo del servicio de
Anatomía Patológica del Centro Médico Nacional de Occidente del IMSS.
Requisitos fundamentales para su inclusión fueron que todos los estudios de autopsia
estuvieran debidamente concluidos y existiera la presencia de tejido pulmonar viable y
debidamente conservado en parafina para estudio morfológico e inmunohistoquímico (no
fragmentado y con tamaño suficiente para realizar varios cortes a 5µ de espesor). Se
excluyeron aquellos estudios de autopsia no concluidos, con datos en expediente clínico
incompletos o no legibles y con existencia de tejido pulmonar no viable para estudio
morfológico e inmunohistoquímico.
Definición de Caso:
Se consideró como caso, aquellos pacientes con lupus eritematoso sistémico con datos
histopatológicos de HAP definidas según los criterios de la clasificación de Heat-Edwards
incluyendo los estadios 1 al VI (ver cuadro de clasificación en la sección de Anexos).
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
25
Definición de Controles:
Para aumentar la validez del estudio, se seleccionaron 2 tipos de controles:
a) Control -1: Aquellas autopsias de pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico
con ausencia de datos histopatológicos para Hipertensión Arterial Pulmonar según la
clasificación de Heat-Edwards. Solo aquellos con estadio 0 (normal: ausencia de
neoformaciones vasculares, ausencia de lesiones plexiformes sin hipertrofia o hiperplasia
de la íntima y media de las arterias pulmonares) fueron incluidos como el primer grupo de
controles.
b) Control-2: Para el segundo grupo de comparación, se seleccionaron autopsias
de pacientes que no fueran portadores de enfermedad de origen autoinmune (ausencia de
criterios diagnósticos para lupus eritematoso sistémico u otra colagenopatía) y que en la
autopsia no se observó la presencia de hipertensión arterial pulmonar. En este grupo se
incluyeron también solamente aquellos pacientes con un grado de Heat-Edwards = 0
(normal).
2. Procedimiento:
Se formaron tres grupos de estudio:
a) El primer grupo constituido por 11 casos de autopsia con LES con alteraciones
histológicas de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP).
b) El segundo grupo (control número 1) lo constituyeron 7 autopsias de pacientes
con LES con ausencia de alteraciones histológicas de HAP.
c) El tercer grupo (control número 2) constituido por 9 casos de pacientes sin
enfermedad autoinmune con ausencia de alteraciones histológicas de HAP.
Las variables independientes investigadas fueron los resultados de la tinción de
inmunohistoquímica para las siguientes substancias en el tejido pulmonar y en los vasos
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
26
arteriales pulmonares analizados: Colágena tipo IV, Laminina, Fibronectina, CD-34, IgG, IgM, Tenascina-C y Serotonina. Se detectó grado de tinción para cada una de los antígenos, el grado fue categorizado de forma arbitraria en cruces siendo (-) = negativo, (+) positividad leve, (++) positividad moderada, (+++) positividad alta.
Se revisó también los cambios morfológicos del parénquima pulmonar y las arterias
pulmonares utilizando la lectura en cortes de tejido pulmonar a 5µ de espesor y teñidos en
Hematoxilina y eosina, solo en caso necesario se solicitaron tinciones especiales de Masson,
Fibras elásticas y Acido Peryódico de Schiff. Así como la búsqueda de cambios agregados,
tales como el desarrollo de procesos infecciosos, trombosis, hemorragia pulmonar, infartos
pulmonares, etc.
La información obtenida se registró mediante un formato previamente estructurado
que incluía datos morfológicos (hiperplasia e hipertrofia de los vasos sanguíneos para la
gradificación de Heat-Edwards, presencia de trombos vasculares, neumonitis, pleuritis e
infecciones oportunistas agregadas), así como la presencia de cambios plexogénicos
pulmonares.
Revisión de expedientes clínicos
Se evaluaron los expedientes clínicos en busca de variables clínicas y demográficas
que fueron registradas en un formato estructurado. Entre estas características se
identificaron la edad, sexo del paciente, diagnóstico de enfermedad de base,
enfermedades asociadas, causa de la muerte, factores contribuyentes a la muerte. En caso
de sintomatología cardiovascular, se consignó la disnea, ortopnea, tos, hemoptisis, ataques
de angor, arritmias, edema y hepatomegalia, así como otros datos de insuficiencia cardiaca
derecha e izquierda.
Procedimiento para la detección de reactividad en Inmunohistoquímica:
Por último, se evaluó la reactividad a diversos anticuerpos presentes en el
parénquima pulmonar y las arterias pulmonares (Colágena tipo IV, Laminina,
Fibronectina, CD-34 IgG, IgM, Tenascina-C y Serotonina), por medio de la técnica estándar de
inmunohistoquímica para peroxidasa anti-peroxidasa niveles 1 y 2 Dako® utilizada, previo al
desenmascaramiento de la antigenicidad tisular de los anticuerpos mediante la siguiente técnica:
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
27
1.-Realización de corte histológico de tejido fijado e incluido en parafina a 3-5µ de
espesor y colocación en laminilla de cristal con adhesivo para tejidos de poli-L-lisina.
Posteriormente se dejó secar por un periodo de 2-16 horas,
2.- Se procedió a la desparafinización del tejido mediante xilol y alcohol a diversas
ncentraciones (100, 96 y 75%),
3.- Se colocaron las laminillas en solución buffer (Conteniendo 8.5 gr. de Cloruro de
sodio, 0.266 gr. de fosfato de potasio monobásico y 1.14 gr. de fosfato de sodio
dibásico en 1000 ml de agua bidestilada),
4.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de peróxido de
hidrógeno al 3% (Blocking reagent), dejando reposar por 20 minutos,
5.- lavado con solución buffer,
6.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de Suero normal
por 20 minutos,
7.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del anticuerpo primario durante
toda la noche en cámara húmeda obscura, prosiguiendo al día siguiente con un
lavado inicial en solución buffer,
8.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de tinción (Linking
reagent) por 20 minutos,
9.- Posterior a un nuevo lavado con solución buffer, se colocó la laminilla nuevamente
en cámara húmeda agregando 2 gotas del revelador (Labelling reagent) dejando
reposar por 20 minutos más y tiñendo finalmente por hematoxilina de Harris durante 5
minutos.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
28
La observación al microscopio de la reacción colorimétrica se calificó por
dos patólogos observadores de acuerdo a negativo si no existía tinción alguna de color
magenta en el tejido analizado y/o positivo, si existía tinción presente en el tejido,
realizándose una subcategorización de acuerdo al porcentaje de intensidad de la
tinción: negativo (-), leve (+), moderado (++) y alto (+++).
Todas las laminillas fueron revisadas por el mismo investigador. El investigador
fue cegado al grupo del cual procedían las laminillas. Un segundo evaluador revisó los
resultados de las observaciones de las laminillas. En caso de discrepancia en las
observaciones entre los dos evaluadores, se llegó a un acuerdo posterior a un análisis de
las laminillas y de los criterios utilizados para calificar los cambios.
De la información obtenida se calificó como variable dependiente a los cambios
morfológicos de HAP (hiperplasia e hipertrofia de vasos sanguíneos y cambios
plexogénicos pulmonares) según la gradificación de Heat-Edwards y como variable
independiente al resultado de la tinción de inmunohistoquímica para el tejido pulmonar
y vasos arteriales pulmonares (Colágena tipo IV, Laminina, Fibronectina, CD-34 IgG,
IgM, Tenascina-C y Serotonina). Otras variables evaluadas fueron: cambios
morfológicos agregados en el parénquima pulmonar, desarrollo de procesos infecciosos,
trombosis, hemorragia pulmonar, infartos pulmonares del parénquima y arterias
pulmonares.
3. Análisis estadístico:
El análisis de los resultados fue realizado mediante el programa SPSS® 8.0
para Windows (SPSS Inc, 1997), las gráficas se realizaron mediante el programa Harvard
Graphics ® 4.0.1 para Windows (Software Publishing Corporation 1991-1995).
Para la comparación de las diferencias entre proporciones de los grupos se utilizó
la X2 y prueba exacta de Fisher cuando fue necesario. La comparación entre las
diferencias de los porcentajes de positividad para la inmunohistoquímica entre pacientes
con HAP los grupos de comparación se realizó mediante la prueba de U de Mann-
Whitney. Se realizó un cálculo de las prevalencias entre los diferentes auto-anticuerpos
determinados por la inmunohistoquímica. Un valor de p≤ 0.05 fue considerado como
significativo para las diferencias observadas entre los grupos.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
29
Se utilizó un coeficiente de correlación de Spearman (rho) de una cola para
evaluar la correlación entre el grado de Heat-Edwards y el grado de positividad para
inmunohistoquímica de cada uno de los antígenos evaluados. Una correlación perfecta
es igual 1, excelente entre .8 a.99, buena de 0.7 a 0.79, regular 0.5 a 0.69, pobre 0.3 a 0.49 y
mala 0.0 a 0.29. Estos mismos valores fueron usados en su forma negativa para el
caso de correlación negativa.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
30
RESULTADOS:
En la tabla 1 y figura 7, se puede apreciar que del total de pacientes con LES
(n=18) predominó el sexo femenino 5:1, la edad promedio fue de 36±14 años (DE). Se
realizó el diagnóstico de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) por el clínico previo a la
muerte del paciente solo en 2 casos (18%), dentro de la sintomatología referida en el
expediente clínico se encontró que las cuatro principales manifestaciones clínicas fueron
disnea en 9 casos (50%), seguido de la ortopnea, tos e insuficiencia cardiaca en 6 casos
(34%), respectivamente.
Por otra parte, el desarrollo de neumonía se sospechó por el clínico en el
50% de los casos con LES, donde se encontraron 4 procesos neumónicos por hongos
(22%). Los casos con LES + HAP fueron 11, de ellos los síntomas más frecuentemente
encontrados fueron la disnea en 8 casos (73%), seguidos de la ortopnea e insuficiencia
cardiaca en 6 casos cada uno (55%).
Tabla 1.Características de los pacientes estudiados
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
31
En la Tabla 2 y figura 7, se aprecian las principales características del
tejido de autopsia en los casos analizados, donde se puede observar que los pulmones
de los casos con LES que desarrollaron HAP fueron relativamente más ligeros (805 ±
257 gr.) en comparación de los casos con LES que no desarrollaron HAP (1026 ±
592 gr.), pero no existió una diferencia estadísticamente significativa a este respecto.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
32
En cuanto a las características macroscópicas de los pulmones, en los casos con
LES que desarrollaron HAP se encontró que la mayoría eran rojizos (6 casos, 55%) y de
consistencia blanda (7 casos, 64%), microscópicamente se corroboró la presencia de algún
proceso infeccioso neumónico en 11 casos de 18 con LES, de los cuales 7 casos (64%)
correspondían a aquellos que desarrollaron HAP.
Tabla 2. Principales características pulmonares en los pacientes estudiados
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
33
En la Tabla 3 y figura 8, se aprecian los casos con LES que desarrollaron HAP,
según la gradificación de Heat-Edwards. De 11 casos con datos histológicos de
HAP, 3 casos (27%) correspondían al grado I constituido por cambios mínimos de
hipertrofia media de las arterias y muscularización de arteriolas, 2 casos (18%) con
cambios de proliferación de la íntima de arterias pulmonares (grado II), 3 casos (27%)
tenían cambios de proliferación concéntrica de la íntima de arterias y fibrosis laminar en
"hojas de cebolla" (grado III) y 3 casos (27%) tenían dilatación de pequeñas arterias con
lesiones plexiformes (grado IV), no hubo casos con lesiones angiomatoides o arteritis
Necrotizante (grados V-VI).
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
34
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
35
En la tabla 4 y figura 9, se aprecia el resultado de la aplicación de la
inmunohistoquímica para el tejido pulmonar estudiado, donde se aprecia una mayor
positividad para colágena IV en aquellos casos de LES + HAP (11 casos, 100% ) y al
comparar los casos con HAP con los pulmones de los controles sin LES se encontró una
diferencia estadísticamente significativa (p=0.008), para el caso de la laminina no hubo
diferencias para la positividad entre los casos de LES con HAP y sin HAP, sin embargo; al
comparar los casos con LES + HAP contra pulmones de los controles sin LES se
encontró una diferencia estadísticamente significativa (p=0.012) y con un valor de razón
de momios (OR) protector de 0.06; por último, aunque para los casos con LES + HAP se
encontró una alta positividad para Tenascina-C en 9 casos (82%), no existió una
diferencias estadísticamente significativa con los casos de LES sin HAP, sin embargo; al
comparar éstos casos con los controles sin LES, se encontró una diferencia estadísticamente
significativa (p=0. 012) y con un valor de razón de momios (OR) no protector de 15.75.
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
36
En la tabla 5 y figuras 10a/10b, se aprecia la comparación en la reactividad
intersticial entre los casos de LES estudiados comparando los casos con HAP y aquellos que
no la desarrollaron, donde observamos que hubo una mayor positividad leve (+) y moderada
en los casos con HAP para Tenascina-C, Colágena IV, Fibronectina, CD-34, IgG e IgM.
Sin embargo, no existió una diferencia estadísticamente significativa en todos ellos.
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
37
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
38
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
39
En la tabla 6 y figuras 11a/11b, se aprecia la comparación en la
reactividad intersticial entre los casos de LES con HAP y los controles sin LES, donde
observamos que para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++)
y alta (+++) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES
(p=0.001), para la Fibronectina hubo una mayor positividad leve (+) en los casos con
HAP en comparación con los controles sanos (p=0.001), para la Colágena IV hubo una
mayor positividad moderada (++) y alta (+++) en los casos con HAP en comparación
con los controles sanos (p=0.002), para la Serotonina hubo una mayor positividad leve
(+) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.038) y para la
Laminina de forma contraria existió una mayor positividad leve (+) y moderada (+) en los
controles sin LES (p=0. 042).
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
40
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
41
En la tabla 7 y figura 12, se aprecia el resultado de la aplicación de la
inmunohistoquímica en las arterias del tejido pulmonar estudiado, donde se aprecia una
positividad en 1 caso para la Laminina en aquellos casos de LES con HAP (9%) y al
comparar los casos con los controles sin LES donde hubo una mayor positividad
(78%) se encontró una significancia estadística (p=0.003) con un valor de razón de
momios (OR) protector de 0.03, para la Tenascina-C se encontró una positividad en 9
(82%) casos con HAP en comparación de 1 caso ( 11% ) de los controles sin LES (p=0.003)
y con un valor de razón de momios (OR) no protector de 36.00 y para la Serotonina se
encontró una positividad en 8 casos (73%) con HAP en comparación de 2 (22%) casos
de los controles sin LES (p=0.035) con valor de razón de momios (OR) no protector de 9.33.
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
42
Figura 12. Positividad arterial para los reactivos estudiados
(LES CON HAP, LES sin HAP y controles sin LES)
En la tabla 8 y figuras 13a/13b, se aprecia la comparación en la reactividad en las
arterias pulmonares entre los casos de LES con HAP y los controles sanos, donde
observamos que para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++) y alta
(+++) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.025). En el
resto de los reactantes no se encontró una diferencia estadísticamente significativa.
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
43
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
44
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
45
En la tabla 9 y figuras 14a/14b, se aprecia la comparación en la reactividad
intersticial entre los casos de LES con HAP y los controles sin LES, donde observamos que
para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++) y alta (+++) en los
casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.001), para la Fibronectina
hubo una mayor positividad leve (+) y moderada (++) en los casos con HAP en
comparación con los controles sin LES (p=0. 001), para la Colágena IV hubo una mayor
positividad leve (+) en los controles sin LES (p=0.002), para la Serotonina hubo una
mayor positividad leve (+) y moderada (++) en los casos con HAP en comparación a los
controles sin LES (p=0.038) y para la Laminina de forma contraria existió una mayor
positividad leve (+), moderada (++) y alta (+++) en los controles sin LES en
comparación de los casos de LES con HAP (p=0. 042).
Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus
46
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
47
En la tabla 10 se observa el índice de correlación de Spearman (rho) entre los
casos con LES, la positividad a los inmunoreactantes y el grado de Heat-Edwrads para los
casos que tenían HAP. Podemos observar como para la positividad de la colágena IV a nivel
arterial se encontró una significancia estadística (p=0.02), así como a nivel intersticial donde
esta significancia fue limítrofe (p=0.06).Por otra parte, la Tenascina-C demostró también
una significancia estadística (p=0. 03).
Tabla 10.- Correlación entre el grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según la gradificación de Heat-Edwards y el grado de la tinción intersticial de los diferentes
reactivos entre los casos con Lupus Eritematoso Estudiado.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
48
DISCUSIÓN:
En nuestro estudio, se observó que un 62% de las autopsias de pacientes con
Lupus Eritematoso Sistémico, presentaron datos histológicos de Hipertensión Arterial
Pulmonar, los cuales eran de leves a moderados (grados I-IV de Heat-Edwards) (Anexo IV
Fig. 15). Lo anterior, contrasta con estudios previos donde la presencia de HAP en LES se
sugiere como rara. Así por ejemplo, Quismorio 35, encontró sólo 2 casos (0.5%) con HAP
en más de 400 pacientes estudiados, en cambio; Perez y Kramer 28, observaron solo un 9% de
casos en un estudio de seguimiento a 3 años. Cabe mencionar, que en estos estudios fue detectada
la presencia de HAP en pacientes vivos usando estudios clínicos invasivos, por el contrario;
nuestro estudio demostró que la prevalencia obtenida en autopsias puede ser mayor en base a
diferentes factores, que incluyen: a) una búsqueda intencionada de las lesiones de las arterias
pulmonares, b) una mayor sensibilidad de los estudios histopatológicos y c) que los
pacientes de autopsias sufrieron una mayor severidad de la enfermedad de fondo, lo cual;
puede influir en una mayor frecuencia de involucramiento a diversos órganos.
De los 18 casos estudiados con LES un 28% presentaban solo cambios mínimos de
proliferación de las capas íntima y media de las arterias, con una discreta reacción linfocitaria
sin llegar a una vasculitis definida. Estos cambios en el endotelio, túnicas media e íntima
aparecen como normales en la histología en los grados I-II de Heat-Edwards, excepto por un
ligero engrosamiento de la media en la histología y su presencia ya ha sido descrita con
anterioridad36. En nuestros casos, hasta un 34% presentaron cambios de proliferación
concéntrica de la íntima acompañadas o no de lesiones plexiformes (Ver Anexo IV: Fig. 15 ).
Algunos autores han reportado, que la presencia de la reacción inflamatoria observada
en las arterias pulmonares sugiere fuertemente que ciertas citocinas y factores de
crecimiento celulares liberados por las células inflamatorias influyen directamente en el
desarrollo de las lesiones plexiformes (Grado IV de Heat-Edwards) 37.
En los pacientes con LES + HAP se observaron diferencias estadísticamente
significativas en la frecuencia Colágena IV y Tenascina-C en el intersticio pulmonar en
comparación con los controles sin LES, este aumento en Colágena IV y Tenascina-C puede
explicar algunas de las diferencias subyacentes en la patogénesis de la afección pulmonar de
estos pacientes ya que la Tenascina-C se ha asociado con la proliferación celular de
fibroblastos, colágena y otros componentes de la matriz extracelular. En las arterias
pulmonares de los pacientes con LES + HAP se observó una mayor frecuencia de positividad
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
49
para Tenascina-C y Serotonina que en los controles sin LES, alcanzando una
significancia estadística. La Tenascina-C puede funcionar como un disparador de la
proliferación endotelial en pacientes con enfermedad arterial pulmonar, mientras que la
Serotonina puede intervenir en algunos fenómenos de vasoconstricción que son
frecuentemente observados en estos pacientes.
En el parénquima pulmonar nosotros observamos una mayor frecuencia de tinción de
inmunohistoquímica positiva para Tenascina-C en los casos de HAP asociada a LES en
comparación con los controles con LES sin HAP. A pesar de esta mayor frecuencia no se
observó una diferencia estadística, la cual puede ser explicada por el pequeño tamaño de
muestra evaluado, que requeriría grandes diferencias para ser reflejadas en el valor de p.
Así mismo, la presencia de Tenascina-C en arterias pulmonares también fue observada
más frecuentemente en los casos de HAP asociada a LES que en los controles de LES sin HAP,
pero tampoco fue observada una diferencia estadística.
Aunque no se alcanzó diferencia estadística en la frecuencia de positividad para estos
inmunoreactantes, la intensidad de la inmunohistoquímica fue estadísticamente diferente
entre los pacientes con HAP asociada a LES y los pacientes con LES sin HAP. Hasta un
64% de los pacientes con LES + HAP tuvieron de moderada a alta positividad, para
Tenascina-C en las paredes de las arterias pulmonares, en tanto que solo el 14% de los
pacientes con LES sin HAP tuvieron esta intensidad de tinción (p=0.025). Esto sugiere que
más que la presencia o ausencia de Tenascina-C, es el grado en la producción de ésta la que
podría propiciar los cambios histológicos de HAP. En el análisis de correlación de Spearman,
los pacientes con mayor grado de HAP tuvieron un mayor grado de depósito de
Colágena IV (rho = 0.47, p=0.02) y Tenascina-C (rho=0.43, p=0.03) respectivamente en las
arterias.
La Colágena IV es un constituyente de la matriz extracelular de la mayoría de los
órganos y ocupan entre un 15-20% del peso seco del pulmón 13. En los vasos sanguíneos, la
colágena IV fundamentalmente se encuentra en membranas basales y puede ser producida
por algunos fibroblastos. A este respecto en nuestro estudio, encontramos una positividad
intersticial para la Colágena IV en el 94% de los casos con LES, en comparación de un
89% de los controles sin LES (p<0.05), lo que sugiere una proliferación de Colágena IV
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
50
intersticial pulmonar en pacientes con LES asociada a HAP ( Ver Anexo IV: Figura 16 ).
En el análisis de correlación de Spearman, los pacientes con mayor grado de HAP tuvieron
un mayor grado de depósito de Colágena IV representado por un valor limítrofe de la rho
de Spearman = 0.38, p=0.06.
En cuanto a otros componentes de la matriz extracelular en los pulmones, se
observó una positividad variable para Fibronectina y Laminina 36-37. Ambas substancias, son
importantes glicoproteínas constituyentes de las membranas basales, promueven el
desarrollo, diferenciación y movilidad de una gran variedad de células incluyendo las
células endoteliales, constituyendo un estímulo para que dichas células formen luces
capilares 38-39. También se ha demostrado que estas substancias promueven la invasión
tisular y metástasis en tumores, así como la producción de Colágena IV 39-41. En nuestro
estudio, encontramos un aumento en la frecuencia de positividad en el intersticio pulmonar
y en las arterias pulmonares de los casos con LES + HAP, que puede hablar de un estímulo
para la producción de esta substancia que lleva a la proliferación vascular en pacientes con
LES (Ver Anexo IV: Fig. 17).
Para el caso de la fibronectina observamos una mayor positividad a nivel
intersticial en los casos de LES + HAP con significancia estadística, en comparación de los
controles sin LES (p<0.05). La fibronectina es una proteína de importancia en la
formación de fibrillas en el intersticio pulmonar, promueve la adhesión, migración,
cito-diferenciación, fagocitosis y crecimiento celular. Se encuentra principalmente en
membranas basales, alrededor de células de músculo liso y alvéolos. Esto explica
nuestros hallazgos que indican positividad tanto en vasos sanguíneos como en
intersticio pulmonar (Ver Anexo IV: Fig. 18).
En el caso de la Serotonina, esta fue observada principalmente en los casos de LES
con HAP en comparación con los controles sin LES (73%, p=0.035). La Serotonina se asocia
a mecanismos de migración celular y vasoconstricción, es liberada por ciertas células
inflamatorias (macrófagos). En un estudio realizado en pacientes con Hipertensión Pulmonar
Primaria (HPP) se demostró una mayor frecuencia de la variedad LL del receptor para Serotonina
a nivel pulmonar, así como una mayor proliferación de las células musculares lisas arteriales
en comparación de los controles 42. Lo anterior puede compararse con nuestros hallazgos en
los casos de LES + HAP, pudiendo contribuir a explicar los cambios histopatológicos arteriales
en estos pacientes (ver Anexo IV: Fig. 19).
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
51
El hallazgo más interesante de nuestro estudio, es el incremento de la expresión de
Tenascina-C en pacientes con HAP asociada al LES. La Tenascina-C, es una
glicoproteína de la matriz extracelular asociada a la proliferación celular durante la
embriogénesis y algunos procesos patológicos. En un estudio realizado en ratas se observó
una amplia distribución de esta substancia en la túnica media y subendotelio de vasos
sanguíneos que fueron sometidos a un estress hipertensivo continuo y la expresión de
esta substancia fue asociada al desarrollo de cambios de hiperplasia e hipertrofia vascular 43.
Esta Tenascina-C, podría estar implicada en la génesis de la HAP en LES. Nosotros encontramos
que hasta un 82 % de los pacientes con LES + HAP tuvieron Tenascina-C positiva,
comparada con solo el 43% de pacientes con LES sin HAP. Cuando comparamos la
intensidad de la tinción para Tenascina-C en los pacientes con HAP asociada a LES
tuvieron una mayor intensidad en comparación con el grupo de LES sin HAP. Esta
intensidad para Tenascina-C correlacionó también con el grado de HAP por Heat-Edwartds
observándose que en aquellos pacientes con mayor grado de intensidad tenían un mayor grado
de HAP (ver Anexo IV: Fig. 20).
En un estudio realizado en ratas, la Tenascina-C fue relacionada a la remodelación
muscular cardiaca 44. Otro estudio, también realizado en ratas demostró la inducción de la
síntesis de Tenascina-C por las arterias siguiendo a los cambios en el fenotipo de las células
musculares 45. En niños con defectos cardiacos congénitos quienes desarrollaron HAP, se ha
sugerido que la Tenascina-C a nivel de las arterias funciona como un modulador del
factor de crecimiento vascular epidérmico, ligado a la proliferación de las células musculares
lisas de la íntima además, en presencia de fibronectina se facilita un gradiente para la migración
de las células musculares de la media a la íntima 46. Algunos autores han propuesto que la
Tenascina-C interviene en la activación de los fibroblastos, generando stress mecánico sobre
la pared del vaso arterial, lo que originaría una cascada de producción de componentes de la
matriz extracelular 47. Múltiple evidencia existe de que la Tenascina-C se incrementa por
diversos factores entre los cuales destaca el stress mecánico 48-49.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
52
Nosotros proponemos el siguiente esquema para explicar el papel de la Tenascina-C
en la HAP secundaria al LES:
El presente estudio tiene diversas limitaciones: resalta que los casos con LES fueron
más jóvenes (36±14 años) en comparación de los controles sin LES (54±15 años). Esta
diferencia de edad podría incrementar la expresión de algunas substancias en los sujetos
más viejos, lo cual podría disminuir las diferencias observadas en nuestro estudio,
desgraciadamente el pequeño tamaño de muestra impide un ajuste estadístico por edad,
por lo que los resultados deberán de ser considerados a la luz de esta limitación.
Otra limitante es la posibilidad de que importantes antígenos se hubieran perdido
durante el procesamiento; sin embargo, esto no constituiría un sesgo de evaluación
diferencial ya que tanto en los pacientes con Lupus + HAP como los de Lupus sin HAP o
los controles sin enfermedad autoinmune, estos antígenos tendrían la misma probabilidad de
perderse y los riesgos permanecerían siendo los mismos.
Por otro lado, el investigador que evaluó la positividad de los reactantes de la
inmuhistoquímica se encontraba ciego a los valores de la clasificación de Heat-Edwards,
esto disminuye los sesgos en la evaluación de las variables independientes y es una
fortaleza de nuestro estudio.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
53
Nuestro trabajo da algunas aportaciones importantes que deben de tomarse en
cuenta; 1) Pocos estudios han abordado las características inmunohistoquímicas de los
pacientes con LES que desarrollaron HAP, 2)En su mayoría, los estudios adolecen de
controles y se limitan a series de casos, 3)Este estudio posibilita hacer comparaciones
con controles con LES sin hipertensión pulmonar y controles sin enfermedad
autoinmune, 4)El estudio sugiere que la Tenascina-C juega un papel importante en la
génesis de la hipertensión arterial pulmonar en el Lupus Eritematoso Sistémico, 5)Nuevos
estudios incluyendo modelos experimentales podrán ser realizados en base a nuestros
resultados para investigar el papel de la Tenascina-C en la génesis de la Hipertensión
Arterial Pulmonar en estos pacientes, 6)Nuevas aportaciones en otros centros hospitalarios
son requeridas para confirmar los datos observados en nuestro estudio.
Por último cabe mencionar que, el presente estudio es el primero en su tipo que
evalúa en un diseño más sólido la presencia de reactantes de inmunohistoquímica en
pacientes con Lupus e Hipertensión Arterial Pulmonar comparado con controles. El
presente trabajo, permite considerar que la Tenascina-C, que no ha sido anteriormente
involucrada en la génesis de la hipertensión pulmonar en LES, puede tener un papel
importante en el desarrollo y progresión de esta Hipertensión Arterial Pulmonar. Otros
estudios derivados de la medición en vivo de esta sustancia con seguimiento de
pacientes, pueden ser útiles para evaluar la validez de nuestros hallazgos.
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
54
CONCLUSIONES:
1. Se observaron datos histológicos de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en 62%
de las autopsias de pacientes con lupus eritematoso sistémico.
2. La presencia de Tenascina-C en el parénquima pulmonar fue más frecuente en los casos
de LES + HAP que en LES sin HAP aunque sin alcanzar diferencia estadística.
3. A nivel intersticial los pacientes con LES + HAP presentaron una mayor frecuencia de
positividad para Colágena IV y Tenascina-C que para los controles sin enfermedad
autoinmune.
4. En las arterias pulmonares los pacientes con LES + HAP, se observó una mayor
frecuencia de positividad que los controles sin enfermedad autoinmune en Serotonina
y Tenascina-C.
5. Se observó, una diferencia estadísticamente significativa en la intensidad de positividad
para Tenascina-C en las arterias pulmonares de pacientes con HAP, en comparación
con aquellos sin HAP.
6. Hasta un 64% de los pacientes con LES + HAP tuvieron de moderada a alta
positividad, comparado contra solo el 14% de los pacientes con LES sin HAP
(p=0.025).
7. Una correlación estadísticamente significativa fue observada entre el grado de
Hipertensión Arterial Pulmonar (Heat - Edwards) y el grado de depósito de
Tenascina-C (rho= 0.43, p= 0.03) y para la Colágena IV (rho= 0.47, p=0.02) a nivel
arterial.
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ANEXOS:
Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus
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ANEXO IV: FOTOGRAFÍAS MICROSCÓPICAS:
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