Post on 11-Feb-2017
Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno a través de
la promoción de la expresión de la oxidasa y la inhibición del estrés del retículo endoplásmico
L. Lu, S. Wang, L. Fu et al.Clinical and Experimental Dermatology 2016; 41: 64–73
Dra. María Gabriela GonzálezResidente de Dermatología y Sifilografía
Introducción Vitiligo enfermedad adquirida caracterizada por Ø progresiva de melanocitos.
Etiología y patogénesis
Estrés oxidativo
Autodestrucción de melanocitos
Factores genéticos
Inicio y progresión de la enfermedad
Desequilibrio REDOX
Peróxido de hidrógeno (H2O2) se acumula en la epidermis y el estrés oxidativo que induce:
Ø del péptido pro-opiomelanocortina Regulación de la señalización colinérgica Apoptosis directamente en los melanocitos
• Estrés en el RE• Promotor de apoptosis en células del epitelio pigmentario de la retina y células HeLa
Autoinmunidad
Introducción
niveles de H2O2 recambio de sustratos sustitutos de la tirosinasa AutoAg
Nuevo Ag Autoinmunidad del melanocito
Fenoles inductores de vitiligo
células dendríticas
producción de IL-6 y IL-8
El extracto de ginkgo biloba
Antioxidante
Detiene la aparición y progresión de vitiligo
Neuroprotector
uno de los principales componentes nonflavone. Trilactone sesquiterpeno con PM 326,3Da
Bilobalide Propiedad de secuestrar radicales libres
Liberación de Hsp 70 de los melanocitos
Investigar si Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales
contra el daño oxidativo inducido por H2O2 y explorar los mecanismos
moleculares subyacentes implicados en esta respuesta.
Objetivo
MétodosAislamiento y cultivo de melanocitos
•Se incubaron durante la noche•Bilobalide se preparó como una Sol de
reserva a 100 mmol/L en DMSO•DMSO sin bilobalide se utilizó para las
muestras de control negativo •H2O2 preparado a partir de una Sol
madre de 30% antes de c/experimento
20ng/ml de bFGF 20µg/ml de IBMX 10ng/ml de TC Suero bovino fetal al 10%
Métodos
Viabilidad celular
se incubaron las células con diversas concentraciones de
bilobalide (0-800µmol /L)
72 horas Citotoxicidad
¿Bilobalide protege a los melanocitos del daño celular inducido por H2O2?
pretratados con bilobalide
(0-400µmol/L) 1 hora
se exponen a 1mmol/L de H2O2 durante 16h
solución de MTS a cada pocillo de cultivo y se incubó
durante 1h a 37°C.
Viabilidad celular
La absorbancia se midió a 490nm con un espectrofotómetro de microplacas y la morfología de las células examinadas bajo un microscopio de luz invertida
Métodos
Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa
evaluar integridad de la MC basada en la cantidad de LDH
citoplásmica liberada en el medio
El sobrenadante de cada pocillo de la placa se transfirió al
correspondiente pocillo de una placa de ensayo enzimático de 9-6 pocillos y se incubaron con
la mezcla de sustrato reconstituida durante 30 min
Tinción de Anexina V-yoduro de propidio
Detectó apoptosis de melanocitos utilizando un kit
comercial
Citómetro de flujo(20.000 eventos)
La medición de liberación de Hsp 70
Se controló usando un kit de inmunoensayo enzimático comercial (EIA).
Medición de ROS intracelulares
Citometría de flujo
Métodos
• Extraído de los melanocitos• Mide niveles de expresión de la
CAT y GPx1• β-actina como control interno
para la normalización
Aislamiento de ARN y el análisis de PCR-TR
en tiempo real
• Postto cel se lavaron una vez con PBS y se lisaron mediante la adición de tampón
• La membrana se incubó con Ac 1° contra CHOP, p-eIF2a, eIF2a y β-actina y con Ac 2° fluorescente marcado con colorante
Inmunotransferencia
Resultados
Bilobalide ejerce un efecto protector contra la citotoxicidad inducida por H2O2 a los melanocitos
(a) (b)
(d) (e)
Análisis estadístico
Prueba de Kolmogorov-Smirnov ANOVA Prueba Dunnett post hoc usando SPSS 17.0
Comparación de grupos múltiples. Cada experimento se realizó por triplicado y repetido 3 veces
Viabilidad celular
Pre-tto x 24h
3,5 veces
ResultadosBilobalide atenúa apoptosis inducida por H2O2 en los melanocitos
ensayo de anexina V-PI
Bilobalide inhibe la secreción de Hsp 70 inducido por H2O2 en los melanocitos
ELISA
12%
62%
36%25%
2,5 veces
Resultados
Bilobalide atenúa la elevación de ROS intracelular inducido por H2O2 mediante la promoción de la expresión de la catalasa y la glutation peroxidasa-1
(b)(a)PCR-TR cuantitativa en tiempo real
2 veces
3 veces
1,2 v
2,7 v
Discusión
Bilobalide protege a los melanocitos contra la apoptosis inducida por H2O2 y la liberación de Hsp70.
CAT
GPx1
Ø H2O2 Co-cultivo de bilobalide + H2O2 fue incapaz de aliviar la citotoxicidad en los melanocitos
Reducen daño oxidativo Expresión de 2 antioxidantes
Hsp
Desencadena respuesta
autoinmune presentación de Ag previamente
oculto
Refuerza respuesta inmune mediante + CD
≠ concentraciones de H2O2
liberación Hsp70 de los melanocitos
Ø tolerancia de cel T hacia Ag propios y mejora reacción
citotóxica de infiltración de LyT
Prevención de la potencial respuesta autoinmune
Inhibición de Ø directa de melanocitos
Conclusión
Bilobalide puede mejorar el estrés RE y apoptosis en los melanocitos humanos inducida por H2O2
Mediante la promoción de la CAT y la síntesis GPx1
Mediante el bloqueo de la inducción CHOP relacionada con la apoptosis
Posiblemente a través de la modulación de la señalización de la UPR.
GRAC
IAS