1

La experiencia de Mar del Plata enla Aplicación de la norma IRAM29107‐1 para determinación deBacterias Coliformes y E.coli enagua para consumo

Población con agua potable: 97 %

Producción anual promedio de agua: 139.000.000 m3

Radio servido de agua: 2.288,52 kilómetros de conductos

SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSEMar del Plata‐Batán‐Est.Chapadmalal

Red de Agua

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata 2

3

SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSERed de Agua

ABASTECIMIENTO: 300 perforaciones

SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN: tres subsistemas: Sistema Acueducto Norte Sistema Acueducto Sur Sistema Impulsión directa

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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSERed de Agua

1) Acueducto Norte Se abastece por medio de 96 pozos de extracción. Tiene una longitud de 24,5 Km. El pozo de extracción mas lejano se ubica en el límite con el Partido de Mar Chiquita,

El agua de las perforaciones es captada e impulsada hacia el acueducto norte, luego es rebombeada desde 5 Estaciones Elevadoras.

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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSERed de Agua

2) Acueducto Sur Se abastece por medio de 26 pozos de extracción quebombean al acueducto a presión.

La longitud del acueducto es de 15 Km. Existen dos partes altas en la zona del Acueducto Suralimentadas por rebombeo.

En el extremo del Acueducto Sur se ubica la EstaciónElevadora Mario Bravo que cuenta con un tanqueelevado y una cisterna, donde se almacena el agua noconsumida en el acueducto a través de sus derivadoras.

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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSERed de Agua

3) Pozos en red Aquellas zonas en las cuales no es posible sualimentación desde las estaciones elevadoras seabastecen desde pozos en red.

El total de pozos en red en la ciudad de Mar del Plataes de 97.

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PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS  • Asegurar la Calidad del Agua para consumo Humano. Sistema de abastecimiento

de OSSE.

Pozos"Monitoreo de la calidad bacteriológica y físico ‐ química de los pozos de OSSE"

Red" Monitoreo y control de la calidad bacteriológica y físico ‐ química de la red de distribución

de agua"

Asistencia a otras áreas de la empresa"Asistencia a Recursos Hídricos en el control de calidad de nuevos pozos de OSSE y

perforaciones particulares"."Atención a otras áreas de la empresa (Planta envasadora, Seguridad e Higiene, reclamos,

órdenes de trabajo, inspecciones, empalmes, arreglos, etc.)"

Plan de Promoción Social"Monitoreo y control de la calidad del agua de consumo en dependencias municipales y

escuelas municipales y provinciales""Atención a solicitudes institucionales (hospitales, poder judicial, entidades sin fines de

lucro, convenios con entidades barriales, etc.)

8

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata 9

PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS  

Monitoreo Ambiental. Manejo Costero Integrado

Sistema cloacal: "Monitoreo y control de efluentes industriales, evaluación ambiental eincidencia en el sistema cloacal"

"Caracterización del efluente cloacal de la ciudad".• "Caracterización y monitoreo del efluente líquido"• "Caracterización y monitoreo del efluente sólido"• "Caracterización y monitoreo del potencial tóxico de los sólidos cloacales"• "Análisis y evaluación del tratamiento del barro cloacal“

"Caracterización de los residuos transportados por camiones atmosféricos"

Sistema pluvial: "Monitoreo de los desagües pluviales de la ciudad"

Mediomarino receptor:"Calidad recreativa del litoral marítimo de Mar del Plata""Calidad del ecosistema"

9

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata 10

PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS  

Aseguramiento de la Calidad.Desarrollo de acciones para el aseguramiento de lacalidad analítica del Laboratorio de Aguas, paralograr la acreditación de ensayos seleccionados

Atención a requerimientos particularesServicio de análisis y asesoramiento a terceros.

10

METODOLOGÍA DE TRABAJO MONITOREO EN LA RED

Muestreo: 42 zonas demuestreo:31 zonas de muestreo que incluyen puntos de red y pozosque abarcan todo el radio servido de agua. Esteesquema es actualizado en forma permanente amedida que se incorporan nuevas redes de agua almismo

11 zonas de muestreo en áreas rurales y periféricas a laciudad (sólo pozos)

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata11

12

IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1

Ventajas Tiempos de respuesta mucho menores: 3 a 5 días con NMP  vs 24‐48 hs con FM con M Cromogénicos

Mayor capacidad analítica: NºMtras red 2014: 1505Nº Mtras red 2015: 1899

Menor cantidad de horas hombre para procesar las muestras

Alerta Temprana de riesgo sanitario : Mejor capacidad de reacción 

ante un evento

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IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1

COSTO DE INSUMOS POR MUESTRA

MÉTODO DE ENSAYO TUBOS MÚLTIPLES CHROMOCULT

Resultado final

$ 37,10 $ 32,50

3- 5 días 24- 48 hs

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14

IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1

• Puesta a punto de la técnica

1. Participación en el comité iram2.Participación reuniones RELAS3.Capacitación en AySA

• Plan de trabajo para puesta a punto y validaciónpreliminar

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VALIDACIÓN PRELIMINAR

Objetivo:

• Identificación y reconocimiento de la morfología ycaracterísticas generales y bioquímicas de las colonias con losmedios de cultivo ensayados. Ensayo con cepas target y notarget (controles + y ‐)

• Capacidad de cada método para diferenciar precisamente labacteria de interés en presencia de los demás componentesque se espera estén presentes en la matriz de la muestra

15

PRIMERA ETAPA

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METODOLOGÍARecuperación de cepas de referencia target y no target:

• Escherichia coli ATCC 25922• Klebsiella pneumoniae ATCC 13833• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Se preparó una solución de trabajo realizando dilucionescon dichas cepas para lograr una mejor identificación de lascolonias

16OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

METODOLOGÍAObtención de cepas de trabajo target y no target

17

Desarrollo de cepas de trabajo  en Caldo TSA

Desarrollo de cepas de trabajo en Agar TSA

Escherichia coli ATCC 25922Klebsiella pneumoniae ATCC 13833Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

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METODOLOGÍA

Equipamiento

Tren de filtración de acero inoxidable marca Sartorius

Bomba Sartorius para análisis microbiológico Mod. 166MP‐3: •Veloc flujo cte: 3,5 L/min•Max Vacio: 0,2 bar•Max Presión: 1,0 bar

18OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

19

Equipamiento completo de Filtración bajo campana de 

flujo laminar                          

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20

Normade referencia ‐medios de cultivo utilizados

• IRAM 29107‐1: 2006: Agar m‐ENDO LES, Marca Merck

• Nueva versión ISO 9308‐1 / IRAM 29107‐1:Medios Cromogénicos: Agar Chromocult para coliformesMerck más suplemento selectivo para Ecoli/Coliformes Merck

• Filtros de membranas utilizados: Esteres de celulosa de0.45um tamaño poro y 47 mm diámetro, Marca PALL

PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINARPRIMERA ETAPA

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Metodología para la confirmación de las colonias según Norma IRAM 20107‐1: 2006

• Medio de Cultivo utilizado: Agar m‐ENDO LES

• Confirmación: Pruebas de oxidasa e indol.

• Criterio: Se transfieren un mínimo de 10 colonias típicas de la placa de agar m‐ENDO LES a Agar no selectivo (TSA) y Caldo Triptofano, respectivamente, para la posterior realización de las pruebas bioquímicas confirmatorias.

21OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

Metodología para la confirmación de las colonias según medios cromogénicos – Chromocult Coliform Agar 

SEGÚN NORMA IRAM 29107‐1 (2° edición)

• Medio de Cultivo utilizado: Chromocult Coliform Agar +suplemento selectivo E. coli/Coliformes

• Confirmación: Prueba de oxidasa para coliformes no E.coli. 

• CRITERIO: Se transfieren “n”  colonias a confirmar, (según norma), a un Agar no selectivo, para su posterior confirmacón.

22OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

ResultadosComparación e identificación de Colonias target de Escherichia colien Agar ENDO‐LES y Agar Chromocult

23

AGAR ENDO‐LES: Colonias típicas con brillo metálico, (E.coli)Colonias rojas sin brillo metálico (Coliformes no E.coli)

AGAR CHROMOCULT:Colonias típicas azul‐violetas, (E.coli)Colonias rosadas (Coliformesno E.coli)

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ResultadosComparación colonias típicas target Escherichia coli en diversas diluciones

24

ResultadosIdentificación Bioquímica de las colonias típicas  coliformes no E.colien AGAR CHROMOCULT : Etapa confirmatoria

25

Colonias típicas color salmón a rojo

Confirmación bacterias coliformes: reacción oxidasa 

negativa (‐)

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ResultadosIdentificación Bioquímica de las colonias  típicas en AGAR ENDO LES

26

Primer paso etapa confirmatoria:  Repiques simultáneos de cada colonia típica en Caldo Triptofano y en  Agar TSA

La turbidez en el medio indica el desarrollo de las colonias

Crecimiento de las colonias en Agar TSA

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Resultados Identificación Bioquímica de las colonias  típicas en AGAR ENDO LES

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Segundo paso etapa confirmatoria: Reacción confirmatoria de Indol y Oxidasa 

Reacción Indol: presencia de anillo color rojo, reacción Indol (+)  

Reacción Oxidasa: Coloración violeta, reacción oxidasa (+)Coloración marrón o sin color, reacción oxidasa (‐)

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RESULTADOSCriterio para expresión de los resultados

• A partir del recuento de colonias confirmadas en ambasmetodologías ensayadas, se calcula el número de bacteriascoliformes no E.coli y de E. coli presentes en 100 ml de lamuestra, de acuerdo a la siguiente fórmula:

• UFC de coliformes totales/100ml = (N° colonias coliformes no E.coli + N° colonias E.coli)  x 100

volumen de muestra filtrada

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29

RESULTADOS CON CEPAS NO TARGET:No se observó desarrollo en ninguno de los medios ensayados de las 

muestras inoculadas con Klebsiella pneumoniae ATCC 13833 yPseudomonas aeruginosa ATCC 27853

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Objetivos• Cuantificación de las bacterias target en distintas matricesreales (evaluación de la proporción de muestras negativas ypositivas correctamente identificadas) para los mediosensayados de membrana filtrante y comparación con elmétodo de NMP.

• Establecimiento de los límites de trabajo en término de número de colonias

• Dilución adecuada de las muestras de rutina

• Rango de aplicación y limitaciones

30

PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINARSEGUNDA ETAPA

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31

METODOLOGÍA VALIDACIÓN PRELIMINAR: segunda etapa

Nº Muest

raDescripción Objetivos/ Observaciones

1 Muestra de efluente cloacal diluido

Comparación de la capacidad de cadamétodo para diferenciar precisamentelas bacterias target en una muestra deefluente cloacal diluida (caso extremo)

2 Agua de redComparación de los resultados obtenidospor las técnicas propuestas en unamuestra real de rutina

3 Agua subterránea‐ Pozos OSSE Comparación de los resultados obtenidospor las técnicas propuestas en unamuestra real de rutina

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RESULTADOS PRELIMINARESMuestra 1: Efluente cloacal diluido

MATRIZ            EFLUENTE CLOACAL

UFC/100ml NMP/100mlENDO LES CHROMOCULT

Colif. Totales E. coliColif. 

TotalesE. Coli Colif. 

TotalesE. Coli

1 2.1 x10 5 2.5 x10 5 8.5 x10 5 1.5 x10 5 2.0 x10 5 1.0 x10 5

2 1.8 x10 6 8.0 x10 5 1.3 x10 6 1.0 x10 5 4.0 x10 5 2.0 x10 5

3 3.0 x10 4 1.0 x10 4 5.0 x10 4 2.0 x10 4 4.5 x10 5 2.4 x10 5

4 1.8 x10 5 1.0 x10 5 7.3 x10 4 8.0 x10 4 2.8 x10 5 5.4 x10 4

5 4.7 x10 5 1.3 x10 5 2.6 x10 5 5.2 x10 5 8.0 x10 5 3.0 x10 5

32

Resultados:Comparación método filtración por membrana vs NMP, se observan resultados del mismo orden en las 5 muestras ensayadas.

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MATRIZ                    AGUA DE RED

UFC/100ml NMP/100mlENDO LES CHROMOCULT

Colif. Totales E. coliColif. Totales

E. Coli Colif. Totales

E. Coli

1 6 1 1 1 2.2; (0.26-8.1) 1.1; ( 0.03-5.9)2 28 <1 6 <1 9.2; (3.1-21.1) <1.1 (0-3.0)3 180 <1 198 <1 >23.0; (13.5- ∞) <1.1 (0-3.0)

4 6 <1 4 <1 3.6; (0.69-10.6) <1.1 (0-3.0)5 S/D* S/D* >200 2 >23.0; (13.5- ∞) 12.0; (4.3-27.1)6 29 <1 1 <1 12.0; (4.3-27.1) <1.1 (0-3.0)

7 60 2 4 <1 2.2; (0.26-8.1) <1.1 (0-3.0)8 <1 <1 <1 <1 <1.1; (0-3.0) <1.1 (0-3.0)9 39 <1 6 <1 <1.1; (0-3.0) <1.1 (0-3.0)

33

RESULTADOS PRELIMINARESMuestra 3: Agua de red

*S/D: Sin determinarResultados:Comparación método filtración por membrana vs NMP, se observan resultados delmismo orden en las 9 muestras ensayadas.

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MATRIZ                    AGUA 

SUBTERRANEA PERFORACION

ES OSSE     

UFC/100ml NMP/100ml

ENDO LES CHROMOCULTColif. Totales E. coliColif. 

TotalesE. Coli Colif. 

TotalesE. Coli

35 POZOS <1 <1 <1 <1 <1.1; (0-3.0) <1.1; (0-3.0)

1 66 <1 22 <1 3.6; (0.69-10.6) <1.1; (0-3.0)

2 25 <1 15 <1 9.2; (3.1-21.1) <1.1; (0-3.0)

3 >200 <1 200 <1 >23.0; (13.5-∞) <1.1; (0-3.0)

4 133 16 20 5 6.9; (2.1-16.8) 3.6; (0.69-10.6)

5 175 6 78 1 >23.0; (13.5-∞) 3.6; (0.69-10.6)

34

RESULTADOS PRELIMINARESMuestra 4: Agua subterránea‐ Pozos OSSE

Resultados:Comparación método filtración por membrana vs. NMP, se observan resultados del mismo orden en las 40 muestras ensayadas.

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MATRIZN° DE 

MUESTRAS ANALIZAD

AS

N° DE COLONIAS E. coli Tipicas

N° DE COLONIAS E. coli Confirmadas

ENDO  LES CHROMOCULT ENDO  LES CHROMOCULT

EFLUENTE CLOACAL DILUIDO

5 56 20 37 14

AGUA DE RED (muestras de 

rutina)9 34 10 3 10

AGUA SUBTERR 

POZOS OSSE (muestras de 

rutina)

40 22 6 16 6

TOTALES 54 112 36 56 30

35

% de Colonias de E. coli Presuntivas (+) 

Confirmadas

ENDO  LES CHROMOCULT

25 70

29 100

27 100

RESULTADOS PRELIMINARESResumen resultados de los ensayos realizados

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36

TIEMPOS DE RESPUESTA DESDE LA SIEMBRA DE LA MUESTRAS

ETAPA TUBOS MÚLTIPLES ENDO  LES CHROMOCULT

Presuntiva 24 -48 hs 24 hs 24 hs

Confirmatoria para E coli 48-72hs hs 24 hs 3 seg – 1 min

Resultado final 3- 5 días 48 hs 24 hs

RESULTADOS PRELIMINARESTIEMPOS DE RESPUESTA

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

Observación de diferentes tipos de colonias desarrolladas de diversasmatrices reales con y sin Suplemento Selectivo

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Sin agregado de suplemento. 

Proliferación de flora acompañante

Con suplemento selectivo Bacterias Coliformes típicas 

fácilmente identificables

Mezca de antibióticos liofilizados: Vancomicina: inhibe crecimiento bacterias GRAM (+) Cefsulodina: inhibe el desarrollo de Pseudomonas y Aeromonas

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

RESULTADOS CON Y SIN USO DEL ANTIBIOTICO Experiencia propia. Matriz Agua Subterránea. Perforaciones 

OSSE

N° muestraN° y Tipo de colonia observada

Con suplemento Sin suplemento

13 col. colif. No E.coli 3 col. colif. No E.coli

<1 col. E.coli <1 col. E.coli25 col. Traslucidas 70 col. Traslucidas

2

<1 col. Colif No E.coli <1 col colif. No E.coli< 1 col. E.coli < 1 col. E.coli

<1 col. Naranjas 3 col. Naranjas3 col. Amarillentas 15 col. Amarillentas

3<1 col. Colif No E.coli <1 col. Colif No E.coli

< 1 col. E.coli < 1 col. E.coli10 col. Traslucidas 39 col. Traslucidas

4<1 col. Colif No E.coli <1 col. Colif No E.coli

< 1 col. E.coli < 1 col. E.coli<1 col. Marron/ocre 7 col. Marron/ocre

5

<1 col. Colif No E.coli <1 col colif. No E.coli3 col. Turquesa 22 col. Turquesa

15 col. Traslucidas >50 col. Traslucidas39 col. Amarillentas Saturado col. amarillentas

38OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

39

Conclusiones preliminares Parte 1

• Se lograron identificar claramente tanto las colonias decoliformes no E.coli como las E.coli en los medios de cultivoensayados.

• Se comenzó con la comparación del recuento de bacteriastarget en distintas matrices reales obteniéndose resultadoscomparables en técnicas de membrana filtrante y el métodode NMP.

• Se evaluaron los tiempos de respuesta utilizando cada técnicay la eficiencia en términos de % de Colonias de E. coliPresuntivas (+) Confirmadas para las técnicas evaluadas

PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR

40

Conclusiones preliminares Parte 2

• De los ensayos realizados con y sin agregado de SuplementoSelectivo para Coliformes/ E.coli se logran observandiferencias tanto en el número como en la variedad de floraacompañante en ambos casos.

• El agregado del suplemento, según nuestra experiencia,facilita la identificación y el recuento de las colonias típicasal inhibir el desarrollo de otras bacterias

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

Muestras con abundantes sedimentos en suspensión

41

RESULTADOS PRELIMINARES ‐ Limitaciones

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Sobresaturación de la membrana filtrante

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RESULTADOS PRELIMINARES ‐ Limitaciones

OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

Implementación Técnica de Filtración por Membranapara la determinación de Pseudomonas aeruginosa

Fase experimental

Metodología para la confirmación de las colonias según Norma IRAM 29108 ‐ 1:2006

Medio de Cultivo utilizado: Agar Cetrimide Marca Merck

Observación de las colonias típicas color verde

Confirmación: fluorescencia de las colonias típicas bajo luzultravioleta a 365 nm y desarrollo de las mismas en agar PCA a42°C

43OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

METODOLOGÍA

Equipamiento

44

Cabina o gabinete cerrado de visualización UV

Aspecto de las colonias típicas 

FluerescenciaColor verde azulado

Confirmación

Longitud de onda 365 nm

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ACCIONES FUTURAS

• Culminar con la segunda etapa de la validación preliminar

• Diseño del plan de verificación y sesgo por analista sobrelas muestras de rutina.

45OBRAS SANITARIAS Mar del Plata

INTEGRANTES DEL GRUPO DE TRABAJOGerencia de Calidad ‐ Obras Sanitarias Mar del Plata

Laboratorio de Bacteriología (Potabilidad y Medio Receptor)

Lic. Mariana Cerdá GilbertTéc. Ana María CaldararoTéc. Carlos Samite

Calidad y Evaluación de ProyectosLic. Ana Paula Comino

46OBRAS SANITARIAS Mar del Plata