Preparación de tejidos

Introducción a la Histología

Definir que es un tejido celular.

Enumerar los diferentes tipos de tejidos y su clasificación.

Describir los diferentes pasos del procesamiento histológico paramicroscopía óptica y electrónica.

Identificar el colorante y técnica apropiados para la demostraciónde un tejido o estructura celular específicos.

Identificar, a partir de imágenes, secciones teñidas con tincionestopográficas, histoquímicas, inmunocitoquímicas,inmunofluorescencia, micrografías electrónicas de transmisión yde barrido.

Concepto de Tejido

• Los tejidos son agrupaciones funcionales de células

• Conjunto de células ordenadas en una formaciónregular.

• Entramado, fisiológicamente útil al organismo,constituido por células especializadas morfológica yfuncionalmente.

• ....

Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006

Concepto de Histología

• Término procedende del griego "histos" que significa tejido detelar y "logos" que significa estudio o aprendizaje. Histologíapuede definirse como el estudio de los tejidos

• Histología: Ciencia que estudia la estructura, la organización,la función y la capacidad de respuesta de los tejidos

• Histología: Ciencia que estudia los entramados celulares,fisiológicamente útiles para el organismo, que están constitudospor células especializades morfológica y funcionalmente

• Histología general: Rama de la Histología que comprende la Citología y elestudio de los tejido báicos.

• Histología especial: Rama de la Histología que comprende el estudiomicroscópico de órganos y sistemas.

Tejidos fundamentalesClasificación

• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares

• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo

• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco

• Tejido nervioso

Procesamiento histológico paramicroscopía óptica

• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías

Fijación

• Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc...

• Endurecer el tejido para permetir su manipulación y

evitar alteraciones morfológicas.

• Mantenimiento de la citoarquitectura y ultraestructura.

• Mantenimiento in situ de las moléculas(Importante para determinaciones histoenzimáticas e inmunocitoquímicas)

Fijadores: aldehidos, alcohol, mercurio, ácido pícrico

Formol: formaldehido + metanolParafolmadehido + tampón fosfatoBouin: ácido pícrico + formol + ácido acético

http://www.bris.ac.uk/depts/PathAndMicro/tutorials/sam/samples.html

Métodos de Fijación

Fijación por inmersión

10 volúmenes de fijadorTiempo: 4-24 horas

Fijación por perfusión

Perfusión: 10 minutosPostfijación por inmersión: 4-24 horas

Inclusión en parafina

Inclusión en parafinaInfiltración

Inclusión en parafinaConfección de bloques

Microtomo de parafina

Obtención de secciones o corteshistológicos

• Cortes de parafina 5–10 µm (Microtomo de parafina)

• Cortes por congelación: 5-30 µm (Criostato)

• Cortes vibratomicos 30-50 µm (Vibratomo)

• Cortes semifinos: 1-2 µm (Ultramicrotomo)

• Cortes ultrafinos: 300-700 Å (Ultramicrotomo)

Grosor de los cortes

Tinciones histológicas

• Técnicas topográficas

• Técnicas específicas

• Técnicas histoquímicas

• Técnicas inmunocitoquímicas

Tinciones

• Tinciones topográficas: basadas en la interacción desustancias colorantes con las estructuras celulares y tisulares.

– Colorantes iónicos ácidos: Tienen afinidad por estructurastisulares con carga positiva

– Colorantes iónicos básics: Tienen afinidad por estructurastisulares con carga negativa

Ejemplo: Tinción Hematoxilina-Eosina

Tinción de Hematoxilina-Eosina

• Hematoxilina– Colorante iónico básico (carga positiva)

Tiñe estructuras con carga negativaNúcleos de color azul(basófilos)

• Eosina– Colorante iónico ácido (carga negativa)

Tiñe estructuras con carga positivaCitoplasmas de color rosado(esosinófilos)

Técnica de tinción

Tinciones. Método

Montaje de las preparaciones

• Para observar con el microscopio óptico los cortes teñidos seprocede a montar las preparaciones utilizando una sustanciacementante (medio de montaje) y un cubreobjetos.

• El medio de montaje facilita la observación y si se trata de unmedio de montaje permanente estabiliza la coloraciónhistológica durante mucho tiempo.

Observación al microscopioObtención de microfotografías

Técnicas histológicas específicas

• Técnicas para el tejido conjuntivo: tricrómicode Masson, van Gieson

• Glucógeno: carmin de Best

• Mucinas: azul alcian, mucicarmín

• Lípidos: oil red O, negro sudán B, OsO4

• Ácidos nucleicos: naranja de acridina, verdede metilo-pironina

Tricrómico de Masson

Van Gieson

Técnicas histológicas específicasTejido conjuntivo

Técnicas histológicas específicasMucinas

Azul Alcián

Mucicarmin

Oil red O

Técnicas histológicas específicasLípidos

Oil red O

Técnicas histológicas específicasÁcidos nucleicos

Naranja de acridina

Verde de metilo - pironina

Técnicas histoquímicas

• PAS (ácido periódico de Shiff): detección de carbohidratos– Ácido periodico que actúa sobre los carbohidratos produciendo la formación

de grupos aldehidos que son los que reaccionan con el colorante

• Lectinas: detección de residuos glucosilados– Lectinas biotinadas. Tripsina o neuraminidasa para exponer los residuos

escondidos. Avidina peroxidasa. Revelado con DAB

• Reacción de Feulgen: detección de ADN– Hidrólisis de la unión purina-deoxirribosa con HCl para formar aldheidos

que reaccionan con el colorante

• Técnicas histoenzimáticas: detección de proteínas enzimáticas

Implican una reacción química: transformación de unproducto en otro diferente con característicasdiferenciables

PASAzul Alcian / PAS

Detección histoquímica de carbohidratos

Detección histoquímica de ADN

Feulgen

Detección histoquímica de residuosglucosilados

Lectina de tomate

Revelado de la peroxidasa

H2O 1/2 O2+ DAB

Técnicas histoenzimáticas

• Detección de una fosfatasa: NDPasa

ADP P + AMP

Nitrato Pb

Fosfato de Pb

Sulfuro de Pb

NDPasa

Sulfuro amonio

NDPasa

Técnicas inmunocitoquímicas

• Se basan en el empleo de anticuerpos dirigidoshacia epitopos (grupos con característicasantigénicas) concretos de moléculas

• Los anticuerpos son proteinas séricas(inmunoglobulinas) sintetizadas por las célulasplasmáticas, derivadas de los linfocitos B activadostras reconocer un antígeno extraño (inmunógeno).Usualmente se utilizan IgG o IgM

•Anticuerpos policlonales: conjunto de anticuerpos específicos para uninmunógeno (diferentes epitopos)•Anticuerpos monoclonales: específicos de un epitopo único de uninmunógeno

Anticuerpos

Policlonales Monoclonales

Detección inmunocitoquímica de GFAP

Biotina

Avidina

Peroxidasa

AntigenoGolgi

Astrocitos

GFAP: Glial fibrilar acidic protein

TNF-alfa macrófagos Melanoma, TGF-alfa

Nódulo linfoide, Ki-67 Páncreas, insulina

Tinciones inmunocitoquímicas

BL6 nuclear PNA citoplasmatico

Tinciones inmunocitoquímicasDobles mardados

Inmunofluorescencia

Moléculafluorescente

Microscopio de Fluorescencia

Preparación

Filtro barrera

Espejo dicroicoFiltro excitación

Inmunofluorescencia: dobles marcados

GFAPHSP47

Tinciones inmunocitoquímicaspor inmunofluorescencia

Aparato de GolgiMicrotúbulosNúcleo

Cultivo de células renales Cultivo de células Hella

TubulinaActinaNúcleo

Cultivo células musculares lisas

A-SM Actinab-NM Actina

Microscopía Electrónica de Transmisión

• Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxidode osmio

• Deshidratación• Inclusión en resinas epoxi• Ultramicrotomía: secciones

ultrafinas• Montaje sobre rejillas• Contraste de las rejillas

con metales pesados(citrato de plomo)

• Observación al microscopio

MicroscopíaElectrónica deTransmisión

Microscopía Electrónica de barrido(Scanning)

• Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxidode osmio

• Deshidratación• Desecación por unto crítico• Sombreado con oro• Observación al microscopio

http://www.mos.org/sln/sem/seminfo.html

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Health & Medicine

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