Post on 06-Jan-2015
GK-07
CalorMicroondasUV radiaciónAgitación fuerteDetergentesMetales pesadosSolvente orgánicos Ácidos y bases fuertesSales > Temperatura
> pH
> detergente
> sustancias solubles en agua
efecto de
DENATURACION de PROTEINAS
Preparación de proteínas
factor atención durante la preparación
temperatura evitar alta temperatura, dejar en HIELO
congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado
denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas
efecto de diluciónoxidaciónmetales pesadoscrecimiento de bacterias
proteasas
mantener conc. > 1mg/mlincluir 0,1 – 1mM DTT en el tamponincluir 1 – 10mM EDTA en el tamponutilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelarincluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO
PURIFICACION DE PROTEINAS
- necesario para revelar su estructura- desarrollo de inhibidores- desarrollo de vacunas- aislar proteínas recombinantes para vacunas-- etc...
Vacuna de proteína recombinanteVacas clonadas y geneticamente
modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia)
Taste receptors
Diseño de drogas
Estrategia de purificación de proteínas
- selección del tejido- homogenización- clarificación – precipitación- solubilización y PURIFICACIÓN
- captura- purificación mediana pureza- purificación, ultra pureza
necesario test para monitorearej. detección inmunológica o test funcional
John Kendrew, mioglobina,
Max Perutz, hemoglobina
Cachalote (Physeter catodon)
17,8 kDa
Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,
Localización de los átomos
Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.
Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)
FUNCION
Para obtener cristales proteína pura
Proteína, Purificación
-Fraccionamiento celular-Centrifugación-Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH -Cromatografía exclusión por tamaño -Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina
Fraccionamiento celular
TIPOS DE CENTRÍFUGAS
SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA
DE BAJA VELOCIDAD MICRÓFUGA
DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA
TIPOS DE ROTORES
ROTORES FLOTANTES
ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES
ROTOR VERTICAL
centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga
ROTORES FLOTANTES
DESPUÉS
PELLET
SOBRENADANTE
ANTES
HOMOGENEIZADO
CENTRIFUGACIÓN
En gradiente de densidad:
Centrifugación diferencial:
Fraccionamiento celular
Fraccionamiento celular
Fraccionamiento celular
Fraccionamiento celular
CROMATOGRAFIA
-por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-)
-por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel
- por especificidad: afinidad entre proteína-proteína
ej. anticuerpo
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa
las proteínas con carga negativa pasan de largo
Ej. intercambiadorcationico
Cromatografía de Intercambio Ionico
CM-agarosa CARGA NEGATIVAcarboximetil-agarosa
DEAE-columna CARGA POSITIVADietilaminoetil
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Intercambio iónico
- intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-)
proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna
-intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+)proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
Cromatografía de filtración en gel
Cromatografía de filtración en gel
DIALISIS
Separación por tamañoeliminación de sal
bolsa de diálisis
solución concentrada
tampón
al principio de la diálisis en equilibrio
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Cromatografía de Afinidad
Proteína retenido por interacción con ligando
Elusión por adición de exceso de ligando
Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación
ELECTROFORESIS
electro-foresis; del griego, estar llevado
Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno
Las proteínas se separan por
- carga eléctrica- tamaño y forma
S
S
A1
A2
el -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox
( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro)
-mercaptoetanol
SH
HS
A1 A2
+
El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol
Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH
a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada
negativamente
SH
El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el
desplegamiento de las mismasSDS
–– –– –––– –– ––––
– – ––––
––
La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va
a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)
Fuente de poder
electrodo de platinum
reservorio de tampón superior e inferior
única conexión eléctrica vía el gel
Ele
ctro
do d
e pl
atin
um
+
CÁTODO
ÁNODO
SDS-PAGEcondiciones denaturantesfraccionamiento por tamañocomparación con estándar de tamaño molecular
Proteína purificada
Determinación de la secuencia de proteínas
ESTRUCTURA PRIMARIA
- composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC
- determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres
- secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente
Pero: proteínas > 100 aa
Proteínas
- fragmentar
- secuenciar péptidos
- ordenar secuencia
Tratamiento Punto de ruptura
tripsina
quimotripsina
proteasa V8
bromuro de cianogeno (CNBr)
Lys, Arg
Phe, Trp, Tyr
Asp, Glu
Met
- C – C – N – C – C – N – C – C – N -
O
O
O
H
H
HR1
R2
R3
cortan el enlace peptídico
tratamiento
Ej.
péptidos secuenciados
Tyr-LysGlu-Met-Leu-Gly-ArgPro-Met-ArgMet-Gly-Cys-Lys
Leu-Gly-Arg-MetTyr-Lys-Glu-MetGly-Cys-Lys-Pro-Met+ amino acido básico
Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg
hidrólisis con tripsina
hidrólisis con CNBr
fragmentos con tripsina
fragmentos con CNBr
SECUENCIA deducida: