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LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
EXTRACCION DEL ADN
Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICASMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
CONTENIDOCONTENIDO
Generalidades sobre el ADNGeneralidades sobre el ADN
Muestras para extracción del ADNMuestras para extracción del ADN
Condiciones sobre la remisión de Condiciones sobre la remisión de muestras.muestras.
Métodos de extracción del ADNMétodos de extracción del ADN
- - Salting outSalting out
EL MATERIAL GENÉTICOEL MATERIAL GENÉTICO
CROMOSOMACROMOSOMASS
46 CROMOSOMAS 46 CROMOSOMAS 23 PARES23 PARES
DIPLOIDESDIPLOIDES
UN INDIVIDUOUN INDIVIDUOTIENE 23 CROMOSOMAS TIENE 23 CROMOSOMAS
HEREDADOS DE LA HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 MADRE Y 23
HEREDADOS DEL PADREHEREDADOS DEL PADRE
EL MATERIAL GENÉTICOEL MATERIAL GENÉTICO
Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra.
Está conformado por millones de unidades de nucleótidos
Cada nucleótido esta a su vez formado por:Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
EL MATERIAL GENETICO
BN
BN
A
P
BN
AP
BN
A
PBASES
NITROGENADAS
BN
BN
BN
ADENINA
GUANINA
CITOSINA
TIMINA
REGIONES DEL ADN
De secuencia única (genes)
Medianamente repetitivas
Altamente Repetitivas
CROMOSOMACROMOSOMA
p
qGEN
ADN
REGIONESREPETIDAS
HETEROCROMATINA
EUCROMATINA
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN .
Cantidad de material de partida Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de ANNúmero de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Cantidad de tejido
Condiciones en las que se encuentra el Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, material de inicio (fresco, congelado, fijado)fijado)
Contaminantes e interferentes en el Contaminantes e interferentes en el material biológicomaterial biológico
MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN
SangreSangre SemenSemen SalivaSaliva CabelloCabello HuesoHueso DienteDiente TejidoTejido
MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN
Sangre: derivados porfirinicos de la Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. Hemoglobina.
Manchas: secado.Manchas: secado. Residuo metanolico: Chelex.Residuo metanolico: Chelex. Soportes: Absorbente o no.Soportes: Absorbente o no.
REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR
La posibilidad de extraer el material genético La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. en cualquier indicio biológico.
Análisis por medio de técnicas como la Análisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biológicos en cantidades escasasindicios biológicos en cantidades escasas
REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN
NORMAS DE BIOSEGURIDAD. CADENA DE CUSTODIA. FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS.
PROTECCION DEL PERSONAL
Prevenir contacto directoPrevenir contacto directo Prohibir consumo de comidas y Prohibir consumo de comidas y
bebidas.bebidas. Condiciones de asepsia y Condiciones de asepsia y
material desechable.material desechable. Vacunación.Vacunación.
PROTECCION DE LA PROTECCION DE LA MUESTRAMUESTRA
CONTAMINACION POR MATERIAL CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO.BIOLOGICO HUMANO.
CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.
CONTAMINACION QUIMICA.CONTAMINACION QUIMICA.
TRANSFERENCIA DE INDICIOS TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.BIOLOGICOS.
CONTAMINACION POR MATERIAL
MATERIAL BIOLOGICO HUMANO
Depósito de material biológico Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las posterioridad a la toma de las mismas.mismas.
CONTAMINACION MICROBIOLOGICA
Este tipo de contaminación tiene Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las favorecida por la humedad y las altas temperaturas.altas temperaturas.
CONTAMINACION CONTAMINACION QUIMICAQUIMICA
Presencia de productos químicos que Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del genético, como PCR y extracción del ADNADN
TRANSFERENCIA DE TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.INDICIOS BIOLOGICOS.
Debido al traslado de los Debido al traslado de los indicios de una localización a indicios de una localización a otra puede dar lugar a una otra puede dar lugar a una contaminación o puede contaminación o puede ocasionar la pérdida de la ocasionar la pérdida de la prueba. prueba.
DEGRADACION DE LAS DEGRADACION DE LAS MUESTRASMUESTRAS
Humedad ambiental.Humedad ambiental. Fenómenos meteorológicos, acción de Fenómenos meteorológicos, acción de
insectos, entre otros.insectos, entre otros. Recogida y envió al laboratorio de estas Recogida y envió al laboratorio de estas
evidencias de una manera adecuada para evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material consiguiente la degradación del material genéticogenético
DEGRADACION DE LAS MUESTRAS
Exponer por mucho tiempo las muestras a Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca los rayos ultravioleta provoca daños sobre daños sobre la estructura del ADN,la estructura del ADN, o aplicar ciertos o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.sobre la cadena del ADN.
DOCUMENTOS NECESARIOS
Formulario de envio de muestras.Formulario de envio de muestras.
Identificacion de Muestras.Identificacion de Muestras.
Cadena de Custodia.Cadena de Custodia.
FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS
Investigacion solicitada: Investigacion restos Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre.de sangre.
Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha.los hechos, lugar, fecha.
Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso.el sospechoso.
Datos del sospechoso: Datos del sospechoso:
IDENTIFICACION DE LAS IDENTIFICACION DE LAS MUESTRASMUESTRAS
Listado de muestras de referencia: Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso.la persona, relación con el caso.
Listado de indicios biológicos: numero Listado de indicios biológicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y vaginal), a quien pertenece y localización, tipo de indicio a estudiar.localización, tipo de indicio a estudiar.
CADENA DE CUSTODIACADENA DE CUSTODIA
Nombre o identificación, firma.Nombre o identificación, firma.
Fecha y hora de la recogida.Fecha y hora de la recogida.
Condiciones de almacenaje de las Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío.muestras hasta su envío.
METODOS DE EXTRACCIONMETODOS DE EXTRACCIONDE ADNDE ADN
SALTING – OUTSALTING – OUT
CHELEX CHELEX
FENOL - CLOROFORMOFENOL - CLOROFORMO
FENOL CLOROFORMO
Técnica Orgánica (Solventes)Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad.ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la Peptidos y proteinas son extraidas en la
fase organicafase organica (Fenol), (Fenol), después se realiza después se realiza digestión condigestión con proteinasa K. proteinasa K.
El cloroformo permite que todo el fenol El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.pueda ser lavado.
DESVENTAJASDESVENTAJAS: : - Reactivos altamente tóxicosReactivos altamente tóxicos- Perdidas significativas de ADN y mucho Perdidas significativas de ADN y mucho
mas si esta degradado.mas si esta degradado.
CHELEX Técnica inorgánicaTécnica inorgánica
Previene la degradación del ADN por quelación Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al de los iones metálicos durante la ebullición al 5%.5%.
Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato.inones iminodiacetato.
los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN.los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN.
DESVENTAJASDESVENTAJAS:: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado
en PCR pero no en RFLPS.en PCR pero no en RFLPS.
SALTING-OUTSALTING-OUT
Técnica de tipo inorgánica Utiliza reactivos bajos en
toxicidad Permite visualizar la malla del
ADN.
Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.
1. Lisis Celular1. Lisis Celular
2. Extracción2. Extracción
3. Precipitación3. Precipitación
4. Resuspensión4. Resuspensión
SALTING OUTSALTING OUT
LISIS CELULARLISIS CELULAR
Buffer de lisis I: (Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojoslisis glóbulos rojos).).
- Sucrosa- Sucrosa
- MgCl2 1M- MgCl2 1M
- Triton x 100- Triton x 100 Buffer de lisis II: (Buffer de lisis II: (lisis glóbulos lisis glóbulos
blancos)blancos)
EDTA de NaEDTA de Na
NaCL.NaCL.
EXTRACCION
Lauril sulfato de sodio al 10%: Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinasdespolariza las proteinas
Perclorato de sodio 5MPerclorato de sodio 5M NaCl 6MNaCl 6M
PRECIPITACION
IsopropanolIsopropanol
Etanol al 70% lava el exceso de Etanol al 70% lava el exceso de sales.sales.
RESUSPENSION
Se realiza en Buffer T. E. ( Tris Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede EDTA) o también se puede realizar en agua.realizar en agua.
EXTRACCION SALTING OUT
CONCLUSIONES El ADN es el material genético a través del cual El ADN es el material genético a través del cual
se transmite la información contenida en los se transmite la información contenida en los genes de generación en generación.genes de generación en generación.
El ADN esta presente en los indicios biológicos El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc.etc.
Es muy importante conocer las condiciones para Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras.la remision adecuada de las muestras.
El Salting-out es uno de los métodos de El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.permite la visualizacion del ADN.
BIBLIOGRAFIA MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba
del ADN en medicina forense. Masson: del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999.Buenos Aires.1999.
Grupo Español y portugués de la ISFG. Grupo Español y portugués de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación de la muestras con fines de identificación genética. Madeira, 2 de Junio 2000.genética. Madeira, 2 de Junio 2000.
MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.16: 1215. 1988.