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LA TINCION DE GRAM
1. INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
La tinción de Gram es uno de los métodos de mayor importancia y relevancia que se
emplean en el laboratorio de Microbiología. Esta tinción constituye un tipo de tinción
diferencial puesto que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: gram positivas y gram
negativas en virtud a la coloración que estas desarrollen y la coloración dependerá de la
diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.
El danés Christian Gram en el año de 1884 dejó una huella indeleble e imperecedera para la
humanidad, al emplear y estudiar esta tinción.
El objetivo primordial del presente trabajo es buscar, recabar y documentar información sobre
esta tinción que a la fecha no ha perdido vigencia ni notoriedad y sigue siendo la piedra
angular en el campo de microbiología.
2. OBJETIVO
Reconocer la tinción adoptada por la pared bacteriana del Gram (+) y el Gram (-)
Explicar o fundamentar la coloración del Gram
3. MARCO TEÓRICO
1.1. ¿QUÉ ES LA TINCIÓN DE GRAM?
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico y con el que el lector debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos,
positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM.
1.2. RESEÑA HISTRORICA
Hablar de la Tinción de Gram es remontarse a los año de 1882, con el famoso
científico danés Christian Hans Gram quien desarrolló la tinción más importante en
microbiología que a la fecha lleva su nombre. Para el año de 1884, Gram presenta sus
trabajos a la sociedad científica de su época y publica todas sus experiencias y
conocimientos en lo relativo a su Tinción.
Para 1923, posterior a la época dorada de Gram, se inician las modificaciones a la
Tinción original, así nace la llamada modificación de Hucker; donde la violeta cristal
se disuelve con alcohol etanol y se prepara con una solución de oxalato de amonio. La
solución se emplea por un período no mayor de 30 segundos. Luego se aplica una
solución Iódica de Gram (lugol + bicarbonato sódico diluido). El alcohol-acetona será la
solución decoloradora y no tomará más de 5 segundos en su aplicación. La safranina o
fuscina básica al 0.1 a 0.2 % será el contra tinte o tinte de contraste y su periodo de
tinción no pasará los 30 segundos."315'
Posteriormente, el científico Kopeloff efectuó modificaciones a la tinción de Hucker para
microorganismos que no se veían bien y presentaban dificultades en la coloración, tal
es el caso de los anaerobios; estas bacterias sólo se tiñen ligeramente y eran muy
fáciles de decolorar por consiguiente no se observaban apropiadamente al
microscopio. La modificación de Kopeloff emplea los mismos colorantes que Hucker
pero se cambia la concentración de los tintes unos a mayor concentración y otros a
menor. El de-colorante es alcohol - acetona en proporción (7:3). Además, los tiempos
de tinción varían ampliamente lo cual facilita la observación de estos gérmenes.
En 1978. El científico Gregersen determinó que las bacterias Gram negativas se
diferenciaban de las Gram positivas en virtud a la composición de la pared celular al
entrar en contacto con una solución alcalina diluida. Una suspensión de
microorganismos en KOH al 3% toman un aspecto viscoso debido a la liberación de los
lipopolisacáridos y DNA cuando se trabaja con bacterias Gram negativas. Mientras que
las Gram positivas no presentan dicha viscosidad en virtud a la estructura de su pared
celular.
1.3. PRINCIPIOS DE LA TINCION DE GRAM
Las bacterias presentan características determinantes y constitutivas en la
pared celular, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. Así la pared celular no tan sólo le sirve para dar forma, rigidez y
tamaño a la célula, sino que soporta altas presiones osmóticas que pueden llevarla
a una muerte segura por lisis osmótica.
El péptidoglicano es la sustancia que le confiere la rigidez a la pared celular y le
brinda todo el soporte que esta necesita.
La molécula de péptidoglicano está conformada principalmente por disacáridos,
constituidos por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico que se unen por enlaces
de B (1>4) repitiéndose un número plural de veces y un enlace de tetra-péptido
unido a la N-acetilglucosamina. Este compuesto se alterna con los aminoácidos L y
D de alanina. D-ácido glutámico y usina o ácido diaminopimélico.
Las cadenas de estas moléculas se unen entre si constituyendo una ultra estructura
de enlaces peptídicos con los aminoácidos que conforman una estructura rígida y
continua que es la pared celular bacteriana. La estructura de estos puentes
peptídicos varía entre las especies bacterianas.
Los microorganismos presentan marcadas diferencias estructurales en la pared
celular que son la base para clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las
Gram positivas y las Gram negativas. Las bacterias Gram positivas tienen una
pared celular gruesa conformada de varias capas interconectadas de
péptidoglicano en niveles que van por el orden de 80 a 90 % de la estructura total.
También, poseen otras sustancias como: el ácido teicoicos que son polímeros de
hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato unidas entre sí por enlaces
fosfodiéster. Otro elemento importante que se encuentra en ciertas bacterias Gram
positivas es el ácido teicurónico que se sintetiza como respuesta a la falta de ácido
teicoico por limitación de fosforo
Por otro lado, las bacterias Gram negativas tienen una línea capa de péptidoglicano
que constituyen un 20% de la pared celular.
Esta estructura se encuentra rodeada por una segunda membrana lipídica exterior
que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas que son de variada complejidad.
La membrana externa se encuentra unida a la capa de péptidoglicano por medio de
lipoproteínas.
El colorante básico violeta cristal penetra en las células bacterianas tanto de
microorganismos Gram positivos como de Gram negativos. Luego el lugol o Yodo
de Gram entra en las células y constituye un complejo insoluble con la solución
acuosa de violeta crista
La mezcla de alcohol-acetona tiene como función determinante la decoloración ya
que la misma es soluble al complejo que se ha formado violeta cristal -Yodo de
Gram.
Las bacterias Gram positivas no se decoloran. Mientras que las Gram negativas se
decoloran. Sin duda alguna esta característica marca la gran diferencia entre esto
dos tipos de células.
Los microorganismos Gram negativos tienen espacios en la estructura de su pared
celular y el alcohol-acetona es un solvente lipídico que actúa sobre la membrana
exterior de la pared de la célula y afecta la membrana citoplásmica donde se unen
los péptidoglicano.
Además, la delgada capa de péptidoglicano no retiene el complejo violeta cristal
yodo lo cual obliga a las células Gram negativas a decolorarse.
Sin embargo las células Gram positivas debido a sus gruesas paredes de
péptidoglicano y pocos lípidos no son permeables al decolorador puesto que este
deshidrata la pared celular y cierra los poros, alterando y afectando el pequeño
espacio entre las moléculas. El complejo violeta cristal-yodo queda atrapado dentro
de la pared celular tiñendo a las bacterias Gram positivas de color azul.
Finalmente, se adiciona la safranina que es un tinte de contraste y puede o no
utilizarse ya que en algunos casos se sustituye por carbol-fuscina, cuya función es
poner de manifiesto las bacterias que estaban decoloradas es decir le da color a las
bacterias Gram negativas, tomando una tonalidad roja.
4. RESUMEN
La tinción de Gram es un procedimiento sencillo pero de gran utilidad, empleado por todos
los laboratorios de microbiología, lo cual le da un sentido de universalidad y su aplicación
cubre diversos campos de la ciencia. Esta tinción constituye un tipo de tinción diferencial ya
que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas en
virtud a la coloración que estas desarrollen y la coloración dependerá de la diferencia
constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.
La tinción de Gram es un recurso barato y sencillo que bien utilizado puede brindar valiosa
información; dependerá de nosotros darle el buen uso para obtener la mejor información
posible.
5. CONCLUSIONES
La tinción de Gram (+) se vuelve violeta y se mantiene de ese color porque el complejo
CV-I continua dentro dela celula dándole la coloracio
La tinción del Gram (-) se vuelve rosa pues al eliminarse las grasas de la paredes
aumenta la porosidad y el complejo CV-I se separa de la celula
6. BIBLIOGRAFIA
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