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1Electroforesis Capilar (CE).
Bases de Electroforesis Capilar.
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Qu es la Electroforesis?
Es el movimiento de una molcula cargada debido a un campo elctrico externo, es decir, si se coloca una muestra inica y le es aplicado un potencial, sta tender a dirigirse hacia el polo opuesto a su propia carga.
+
+
-
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Movimiento de una molcula cargadadebido a un campo elctrico externo.
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Fuerza de aceleracin
Fuerza de friccin
fvqE =
La movilidad electrofortica es la constante de proporcionalidad entre la velocidad del in y la fuerza del campo elctrico.
EEfqv =
q = carga del ionE = campo elctricof = coeficiente de friccinv = velocidad del ion
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Separacin dentro de tubos capilares.
N
N
N
N
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Un poco de Historia Es una tcnica relativamente
nueva, el primer instrumento comercial apareci en los aos 80s.
La EC experiment desde su aparicin un crecimiento muy importante, situndose rpidamente para el anlisis de una gran variedad de muestras, compitiendo en la mayora de ellas con las tcnicas de mayor tradicin analtica como HPLC y CG.
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Principales Caractersticas de CE.
Se desarrolla en un capilar de slice fundida (i.d. 25-150 m).
Opera en medio acuoso (aunque actualmente se est desarrollando en solventes orgnicos polares [NACE]).
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Principales Caractersticas de CE.
Se requieren volmenes muy pequeos de muestra (1-50 nL inyectados).
A travs del capilar son aplicados altos voltajes (10 a 30 kV) y campos elctricos (100 a 1000 V cm-1)
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Principales Caractersticas de CE. La alta resistencia del capilar limita la
generacin de corriente y el calentamiento interno.
Presenta alta eficiencia (N>105 a 106) y tiempos de anlisis cortos.
Tiene numerosas modalidades y un amplio rango de aplicacin.
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Principales Caractersticas de CE. El desarrollo del mtodo es muy simple.
Instrumentacin automatizada.
La deteccin se puede llevar a cabo de 2 formas: On-capillary. Decoupled detection cell.
Instrumentacin.
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Principio de CE.
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Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin Hidrodinmica.
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Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin Electrocintica.
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Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin por Vaco.
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Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin por Sifoneo.
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Cmo detecto las especies?
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Flujo Electroosmtico
(EOF)
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Superficie de Slice fundida cargada negativamente.
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Los cationes hidratados se acumulan cerca de la superficie.
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El flujo va en direccin hacia el ctodo cuando se aplica el campo elctrico.
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EOFEOF
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Caractersticas:
Flujo electroosmtico Flujo parablico
CE GC, HPLCCE GC, HPLC
Menor ancho de bandaMenor ancho de banda Mayor ancho de bandaMayor ancho de banda
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La velocidad del EOF es mayor a la movilidad de cualquier especie, independientemente de su carga.
Caractersticas:
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N
N
N
N
Separacin por Electroforesis Capilar
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Electroferograma
Tiempo de migracin (min)
Sea
l
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Modos de Operacin de EC.
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Hidrofbicas/ interacciones inicas con micelas/retardacin.
Cromatografa MicelarElectrocintica (MEKC)
Tamao y CargaElectroforesis Capilar en Gel (CEG)
Solucin Libre/relacin masa carga.(FS/ capilares fundidos)
Electroforesis Capilar de Zona (CZE)
Bases de la Separacin.Modo de Operacin
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Movimientos FronteraIsotacoforesis (ITP)
Interaccin con fases slidas/retardacin.
ElectrocromatografaCapilar (CEC)
Punto Isoelctrico.Electroforesis de Enfoque Isoelctrico (IEF)
Bases de la Separacin.Modo de Operacin
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Electroforesis Capilar de Zona
Forma
ms
simple
de EC
Migracin por
diferencia de carga.
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Mecanismo de Separacin por Electroforesis Capilar de Zona
Desarrollada en capilares de slice descubiertos y permanentemente o dinmicamente en capilares cubiertos.
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CE + Crom. = MECK
Caracterstica: separa especies neutras
Adici
n de te
nsoacti
vos
por arr
iba de s
u CMC
N
N
N
N
N
N
N
N
CMC=concentracin micelar crtica
Cromatografa Micelar Electrocintica.
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Electroforesis Capilar en Gel
Basada en laElectroforesis en Gel
convencional.
Separacinbasada en el
tamao.
Capilar relleno conpolmero, acta como
tamiz molecular.
Algunas protenas y ADNtienen masa/carga similaresdeben separarse por CGE.
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
pH
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
20
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
40
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacinbasada en el
Punto Isoelctrico.
Generacinde un gradiente
de pH
Instrumentacin.
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Reservorios
Electrolitos
Muestras
Fuente de poder
Sistema de deteccinCapilar
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Electrolito Electrolito
Capilar
MuestraON
OFF
Fuentede poder
O NO FF
150 mV
DetectorControl
PC
-+
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Capilares
Composicin (Slice).Dimetro interno (25-75 m).Longitud (30-75 cm).Modificados.Control temperatura.
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Detectores
UV-VISDiseo especial
Deteccin Universal
Amplio intervalo DAD
Fluorescencia
Fcil adaptacin
Alta sensibilidad
Derivatizacin
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Detectores
Espectrometra Masas
Problema de interfase (electro-spray)
Caracterizacin absoluta
Verstil
Aplicaciones.
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Separaciones quirales
Biociencia
Medioambiente
Alimentos
Industria
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Separaciones Quirales.
Gran importancia en Farmacia y Alimentos Tradicionalmente se realizan por HPLC y GC D,L aminocidos Frmacos Ismeros
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Biociencia
Gran cantidad de aplicaciones.
Pptidos y protenas (caracterizacin, secuenciacin, pI,
etc.)
cidos nucleicos y pruebas de pureza
Drogas, frmacos y metabolitos (tabletas, inyectables,
etc.)
Forense (LSD, morfina, cocana, plvora, etc.)
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Medioambiente
Variedad de anlisis medioambientales:
Aguas (ros, lagos, lluvia, potable, residuales, etc.)
Suelos (cultivos, lixiviados, suelos varios)
Ejemplos de aplicaciones: cidos orgnicos, colorantes,
sustancias hmicas, pesticidas, iones inorgnicos,
aminas, tensoactivos, cidos aromticos, etc.
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Alimentos Muestras analizadas:AguasFrutasBebidas refrescantesBebidas alcohlicasLeche y productos lcteosPescados y mariscosCarnesHortalizas y vegetalesCerealesY ms...
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Alimentos
Sustancias estudiadas:Iones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio,
cloruros, fosfatos, citratos, etc.).
cidos orgnicos (maleato, citrato, acetato, lactato, ascrbico, etc.)
Otros compuestos Orgnicos (cafena, histaminas, pesticidas, azcares, edulcorantes artificiales, etc.)
Protenas (Suero de leche, queso, preparados protenicos, etc.)
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Industria
Diversas reas de aplicacin: materia prima, control
de calidad, aguas residuales, etc.
Caracterizacin de polmeros
Compuestos sintticos
Contaminantes
Se incluyen las aplicaciones anteriores
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0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
Tiempo (min)
Abs
(mU
.A.)
(Orina)
(Estndar)
(Orina dopada)
T
OTC
DTR1
OH O
CH3R2 R3H
N(CH3)2
OHOH O
OH
O
NH2
pKa1
pKa2
pKa3
pKa4
-OH-H-ClDoxitetraciclina-H-OH-HOxitetraciclina-H-OH-HTetraciclinaR3R2R1Nombre comn