Obtención de Nuevas Enzimas para la Producción de Biodiesel y Bioetanol mediante Técnicas

Metagenómicas Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Francisco Noya

Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas

Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable”

¿Cuánto bioetanol necesita Uruguay?

0

100

200

300

400

500

600

700

4,5% 5% 15% 85% 100%

3 69

531

630

Etan

ol (

mill

on

es d

e lit

ros)

Vehículos Flex Fuel Vehículos a nafta comunes

Lignocelulosa a Etanol

La biomasa vegetal es renovable y abundante

Mediante hidrólisis enzimática se liberan azúcares sencillos

que pueden ser fermentados en etanol

20-40% del costo 2 empresas productoras

Objetivo Desarrollar enzimas nacionales que permitan hacer económicamente viable la conversión de biomasa en etanol.

Estrategia

• Aprovechar toda la diversidad genética de una comunidad bacteriana especializada mediante la metagenómica funcional.

• Analizar todos los organismos, sean cultivables in vitro o no.

• Seleccionar las mejores enzimas y expresarlas en cepas industriales especializadas en convertir azúcares sencillos en etanol.

Construcción de bibliotecas metagenómicas

Extraer el ADN

Seleccionar por tamaño

Clonarlo en fósmidos pCC1FOS

Empaquetarlos in vitro e infectar E.coli EPI300

Seleccionar aquellas colonias que adquirieron funciones de interés

Comunidades Microbianas

Departamento de Ingeniería de Reactores Facultad de Ingeniería Universidad de la República

Selección

Función Medio

Celulasas Avicel o CMC, revelado con Rojo Congo Avicel como única fuente de carbono

Hemicelulasas Xilano de Avena, revelado con Rojo Congo

Esterasas/Lipasas Tributirina Trioleína/rodamina

Tamaño de las bibliotecas: 30.000 clones cada una, 42 kbp por clon

Lipasas

Celulasas

Actividad celulolítica

Papel de filtro Bagazo de caña de azúcar

Cantidad de clones identificados

Función Rumen Lodos de bioreactores

Celulasas 21 6

Hemicelulasas 5 4

Esterasas/Lipasas 11 6

Genes identificados por secuenciación masiva ORF Predicted function CAZy

Xil3_c1_87 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68

Xil3_c1_45 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68

Xil3_c1_71 BACON-glucanase GH5

Csd6_c1_40 BACON-glucanase GH5

Csd9_c1_5 Endoglucanase GH5

Csd8_c5_17 β-xylosidase GH43

Csd18Uruguay_c1_59 Endoglucanase GH5,16

Csd4_endoG Endoglucanase GH5

Csd4_xyl β-xylosidase GH43

Csd4_lac Laccase / Cu-oxydase AA1

Conversión de celulosa en etanol

Etanol a partir de celulosa (1% CMC)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Etan

ol (

g/L

)

Tiempo (h)

C- Csd4 Csd23 Csd18

Producción de etanol por Csd4

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Glucose CMC Avicel FP Bagasse Xylan Salts

Eth

ano

l (g

/l)

Sustratos al 1%, 48 horas, 37ºC

Caracterización Enzimática

Csd4

Putative promoter

Csd4

34406 bp

Endoglucanase

LaccaseCgtA GTPase

Adenylate kinase

Beta-xylosidase

Putative hemin binding

Phosphoenolpyruvate synthase

EndoG

pH y temperatura óptimos de EndoG

0

20

40

60

80

100

120

10 30 50 70 90

Re

lati

ve a

ctiv

ity

(%)

T (⁰C)

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Re

lati

ve

Ac

tivit

y (

%)

pH

Actividad de EndoG en distintos solventes

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Re

lati

ve A

ctiv

ity

%

Especificidad de EndoG

Sustrato Actividad

CMC +

Avicel -

4-MUC +

Celotetraosa +

Xilano +

Lichenan -

Perspectivas

Perspectivas

glucanasa xilanasa β-glicosidasa

MS04

CBP Consolidated Bioprocessing

β-xilosidasa

Perspectivas

Switchgrass Pasto elefante Caña común

Panicum virgatum Pennisetum purpureum Arundo donax

Pretratamientos físicos y/o químicos

“CBP”

Etanol

Agradecimientos

• BIOGEM • Inés Loaces • Cecilia Rodríguez • Vanessa Amarelle • Daniela Senatore • Uriel Koziol • Elena Fabiano • Andrés Iriarte • Federico Battistoni • Raúl Platero • Federico Rosconi

• Unidad de secuenciación • José Sotelo

• ANCAP • Nikolai Guchin

• FING • Liliana Borzacconi

• Frig. Pando • Betiana Bouzas

• ANII • Laura Barreiro

• UNAM • Alfredo Martínez

• University of Florida • Lonnie Ingram

• Ismael Nieves