Post on 12-Mar-2020
1. PSD se refiere a un método de detección y medida
de las masas de fragmentos de iones que se forman
a partir de un ión precursor seleccionado.
2. Los fragmentos de iones se forman principalmente
por descomposición unimolecular después que los
iones precursores están completamente acelerados
(después que dejan la fuente de iones, en el tubo de
vuelo, de ahí el nombre de post-source decay)
3. Los fragmentos de iones son separados y
detectados en el reflectrón.
Post Source Decay (PSD)
Detector
Iones de igual m/z con velocidades diferentes
Reflectron (espejo iónico): compensa la variación de energía cinética de los
iones al abandonar la fuente (100 eV a 1 keV) reflejando los iones hacia atrás
a lo largo del mismo camino de vuelo antes de detectarlos.
La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un
“espejo iónico” o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y
luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía
cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los
tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa.
Laser
ReflectronFuente
Detector
lineal
Detector
reflector
La descomposión
tiene lugar en
cualquier punto del
tubo de vuelo
La descomposición tiene lugar en el tubo
de vuelo.
No.
de
iones
Energía interna
Los fragmentos se obtienen por descomposición de los iones originales, que ocurre en el tubo de vuelo, es
decir, después de que los iones salieron de la fuente.
La descomposición se debe a la energía interna del ión precursor. Sólo una pequeña fracción de los iones
precursores tiene suficiente energía para fragmentarse. Esta energía puede aumentarse usando una
intensidad del laser mas elevada.
EL FUNDAMENTO DE PSD
Cuando los iones precursores se fragmentan, la
velocidad de los fragmentos es igual a la del precursor,
por lo cual viajarán todos juntos en el tubo de vuelo.
Esto se debe a que la velocidad es determinada por la
aceleración inicial; si la energía inicial es 20 keV, las
energías de la unión química están alrededor de 10 eV,
de modo que la ruptura de una unión tendrá un efecto
mínimo sobre la velocidad.
Los aparatos usados tienen un selector de velocidad
(Bradbury-Nielsen gate), que permite seleccionar al ión
precursor y a sus fragmentos para que pasen a su
través y lleguen al reflectrón.
El ión molecular precursor intacto tiene una energía cinética traslacional KEM = ½ Mv2, siendo M su
masa y v su velocidad. Un fragmento del ión precursor tiene una energía cinética traslacional KEm =
KEM (m/M), siendo M la masa del precursor y m la del fragmento.
Estas diferencias hacen que los iones precursor e hijos sigan diferentes caminos en el reflectrón. ¿Cómo
se hace para que los fragmentos que están viajando a la misma velocidad que el precursor pero tienen
una energía cinética reducida lleguen enfocados al detector? Variando la pendiente del gradiente de
voltaje del reflectrón a través del rango de masas de los fragmentos. Esto llevaba tiempo, y se ha
solucionado en los sistemas de MALDI-ToF-ToF, que tienen un dispositivo que re-acelera los fragmentos
y iones moleculares remanentes y luego se los re-enfoca. Esto permite obtener el espectro completo de
iones a un voltaje fijo del reflectrón.
La secuenciación de péptidos usando PSD MALDI ha sido posible en principio desde
hace mucho tiempo, pero se la usaba poco por su difícil interpretación. Hubo un
avance dramático con el desarrollo de la derivatización del péptido antes de la PSD,
sulfonando el NH2 terminal.
La sulfonación dirige la fragmentación a la unión peptídica, dando los fragmentos b e y,
y neutraliza los fragmentos b, que tienen el NH2 terminal del péptido, con lo cual se
obtiene una serie única de iones y. La distancia entre dos picos adyacentes del
espectro representa un aminoácido.
Dos reactivos comunes para sulfonación son ”CAF” y
”SPITC”:
N O
O
O
O
H2N
H
Pep
R2
+H
R2
Pep
O
NHS
O
OHO
S OH
O
O RT, pH>9
NHS-ester of 3-Sulfo-
propionic acid anhydrideMass addition, +136 Da
Agrega 215 Da al N-terminal y a cadenas laterales de Lys.
•El digerido tríptico se analiza por PMF.
•Para evitar la sulfonación de los e-aminos de Lys se pueden bloquear las Lys por
reacción con imidazol, que agrega 68 Da/Lys. Esto es específico, y no afecta al N-
terminal. Si no se lo hace, se observarán después de la sulfonación sólo los péptidos
con Arg. Luego se hace la sulfonación con el reactivo.
•La mezcla de péptidos modificados se analiza de nuevo por MALDI.
•Se buscan las masas que representan péptidos con Arg o Lys terminal, o sea los que
aumentaron su masa en 136 o 204 Da (si se utilizó el CAF).
•Se pasa el aparato de MALDI a PSD y se selecciona esa masa de péptido.
•Se hace el análisis de PSD, que lleva aproximadamente 2 minutos en un TOF/TOF
MALDI.
Procedimiento experimental
Peptide mass fingerprinting de la aconitasa de Trypanosoma cruzi (- / + sulfonación)
Secuenciación por Post Source Decay (PSD) de péptidos trípticos de la aconitasa
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR PEPTIDE
MASS FINGERPRINTING (PMF)
• La muestra reducida y alquilada (en un fragmento de gel o mancha) se digiere
con una proteasa (tripsina?).
•La mezcla de péptidos resultante se analiza por MALDI-ToF-MS.
•La lista de masas de péptidos se utiliza para escanear un digerido in-silica de
una base de datos de secuencias por Internet.
•El resultado de la búsqueda se presenta como probability scores y otras
medidas de confianza.
•La homogeneidad de la muestra y la precisión de la medida son factores muy
importantes para una interpretación segura de los resultados.
1326.8
05
1173.6
52
1394.8
46
1715.9
84
873.4
71
1786.8
88
835.4
27
1751.7
97
1587.9
00
1430.8
71
914.5
55
1135.6
51
2270.0
86
1927.9
41
2071.0
08
742.4
10
1366.6
84
1522.9
32
1106.5
92
1258.7
29
940.5
05
971.5
49
1055.6
14
2306.0
46
2497.3
09
1870.9
13
2110.0
59
1993.9
65
663.8
19
1557.7
46
1657.8
11
2211.1
07
2669.2
96
2319.1
40
2375.1
23
2991.5
41
3070.5
87
2872.3
56
0
1
2
3
4
5
4x10In
tens. [a
.u.]
750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000m/z
PMF of band # 3
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
MDH-1
MDH-2
EDMAN
SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS
La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues
permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una
proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de
afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas,
p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin
efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos
específicos.
La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método
desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155
residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos
Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los
sitios en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos
para continuar la etapa siguiente. Se efectúa con el residuo C-
terminal ligado a una resina, lo que permite eliminar facilmente
subproductos.
INTRODUCCION
A LA
PROTEOMICA
GENOMA Y PROTEOMA
GENOME: “GENes and ChromosOMEs” (Winkler,
1920): Conjunto completo de los cromosomas y
sus genes.
PROTEOM E: Conjunto completo de las proteínas
de un organismo (el conjunto de proteínas
codificadas por un genoma, Wilkins y Williams,
1994; Wasinger et al., 1995) .
La secuenciación de los genomas se hizo posible con la
introducción de los métodos de secuenciación del ADN, a partir
del establecimiento del método utilizando dideoxynucleótidos
por Frederick Sanger, en 1975, que le permitió secuenciar el
genoma completo del bacteriófago X174, con 5,375 pares de
bases, en 1977. La primera secuenciación completa del genoma
de un organismo de vida libre fué la de Haemophilus influenzae
(1.8 Mb), en 1995. El Human Genome Project comenzó en
1990 y se completó en 2003; la estimación del número total de
genes en el genoma humano es de entre 20,000 y 25,000. Al 8 de
Abril de 2019 la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
(KEGG) registraba ya 491 genomas eucarióticos completos,
además de 5092 genomas de bacterias y 287 de Archaea.
DETERM INACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES
Determinación de las características químicas, bioquímicas y
biológicas de las proteínas.
1) Estructura molecular .
2) M odificaciones post-traduccionales.
3) Capacidad de unir ligandos.
4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion
intracelular .
5) Especificidad de tejido, célula y organela.
6) Especificidad de sexo.
7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post
natal y de envejecimiento.
Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran
en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas
ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El
DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás.
ADN
Transcripción
Pre-mARN
“Splicing” alternativo
mARN 1 mARN 2 mARN 3
Traducción
Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3
Modificación
Post-traduccional
y/o Proteólisis
Prot. 1’ Prot. 1’’ Prot. 2’ Prot. 2’’ Prot. 3’ Prot. 3’’
¿HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES?
Para la funcionalidad adecuada de una
proteína se requiere mucho mas que la integridad
del gen estructural que la codifica. Si este está
mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la
proteína no será funcional. Pero puede suceder
algo parecido si el gen estructural está intacto, pero
hay mutaciones en otros genes que participan en lo
que realmente le interesa a la célula, que es la
proteína perfectamente plegada, con las
modificaciones post-traduccionales requeridas y
localizada en el compartimento subcelular correcto.
LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS.
Gen estructural
Genes que codifican factores de transcripción. Genes que codifican chaperonas necesarias
para el plegamiento correcto.
Genes que codifican proteínas regulatorias. Genes que codifican enzimas que modifican
post-traduccionalmente a la proteína.
Genes que codifican proteínas que modifican Genes que codifican proteasas de
la estructura de la cromatina. procesamiento.
Genes que codifican proteínas de
transporte e integración a organelas.
Secuencias regulatorias en el ADN Genes que codifican proteasas
(“enhancers”) que degradan a la proteína
Proteína madura,
correctamente localizada,
en la concentración necesaria
DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA.
1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma
humano, y que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más
proteínas, el número total de proteínas en un organismo
superior puede variar entre 50,000 y 500,000.
2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que
los ácidos nucleicos. La composición y secuencia de
aminoácidos de una proteína determina: a) su masa molecular;
b) su carga total a diferentes valores de pH; c) su
hidrofobicidad; d) su forma, es decir el plegamiento de la
proteína nativa. Esto a su vez determina la solubilidad de las
proteínas en diferentes solventes, su comportamiento en los
métodos de separación y purificación, y su vida media in vitro.
La diversidad de propiedades fisicoquímicas es muchísimo mayor
que la de los ácidos nucleicos.
3) Los valores de pI de las proteínas varían entre menos de 3 y
más de 12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5
y el otro alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango
estrecho de pI, en la zona ácida.
4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas,
en tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello
insolubles en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas
totales nunca entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema
hidrofobicidad.
5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos
miles y varios millones de Daltons, y su tamaño no puede
predecirse con certeza a partir de la secuencia de aminoácidos
derivada de la secuencia de DNA, por las modificaciones post-
traduccionales.
6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango
muy amplio, probablemente mayor que el rango de los mRNAs.
La diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras
en los flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud.
LAS HERRAM IENTAS PARA EL ESTUDIO DEL
PROTEOM A
La técnica clásica, y hasta hace unos pocos años, la
principal utilizada, es la separación de las proteínas por
electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida,
seguida de identificación de dichas proteínas por
secuenciación o, en general actualmente, por espectrometría
de masa, después de hidrólisis enzimatica parcial.
Actualmente lo mas utilizado para estudios amplios de
proteómica son otras combinaciones de técnicas, por ejemplo
cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con
espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien
combinada con espectrometría de masa. Este tipo de técnicas
permite la identificación de proteínas en mezclas complejas,
previa hidrólisis enzimática parcial.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Electrophoresis 2000, 21, 2610-16
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA.
Ventajas:
Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000
proteínas en un solo gel. Es una técnica capaz de analizar
simultáneamente miles de proteínas.
Desventajas:
1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes
condiciones de rango de pH y de concentración de acrilamida, para
resolver las mezclas muy complejas.
2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy
ácidas o muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas) .
3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el
material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden
variar en concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver
proteínas minoritarias, es necesario en general purificar la organela
en que se encuentran y trabajar con ese material. Tambien se
puede trabajar previa marcación radioactiva, para aumentar la
sensibilidad de detección.
EDMAN MALDI-ToF-MS
SensibilidadBajo pmole (6x1011
moléculas; 67 ng albúmina)
Bajo fmole (6x108
moléculas; 67 pg albúmin
Costo US$ 150/peptido < 1 ¢/analisis
Tiempo de análisis Overnight Pocos minutos
Número de frascos de cultivo necesarios
100-150 1
Identificación de proteínas por EDMAN vs MALDI-ToF-MS
Electroforesis diferencial en gel (DIGE).
Se marcan las dos muestras de proteína que se quieren comparar
con dos colorantes diferentes, reactivos con el amino, y diseñados
para mantener la misma movilidad relativa.
Se mezclan las dos muestras de proteínas marcadas y se las corre
en un mismo gel bidimensional.
Después de la corrida se crean dos imágenes de fluorescencia del
gel que se superponen para identificar diferencias en el patrón.
Esta técnica hace innecesario comparar geles diferentes.
Está disponible comercialmente.
El método ICAT permite medir la
expresión diferencial de proteínas.
Estructura del reactivo ICAT: ICAT
consiste de un grupo biotina para
afinidad, una región intermedia que
puede incorporar átomos de deuterio o
de hidrógeno, y un grupo terminal
reactivo de tioles para unirlo a cisteínas.
Estrategia de ICAT: Las proteínas se
cosechan en dos estados celulares
diferentes y se marcan en los residuos
de cisteína con la forma liviana o la
pesada del reactivo ICAT. Después del
marcado, las dos muestras de proteína
se mezclan y se digieren con una
proteasa, como la tripsina. Los péptidos
marcados con el ICAT pueden ser
purificados usando cromatografía de
afinidad con avidina. Siguiendo la
purificación, los péptidos marcados con
ICAT son analizados por MS para
cuantificar las relaciones entre los picos
y las proteínas se identifican por
secuenciación con MS/MS.
Isotope-coded affinity tags (ICAT)
Si bien la idea última detrás de los estudios de
proteómica es llegar algún día al conocimiento completo
de las proteínas de un organismo, lo mas frecuente
actualmente es hacer proteómicas parciales: la
proteómica de un tipo celular determinado; la proteómica
de una organela aislada; la proteómica de las proteínas
blanco de una determinada modificación post-
traduccional; las diferencias en la expresión de proteínas
antes y después de la diferenciación de un estadío a otro
en un organismo que tiene un ciclo de vida complejo; las
diferencias en la expresión de proteínas de una misma
célula antes y después de un determinado tratamiento.
Identificación de proteínas potencialmente
SUMOiladas en Trypanosoma cruzi
J.C. Bayona, E.S. Nakayasu, M. Laverriere, C. Aguilar, T.J. Sobreira, H. Choi, A.I.
Nesvizhskii, I.C. Almeida, J.J. Cazzulo, V.E. Alvarez: SUMOylation pathway in Trypanosoma
cruzi: Functional characterization and proteomic analysis of target proteins. Mol Cell
Proteomics. 10.12 (2011) 10.1074/mcp.M110.007369-1.
Se generó una linea celular transgénica de epimastigotes de T. cruzi,
que expresa una versión de la proteína SUMO etiquetada con 6xHis y
HA en el N-terminal. Las proteínas conjugadas con SUMO se
purificaron a partir de un extracto libre de células, utilizando dos
etapas cromatográficas: 1ª cromatografía de quelatos metálicos,
usando una resina con Ni, y 2ª cromatografía de afinidad, usando una
resina acoplada a un anticuerpo anti-HA. Las proteínas obtenidas se
precipitaron con acetona.
La muestra control se obtuvo de idéntica manera, usando
epimastigotes wild-type.
Cromatografía líquida en 2 dimensiones acoplada a espectrometría de masa (2D LC MS/MS)
Identificación de proteínas potencialmente SUMOiladas en
Trypanosoma cruzi
Resuspensión en UreaReducción con DTT+ Alquilación con IAADigestión con TripsinaDesalado en Columna fase reversa C18
(DSC-18, Supelco, Sigma-Aldrich)Lleva muestra a sequedadResuspende en 2% ACN/0.1%FA 20 μg proteínaColumna intercambio ionico
(SCX 5 uL opti-pak)Eluidos 0,25,50,100,200 y 500 mM NaClSistema de nano-HPLCTrap loading C18-columnTrap separation C18-column
Elución en gradiente 5–40% ACN/0.1% FA en 100 min
Análisis de péptidos en línea con un espectrómetro de masa(LTQ XL/ETD, Thermo Fisher Scientific).
Proteínas potencialmente SUMOiladas
Distribución por categoria funcional
Se identificaron 7178 péptidos en ambas muestras. Corresponden a 2686 proteínas.
236 resultaron enriquecidas en la Muestra vs. Control
Proteínas potencialmente sumoiladas
Metacaspasa 3 in vivo
Validación de proteínas SUMOiladas
Se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con el gen de la metacaspasa 3
fusionado con una etiqueta de triple FLAG e incorporado al plásmido pTcINDEX.
Los epimastigotes se lisaron en presencia de inhibidores de proteinasas, y se
purificó la metacaspasa por cromatografía de afinidad con anti-FLAG agarosa. Se
eluyeron las proteínas con el buffer de muestra de Laemmli, y se revelaron los
Western blots con anticuerpos anti-FLAG y anti TcSUMO.