Seminario: Bacillus thuringiensis (Bth)

y sus aplicaciones...

Alejandro Crosa & Juan Pablo Oliver

Agroquímicos I

Noviembre 2006

Bacilo Gram +Esporulador

Aerobio FacultativoDistribuido en el AmbientePatógeno natural de InsectosICP (inclusiones cristalinas paraesporales)

Cry I => LepidópterosCry II => Lepidópteros, DípterosCry III => ColeópterosCry IV => Dípteros Cry V => Lepidópteros, ColeópterosCyt => Mosquitocidal y Citolítica

Receptores de membrana:

Caderinas

Aminopeptidasa N (APN)

Fosfatasa alcalina

entre otras...

1 a 2 nm

Productos a base de toxinas BthInsectecidas a base Bth:

1era Generación: esporas y cristales

2da Generación : esporas y toxinas expresadas con otras bacterias

3era Generación : bacterias recombinantes muertas

4ra Generación : quimeras proteicas de toxinas

Forma de Aplicación de toxinas de BthDispersión superficial de la pro-toxina y se deja secar

Microgoteo de pro-toxina más una atrayente (como sacarosa)

Aspersión, barnizado o inmersión de la pro-toxina (hoja, tubérculos, tallos)

Toxicidad:

Nula => Animales superiores

Nula => Insectos no blanco (artropodos, abejas y abejorros)

Advertencias y precauciones :

Aplicación estados tempranos de Lepidópteros

No mezclar con sust. de pH básico

Persistencia: Baja

Los cristales de Pro-toxina son solubles en agua

Captafol, captan, Demeton S-etil, Difolatan, Dimetoato, Dinocap, Fentoato, Fosalon,

Isoprocarb, Leptofos, Propargita, Propoxur y

Tetraclorvinfos.

Acefato, Azinfos metil, Carbofurano, Clordimeform,

Diazinon, Dicofol, Diflubenzuron, Endosulfan,

Fenitrotion, Hidrácida maléica, Malatión, Maneb,

Metomilo, Mevinfos, Monocrotofos, Paration (etil

paration), Paration metil, Permetrin y Triclorfon,

Verticillium lecanii y Zineb.

Bacillus thuringiensisvariedad kurstaki

No CompatibleCompatible

IPM: Compatibilidad con otros Agroquímicos

Productos a base de toxinas Bth

2Ab1LepidópteroskurstakiBioprotec

10Aa1, 11Aa1 , CytAaDípteros israelensisTeknar

TransconjuganteLepidópterosaizawaiGC91 (T)Agree

DesconocidoLepidópteroskurstaki SA12Coestar

DesconocidoLepidópteroskurstakiAble

Termo Trilogy Cop.

β-exotoxinaDesconocidodesconocidoDibeta

1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterosaizawaiThuricide

1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterostenebrionisNovodor

4Aa1, 4Ba1 , 10Aa1 , 11Aa1 , CytAa, 3Aa3

Coleóptero DípteroisraelensisGnatrol

1Aa1, 1Ab1 , 1A c1, 2Aa1 , 2Ab1

LepidópteroskurstakiDipel, Biobit

Abbott Labs.

ProteinasBlancoVariedadNombre ComercialCompañía

Productos a base de toxinas Bth

Métodos de Transformación

• Naturales: Agrobacterium tumefaciens

Vectores Virales.

• No Naturales: BioBalística (fuerzabruta).Protoplastos.

• Mixtos: Agrolística.

Etapas en el desarrollo de Plantas Transgénicas

1) Clonado: · Identificación.· Clonado· Secuenciación

2) Diseño de la · Promotor.construcción: · Targeting.

· Selección.

3) Transformación: · Selección del método de transformación.

4) Selección: · Sistema de selección.· Eliminación del gen de selección.

Agrobacterium tumefaciens

Ciclo Natural de Infección

Sistema Binario

Procedimiento1) Incubación de A. tumefaciens

con explantes (cocultivo).2) Regeneración de explantes

infectados con hormonas (auxinas y citoquininas). Eliminación de A. tumefaciens, incubación en medio selectivo. Producción de callos.

3) Producción de brotes.4) Transferencia de brotes a

medio de cultivo.5) Crecimiento en tierra.

Limitaciones

• Poco eficiente en monocotiledóneas.

• Los genes se incorporan únicamente en el genoma nuclear, no sirven para transformar cloroplastos.

Biolística• Permite transformar prácticamente todas las plantas

y también permite transformar los genomas de mitocondrias y cloroplastos (los cuales son generalmente de herencia “materna”).

• Se utilizan proyectiles de oro o tungsteno de aproximadamente 1 µm de diámetro.

• Las partículas son aceleradas por el uso de gas Helio o Nitrógeno de alta presión. Alcanzan velocidades de más de 440 m/s (necesarias para la penetración).

• En general la primera línea de células muere por el impacto, pero las células enseguida por debajo sobreviven.

Biolística

Limitaciones

• Alto grado de daño al tejido.

• Relativamente bajo grado de transformantes estables (1 – 5 % de las células).

• Grandes variaciones entre cada experimento, los niveles de expresión génica son totalmente diferentes entre cada experimento.

• Limitaciones en el tamaño de las construcciones.

Agrolística• Combina la transformación de por Biolística con la mediada

por A. tumefaciens.

• Se incorporan a la construcción los genes virD1 y virD2, bajo la regulación del promotor p35S CaMV. Esto permite la correcta escisión de la hebra-T in planta. Aumenta mucho la frecuencia de transformación.

• Las construcciones se cotransforman por bombardeo de partículas.

Transformación de Protoplastos

• Métodos: · Electroporación.· Shock osmótico.· Otros.

• Limitaciones: Bajo · 1 – 2 % de transformantes.rendimiento

· 0,1 % de regeneración.

Consideraciones finales• Efecto de la posición:

· Existe una gran variación en los niveles de expresión de los transgénicos.

· Baja correlación entre el número de copias del transgen y el nivel de expresión.

• Patrones de integración:

· Los transgenes se pueden integrar en varias copias con una correlación directa o invertida.

· La presencia de repetidos, especialmente de orientación inversa, se correlaciona con el fenómeno de silenciamineto génico (cosupresión).

EL PODER CONTROLAR EL PATRÓN DE INTEGRACIÓN Y

ELIMINAR EL NÚMERO DE COPIAS EXTRA DE UN

TRANSGEN ES UN OBJETIVO PRIORITARIO DE LA

INVESTIGACIÓN EN EL CAMPO DE LA BIOLÓGÍA

MOLECULAR VEGETAL

Preguntas?

y el futuro?

Muchas gracias