Métodos inmunoanalítico

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MÉTODOS INMUNOANALITICOS

• Características de un inmunoanálisis

• Marcadores de antígenos y anticuerpos

• Ensayos homogéneos y heterogéneos

• Clasificación

• Métodos inmunoanalíticos sin marcadores

• Analizadores automáticos para inmunoanálisis nefelométrico y turbidimétrico.

MÉTODOS INMUNOANALITICOS

Visión global

• Visualizar (con instrumentos)• Marcador

• Homogéneos• Heterogéneos

• Competitivos• No competitivos

Visualización

Separación

Reacción

Clasificación

• Sin marcador

– Inmunoprecipitación

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría

– Aglutinación

Particuloinmunoanálisis

• Con marcador

– Enzimoinmunoanálisis

– Fluoroinmunoanálisis

– Radioinmunoanálisis

– Quimioinmunoanálisis

Inmunoprecipitación

• Precipitación (formación de un complejo visible) resultante de la combinación de un antígeno y un anticuerpo

– Simple - Radial– Doble - Cohete – Electroinmunodifusión– Inmunoelectroforesis

Antígeno Anticuerpo soluble

soluble

insoluble

Inmunodifusión radial

y = bx+a

y = (diametro)2

b = pendiente

Título

Inmunodifusión doble

Identidad antigénica: Se fusionan las líneas

Identidad antigénica parcial: aparece “espolón”

Falta de identidad: Se cruzan

Electroinmunodifusión

Electroforesis

Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis en cohete

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría

1 .-Inmunoprecipitación

2.- Detectarlo por métodos ópticos basados en la dispersión de la REM

I0

ID

Región UV

visibleIR

ID

Dispersión de luz según el tamaño de partícula

.

Rayleigh

Partículas grandes

Tamaño partícula <

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría

REM dispersada Turbidimetría y nefelometría

Nefelometría

Turbidimetría

Particuloinmunoanálisis

Detección mediante técnicas basadas en dispersión

REM dispersada Turbidimetría y nefelometría

Nefelometría

Turbidimetría

Turbidancia = log I0/I

Señal a 90º

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría

Señal

Tampón

Atg Ac

Punto final

Tiempo Tiempo

Señal

Lectura a punto único

Atg+Ac1ª lectura

Segunda lectura

Lectura múltiple

Concentración de antígeno

Señal

Zona de medida Zona de seguridad

Intervalos de tiempo de 0,1 y 0,2 s

Análisis nefelométrico en flujo continuo

Proteinas que se pueden determinar por inmunonefelometria

Aglutinación

Reacción inmunoquímica que produce la formación de agregados insolubles de “partículas” (células, bacterias, perlas..) recubiertas con antígenos o anticuerpos.

- Directa

- Indirecta

Prueba de Combs (directa e indirecta)

- Inhibición de la aglutinación

1 Atc (completo)+Ag

2 Aglutinación

1 Atc (incompleto)+Ag

2 NO Aglutinación

Aglutinación indirecta

Aglutinación directa

Tratamiento de eritrocitos con enzimas

Demostrar presencia de anticuerpos incompletos (no aglutinantes)contra antígenos ABO y Rh de los eritrocitos

utilizando antiinmunoglobulina como segundo anticuerpo

Detecta el AC en los

eritrocitos

Analiza el suero para

buscar anticuerpos lavado

Particuloinmunoanálisis

• Sin marcador homogéneos– Miden la aglutinación como señal

de la reacción atg- ac

– Partículas:

– Inorgánica: metal

– Biológica (Celular): microorganismo, eritrocito

– Orgánica inerte: Polisacárido, bentonita, liposomas Latex

Aglutinación

Determinación de antígenos

Determinación de anticuerpos

Inhibición de la aglutinaciónCompiten

Factor reumatoideNo se une al anticuerpo aislado,sí se une cuando cuando forma complejos

ELISA

WESTERN BLOT

CITOMETRIA D E FLUJO

Sensibilidad

MÉTODO  SENSIBILIDAD (g/ml)

Precipitación en gel  30

Precipitación en anillo  18

Aglutinación bacteriana  0,05

Fijación de complemento  0,05

Hemaglutinación pasiva  0,01

Inhibición de la hemaglutinación  0,005

Inmunofluorescencia  0,005

ELISA  0,0005

Neutralización bacteriana  0,00005