INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS(Evolución experimental de rutas)

¿Porqué es necesario?

¿Cómo se hace?

Aplicaciones (ejemplos)

Bioseguridad

Dos grupo de compuestos

Biogénicos (Se degradan)

Xenobióticos

(No se degradan)

Biotransformantes

Recalcitrantes

COOH COOH

CL

COOH

CLCL

Mineralización Biotransformación Recalcitrancia

A) B) C)Substrato

Crecimiento

Producto

0 1 2 0 0 11 22

Tiempo (Unidades)

¿Porqué?

Muchos compuestos tóxicos YA son degradados por cepas naturales.

Sin embargo, y para algunos compuestos concretos (organoclorados, organofosforados), la velocidad de degradación por organismos naturales es muy baja.

Para moléculas muy complejas (y de aparición reciente en la naturaleza), NO es de esperar que UNA SOLA cepa tenga TODA la ruta necesaria para degradarla.

En estos casos, se plantea

CONSTRUIR CEPAS MEJORADAS para expandir las características naturales

CONSTRUCCIÓN DE RUTAS HÍBRIDAS

AMPLIAR RUTA PREEXISTENTE

Identificar pasos NO permisivos o cuello de botellaReclutar enzimas isofuncionales

Mutagenizar y seleccionar enzimas con más amplio espectro de sustrato

Añadir pasos a ruta preexistente

Eliminar actividades NO deseadas

"Adecuación" del regulador

CONSTRUIR RUTA NUEVA

Diseñar secuencia de pasos enzimáticos necesarios

Reclutar las enzimas de distinta fuente

Ingeniería de rutas

Objetivo final: MEJORAR LAS CEPAS BACTERIANAS• Ganancia de función• Modificación de función• Pérdida de función

Pasos limitantes más frecuentes:Especificad de las enzimasFallo en la activación por el regulador

Metodología: -MUTAGÉNESIS (para ganancia o pérdida de función)

- al azar (requiere selección posterior)- dirigida

-TRANSFERENCIA DE GENES- CONJUGACIÓN y recombinación - TRANSFORMACIÓN

- y recombinación (ADN libre se integra en el cromosoma)- plásmidos (unidades replicativas independientes)

-SELECCIÓN EN QUIMIOSTATOS

¿Cómo?

Rif- B

La bacteria donadora B,sensible a rifampicina, lleva plásmido con genes que metabolizan el catecol

Rif+

A

La bacteria receptora A,resistente a rifampicina, no puedecrecer con catecol

Rif+ Rif-A B

CONJUGACIÓN

Rif-Rif+Rif+A A B

SELECCIÓN (Rif + catecol)

DONADORARECEPTORA

TRANSCONJUGANTE

genA (o varios genes)

oriV

Ap

+

TRANSFORMACIÓN

Bacteria

Plásmido manipulado

Electrochoque o CaCl2 + Selección

A

Proteína A

Bacteria con función adicional

B

A

C

D

E

A

C

D

E

A

C

D

E

BB B

A’A’

S

HORIZONTAL VERTICAL

EVOLUCIÓN DE RUTAS CATABÓLICAS

EJEMPLO 1

ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE ALTAS CONCENTRACIONESDE NITRATO EN EFLUENTES DE FABRICACIÓN DE EXPLOSIVOS Producción de DNEG Aguas residuales con alta carga de nitrato

• Aislamiento de organismos tolerantes a altas concentraciones de nitrato.

• Caracterización.

• Establecimiento de las condiciones óptimas para la eliminación de nitrato.

• Optimización del proceso (económica):Dilución de las aguas.Suministro de nutrientes.Fuente de carbono exógena.

• Mejora genética de la cepa.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

10 g de suelo en medio mínimoGLICEROL/NITRATO

SIEMBRA (24, 48, 72 H)

40 TIPOS DIFERENTES

PURIFICACIÓN

CULTIVO PURO

SELECCIÓN

Se analizan los 40 clones:Tiempo de generación (velocidad de crecimiento)Tolerancia a nitratoEficiencia de eliminación de nitrato

Klebsiella oxytoca

En glicerol

“Clon 15”

En etilenglicol

“Clon AH1”

Arthrobacter globiformis

NO3¯ NO2

¯ NH4+

N orgánico

Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa

nasA nasB

2e¯ 6e¯

Baja acumulación de nitrito

tiempo (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

10 20 30

nit

rito

(m

M)

NO3¯ NO2

¯ NH4+

Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa

nasA nasB

2e¯ 6e¯

10

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20 30

tiempo (h)

amo

nio

(m

M)

tiempo (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

010 20 30

nit

rito

(m

M)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

010 20 30

tiempo (h)

amo

nio

(m

M)

NO3¯ NO2

¯ NH4+

Nitrato Reductasa Nitrito Reductasa

nasA nasB

2e¯ 6e¯

nasB

KpnI KpnI

Plac oriT

pUPE2

9.552 kb

R R

Gen nasB de K. pneumoniae

EJEMPLO 2

DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DE TNT (para aplicar en fábrica de explosivos)Explosivo militar y civilAlmacenado desde la segunda guerra mundial (Alemania, USA). En desuso.Pérdidas en los embalajes de almacenamiento, desertización-

Enriquecimiento y aislamiento de cepas (C1S1, Clon A)Selección de C1S1. TNT sólo es fuente de nitrógeno.Selección de ClonA (crecimiento rápido en TNT).

CaracterizaciónFuentes de carbono óptima.Temperatura.Requerimiento de oxígeno.Crecimiento con TNT.Actividades enzimáticas.Crecimiento en aguas de la factoría.Metabolismo.

Cultivo contínuo

No utiliza el TNT como fuente de carbono.Construcción de cepas híbridas

Clon A

C H 3

NO2NO2

NO2

TNT

CO2 + H2O

NO2¯

CH3

tolueno

Plásmido TOL de P. putida

CH3

tolueno

COOH

benzoato

OH

OH

catecol

CO2 + H2O

Transferir plásmido TOL al Clon A

C H 3

NO2NO2

NO2

TNTNO2¯

CH3

tolueno

COOH

benzoato

OH

OH

catecol

CO2 + H2O

ClonA + TOL

Cre

cim

ien

to

ClonA

TNT como fuente de C y N

Tiempo (días)

0 3 6 9

EJEMPLO 3

MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOSObjetivo: Conseguir una cepa capaz de degradar p-nitrotolueno

Las Enzimas de la ruta upper de degradación de tolueno de P. putida TOL puede llevar el p -nitrotolueno hasta nitrobenzoato.

El activador XylR NO reconoce a p-nitrotolueno como activador.Ruta meta NO puede llevar el nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.

Necesitamos:Alterar el regulador XylR para que SÍ reconozca p-nitrotolueno y sea capaz de poner en marcha la ruta. Encontrar el segundo segmento de la ruta: nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.

CH3

Nitro-tolueno

NO2

+Pr1 Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+ -

tolueno

+Ps2

3-metilbenzoato

Pm

upper meta

Reguladores

+

pWW0 (ruta meta)

P. putida mt-2

ELEMENTO DE CONTROL:Regulación metabólica en TOL

4NT

A B C D

85Pro Ser

135Asp Asn

172Glu Lys

Mutagénesis química

Regulador - 3-MBA 4NT

XylR 180XylR6 1150XylR49 1500XylR7 150

105019002600900

11021103380 400

CH3

NO2

CH2OH

CH3

P. putida 2440(pWW0Pm)

CH3

NO2

CH2OH

NO2

CHO

NO2

COOH

NO2

P. fluorescens 410PRif(pWW0Pm) + xylR6

COOH

NO2

CH2OH

NO2

CH3

NO2

CHO

NO2

COOH

NO2

COOH

NHOH

NH3

COOH

OHOH

CO2+H2O

Rotura delanillo

X

P. fluorescens410P

COOH

NHOH

NH3

COOH

OHOH

CO2+H2O

COOH

NO2

Rotura delanillo

EJEMPLO 4

Ruta TOL de P. putida puede degradar muchos derivados alquilados del benzoato, pero no etilbenzoato.

Las limitaciones son:El etilbenzoato NO es efector del regulador XylS no se activa la ruta.La catecol 2,3-dioxigenasa se INACTIVA con etilcatecol.

EstrategiaMutagenizar el regulador XylS para que pueda reconocer etilbenzoatoMutagenizar la cateco 2,3 dioxigenasa para que pueda “romper” etilcatecol

EXPANSIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADAR ALQUILAROMÁTICOSEL CASO DEL ETILBENZOATO

COOH

CH2CH3

xylS*

xylE*

COOH

CH3

3-metilbenzoato

Efector +Sustrato

CH3

OHOH CO2

+H2O

COOH

CH2CH3

No es efectorNo es sustrato

CH2CH3

OHOH

COOH

CH2CH3 xylE

COOH

CH2CH3 CH2CH3

OHOH CO2

+H2O

E HPm

pJLR100Ap

E H

Ap TetpBR322

EcoRI-HindIIILigación

E HPm

pJLR200

TetAp

Km

xylSpNM 185

Ap

Pm

Tc

pJLR 200

E.coli (pNM 185) (pJLR 200)

Ap

Pm

Tc

pJLR 200

xylS4

Km

pRD4

Ap,Km,Tc,4EB,EMS

.

..

..

...

Ap,Km Ap,Km,Tc Ap,Km,Tc,4EBTc-r en 3MB

Tc-s en 4EB

L

pERD4

KmxylS4

DE

pWW0

P.putida (pWW0) (pRD4)

.

..

.. .

.

pWW0

D LE*

pERD4

KmxyylS4

P.putida (pWW0-EB)(pRD4)

4EB,EMS

4EB 3MB 4MB

3MB+4MB+4EB-

EJEMPLO 5

COMPETENCIA ENTRE CEPA MANIPULADA Y CONSORCIODegradación de naftalenosulfonato

Se pretende comparar la eficiencia de un consorcio con la de una cepa manipulada genéticamente.

Uno de los miembros del consorcio degrada naftaleno sulfonato hasta salicilato.El otro miembro del consorcio lleva salicilato hasta el ciclo de Krebs.La cepa manipulada puede mineralizar naftalenosulfonato

La velocidad degradadora de ambos sistemas es equivalente.

¿Cómo compiten?

CO2 + H2O

COOH

OH

OH

OH

OH

CHOCOOH

SO3H

OHOH

COOH

OH

Sphingomonas BN6

P. putida NCIB9816

Consorcio

Cepa manipulada

pWW60-3026

Sphingomonas BN6

Tiempo (días)

Nº

de

célu

las

1010

BN6

Cepa manipulada

P. putida

109

108

107

106

0 5 10 15

COMPETENCIA EN QUIMIOSTATO

B13B13Reclutamiento de labenzoate 1,2-dioxygenase

B13B13Reclutamiento adicional de la -lactona isomerase

3CB 4CB 4MB

3CC

OAA

TCA

3CB 4CB 4MB

3CC 4CC 4MC

OAA OAA -L

TCA TCA TCA

-L

3CB 4CB 4MB

3CC 4CC 4MC

OAA OAA º

TCA TCA

-L

CONSTRUCCIÓN DE CEPA CAPAZ DE DEGRADAR CLORO-Y METIL BENZOATOS

EXISTEN PROBLEMAS LEGALES

PARA LA LIBERACIÓN AL MEDIO

DE ORGANISMOS MANIPULADOS

GENÉTICAMENTE

NECESITAMOS SISTEMAS DE CONTROL

SISTEMAS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE

• Construcción de cepas de Pseudomonas putida portadoras de un sistema activo de contención biológica

• Caracterización del proceso de lisis en P. putida tras la inducción de la muerte celular

• Validación en microcosmos de las cepas construídas

OBJETIVO: queremos que la cepa manipuLada desaparezca una vez que ha cumplido su función: contención biológica.

ESTRATEGIA: diseñar un sistema de muerte programadaBuscar elemento matadorElegir elemento regularEnsamblar los componentes e introducirlos en la cepa de interés.

ELEMENTO REGULADOR ELEMENTO MATADOR

PGen regulador Gen letal

Señalexterna

SISTEMA ACTIVO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA

P

La proteína reguladora impide la expresión del gen letal

+

GENES MATADORES

• Nucleasas

• Proteínas tipo porinas

• Gen gef de E. coli

• Colapso del potencial de membrana

• Liberación de ARNasa periplásmica

• Permeabilización a iones Mg2+

• Gen E del fago X174

• Formación de túnel transmembrana

• Liberación del contenido citoplásmico

Gen gef

+Pr1 Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+ -

tolueno

+Ps2

3-metilbenzoato

Pm

upper meta

Reguladores

+

pWW0 (ruta meta)

P. putida mt-2

ELEMENTO DE CONTROL:Regulación metabólica en TOL

NO

SI

Supervivencia

Genmatador

ELEMENTO MATADOR

SISTEMA REGULADO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA

xyl S lac I PlacPm lac I

S

Placxyl S

S S3MB

I I I

I I

-+

ELEMENTO REGULADOR

Pm lac I

lacI

ori

nic

mob

Km

xylS

Pm

pCC10214.7 kb

2

R

P

gefO

R6K

RP4

Ap

tnp

I

Tc

pMCC297500 bp

ori

oriT

A1-04/03

R

R

ENSAMBLAJE DE LOS ELEMENTOS

Cepa de P. putida Elemento controlElemento matador

PA1-04/03 TcRgef

PmlacI

ori

nic

Km

xylS

pCC10214.7 kb

2

R

mobTelPA1-04/03R

genE

EEZ30

CMC12

Cepas contenidas biológicamente

00.01

0.1

1

0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20 24

Cepa control P. putida CMC12

Cre

cim

ien

to celu

lar (D

O6

60

nm

)

glucosa

glucosa

3MB

3MB

P. putida P. putida CMC4 (pWW0)CMC4 (pWW0) P. putida P. putida CMC12CMC12

P. putida P. putida CMC12CMC12

OTRAS TÉCNICAS DISPONIBLES

Ingeniería de proteína

DNA shuffling

Sistemas asociados a la raíz (rizorremedio)

Sistemas asociados a biofilms

EN TODOS LOS CASOS, HAY QUE CONOCER EL FUNCIONAMIENTO DE LOS SISTEMAS