EXPRESIN HETERLOGA DE PROTENAS RECOMBINANTES DE AMARANTO EN DIVERSAS CEPAS DE E. COLISilvia Luna Surez*, Claudia Castro Martnez, Fernando Lpez Valdez. CIBA-IPN Tlaxcala, Tel. 01555-7296300 ext 87814, E mail:: silvials2004@yahoo.com.mx. Palabras clave: Protenas recombinantes, amaranto, expresin de protenas, E coli. Introduccin El amaranto es una importante fuente de protenas con alta calidad nutricional y recientemente ha sido demostrado que presenta algunas propiedades nutracuticas. Se ha aislado e identificado una protena del amaranto, la amarantina, que es la protena de reserva mayoritaria del amaranto y adems presenta un buen balance de aminocidos, por lo que ha servido como modelo de estudio de diversos trabajos. Esta protena tiene dos subunidades, la cida (32-34 kb) y la bsica (22-24 kb), unidas por un enlace disulfuro. El objetivo de este trabajo fue expresar protenas recombinantes derivadas de la amarantina en diferentes cepas de Escherichia coli y evaluar las diferentes condiciones de expresin de dichas protenas. Metodologa. Se utiliz el vector de expresin pET 32 b (+) conteniendo el cDNA que codifica para tres protenas: (1) subunidad cida de la amarantina (SAA), (2) subunidad cida con un eptope de seis histidina (SAA-H6) y (3) subunidad cida con el pptido de propiedades antihipertensivas VY insertado en la parte interna de la protena (SAA-i). Se usaron cinco cepas de expresin de E. coli DE3 (Origami, Rosetta, BL21, C43, C41) Con los vectores se transformaron cada una de las cepas mencionadas de por medio de choque trmico. Se sembraron en medio lquido LB y terrific con los respectivos antibiticos, se probaron diferentes concentraciones de inductor (IPTG) durante varios tiempos de induccin y se analizaron las protenas utilizando SDS-PAGE y Western-blot. Resultados y discusin. En el cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos del rendimiento de cada una de las protenas en cada cepa de E coli probada. Los resultados obtenidos mostraron que Rosetta (DE3) presenta el mejor nivel de expresin de las tres protenas evaluadas con respecto a todas las otras cepas. Se observ que en Rosetta (DE3) se produce 3.1 veces mas protena recombinante que en Origami (DE3), mientras que 2.5 veces mas que BL21(DE3) y produce aproximadamente cuatro veces mas que las cepas C41(DE3) y C43(DE3). Cuadro 1. Rendimiento de las protenas recombinantes en medio de cultivo terrific. . Protena Origami BL21 C41 C43 Rosetta mg / L SAA 56.7 72.6 43.7 39.8 175.2 SAA-6H 55.1 73.5 39.6 32.3 173.9 SAA-i 23.1 38.7 16.3 12.2 81.3 En lo que se refiere a las condiciones de expresin observamos que el mejor tiempo de expresin fue a las 3 h de induccin (tiempos evaluados: 0, 3, 6, 9 y 20 horas de induccin) en la cepa Rosseta (DE3) y en las diferentes protenas evaluadas. Para las otras cepas el mejor tiempo de expresin fue a las 6 horas de induccin. El efecto de la concentracin de agente inductor fue realizado para la cepa Origami (DE3) y se obtuvo que a una concentracin de 0.1 mM fue la mejor expresin para la protena SAA y la SAA-i, mientras para la protena SAA-H6 fue de 0.3 mM. El medio de cultivo tiene gran influencia en la expresin de las protenas, se observ que en el medio terrific se expresaron aproximadamente cuatro veces mejor todas las protenas, en el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos con la cepa Origami (DE3). Cuadro 2 Comparacin del rendimiento de las protenas en dos medios de cultivo Protena LB (mg/L) Terrific (mg/L) (SAA) SAA-6H SAA-i 14.6 13.5 6.2 56.7b 55.0b 23.1b

Los resultados anteriores nos indican que para obtener una mejor expresin de estas protenas es necesario que la cepa de E. coli cuente con los codones de transferencia de eucariotas, tal es el caso de la cepa Rosetta (DE3); otro factor importante es que la cepa sea deficiente en proteasas como es el caso de la cepas BL21 (DE3). Adems, la formacin de enlaces disulfuro en el citoplasma de E. coli no representa gran importancia en la expresin de estas protenas debido a que se produce en forma de monmeros (1). Los resultados obtenidos son mejores que los reportados para la protena completa expresada en Origami (DE3 )(2), en BL21 (DE3)(3) y tambin que lo reportado para otras protenas de reserva. Conclusiones y perspectivas. El factor que mas influye en la expresin de la subunidad cida de la globulina 11S del amaranto con sus diferentes modificaciones (eptope 6-His e insercin del pptido VY) en E coli, es el contenido de codones raros en el cDNA, en menor grado, pero tambin de importancia es que las protenas se degradan en el citoplasma de la bacteria y que no es necesario formar puentes disulfuro para mantener la estabilidad de las protenas. Estos resultados son importantes ya que nos dan la base para poder producir estas protenas que tienen potencial nutracutico a mayor escala y hacer estudios de estabilidad y bioactividad de las protenas. Referencias. 1. Luna-Surez S., Medina-Godoy S, Cruz-Hernndez A, ParedesLpez O. 2008. Expression and characterization of the acidic subunit from 11S Amaranth seed protein. Biotechnol. J. 3: 20919. 2. Medina-Godoy S., Nielsen N.C. y Paredes-Lpez, O. 2004. Expression and characterization of a His-tagged 11S seed globulin from Amaranthus hypochondriacus in Escherichia coli. Biotechnol Prog 20: 1749-1756. 3. Osuna-Castro J.A., Rascn-Cruz Q., Napier J., Fido R.J., Shewry P.R. y Paredes-Lpez O. 2000. Overexpression, purification and in vitro refolding of the 11S globulin from amaranth seed in Escherichia coli. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 5249-5255.