MÓDULOMÓDULO III

ELECTRICIDAD Y ELECTRICIDAD Y ELECTROFORESISELECTROFORESIS

IIII

• carga de la partícula (pH)carga de la partícula (pH)

•fuerza iónica del mediofuerza iónica del medio

•tamaño (radio) y forma de la partículatamaño (radio) y forma de la partícula

• viscosidad del medioviscosidad del medio

•temperaturatemperatura

Entonces, la movilidad electroforética depende de:Entonces, la movilidad electroforética depende de:

= v / E = q / kf

Repasemos:

¿Qué ocurre con la movilidad electroforética si...

• se modifica la caída de potencial aplicada?se modifica la caída de potencial aplicada?

• se modifica la longitud del soporte?se modifica la longitud del soporte?

= v / E

• se modifica el tiempo de corrida?se modifica el tiempo de corrida?

= d . L / t . Vab

Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.

¿Qué ocurrió con la movilidad electroforética a altos valores de diferencia de potencial?de potencial?

Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.

d

V

EFECTO JOULE

Q/tpo = k.V.i

1

2

R

tiempo de corrida

Variación de la resistencia del soporte durante la corrida

• Papel

• Acetato de celulosa

Voltaje constante vs Intensidad constante

Voltaje constante

V = R.i = constante

Q/t = k.V. i = k.R.i2

Al transcurrir la corrida:

R i Q/t evaporación de solvente Fuerza iónica

Refrigerar

Voltaje constante vs Intensidad constante

Intensidad constante

i = R/V = constante

Q/t = k.V. i = k.R.i2

Al transcurrir la corrida:

R V Q/t pero como V :

= d . L / t . V

d debo t difusión resolución

Equilibrio de disociación o ionización de un ácido débil en solución acuosa

HA H+ + A-

[H+] [A-]

KA=

[HA]

Constante de disociación

Ecuación de Henderson Hasselbach

[A-]

pH = pKA + log

[HA]

Tomando el log negativo de ambos miembros y sustituyendo - log [H+] por pH y - log Ka por pKA y ordenando:

[H+] [A-]

KA=

[HA]

Entonces...

COO

H3N – C – H

R

+

- COOH

H3N – C – H

R

+ COO

H2N – C – H

R

-

pH ácido Punto isoiónico alcalino

Forma iónica Catión Ión anfótero Anión

Migración Hacia el cátodo Nula Hacia el ánodo

Distancia Negativa Nula Positiva

Variación de la movilidad electroforética con el pH del medio

+

-

+

- COO

H3N – C – H

R

COO

H2N – C – H

R

COOH

H3N – C – H

R

pH < pI pH = pI pH > pI

Movilidad electroforética en función del pH

-25

-20-15

-10

-50

5

10

1520

25

0 5 10 15

pH

Mo

vili

da

d

ele

ctr

ofo

rética

curva corregida por efecto electroendosmóticocurva experimentalTestigo neutro

pI

Se dispone de un aminoácido que posee los siguientes grupos ionizables:

COOH

H2N – C – H

R (NH2)

pKa = 2.0

pKa = 10.0

pKa = 12.0

a) Esquematice las estructuras predominantes a pH: 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14.

b) Calcule carga neta exacta a cada pH.

c) Estime el pI aproximado a partir de los pKa.

Se desea determinar el pI de una proteína. Los datos experimentales obtenidos en las distintas corridas son:  

pH intensidad (mA)

tiempo (minutos)

distancia recorrida por

la proteína (cm)

distancia recorrida por

el dextrano (cm)

2.0 4.0 20 - 7.0 0.0

4.0 4.0 25 - 4.0 0.0

6.0 7.0 40 - 1.0 - 0.5

8.0 3.0 25 2.0 - 1.0

10.0 3.0 30 5.0 - 2.0

Longitud de cada tira = 20.0 cm. Resistencia de cada tira = 105 .

 a) Determine el campo eléctrico aplicado en cada corrida.b) Calcule las movilidades de la proteína a cada pH.c) Calcule pI de la proteína.

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

Neutros

Neutros

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

Ácidos

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

Básicos

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: polipéptidos y proteínas

Son polímeros de aminoácidos unidos por uniones peptídicas

Polipéptidos: 10 -100 aminoácidos

Proteínas: más de 100 aminoácidos

Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: ácidos nucleicos (ADN y ARN)

Según su objetivo, la electroforesis puede ser:

• Preparativa:

AISLAMIENTO de las distintas fracciones (utiliza mayor cantidad de muestra)

• Analítica:

ANÁLISISde las bandas obtenidas (utiliza poca muestra)

La electroforesis puede realizarse en forma:

• Vertical

• Horizontal

• Unidireccional

• Bidireccional

Tipos de electroforesis de uso más frecuente en la actualidad

• Electroforesis en medio soporte:

- convencional

- SDS-PAGE: densidad de carga

uniforme separación de proteínas por pesos

moleculares

- isoelectronfoque: gradiente de pH

alta resolución

• Electroforesis capilar

Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:

1) Objetivo de la electroforesis: tipo de electroforesis.

2) Soporte y buffer de corrida.

3) Modo y lugar de siembra de la muestra.

Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:

4) Condiciones de corrida: voltaje (bajo, mediano o alto) e intensidad. Si se trabaja con voltajes medianos y altos debe refrigerarse la corrida para evitar el efecto Joule.

Puede trabajarse a voltaje o intensidad constante.

5) Tiempo de corrida

Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:

6) Revelado:

•colorantes

•inmunofijación

•enzimático

•transferencia a una membrana de nitrocelulosa y posterior revelado (inmunoblot) : Westernblot (proteínas), Southernblot (ADN), Northenblot (ARN)

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS LIBRELIBRE

1937

Tiselius

CROMATOGRAFÍA

Avance Tecnológico

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS EN SOPORTESEN SOPORTES

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CAPILARCAPILAR

2004

AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDADAUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD

Electroforesis en aElectroforesis en acetato de celulosa

Proteinograma de suero

SDS-PAGESDS-PAGE

Isoelectroenfoque (IEF)Isoelectroenfoque (IEF)

Electroforesis Electroforesis bidimensionalbidimensional

Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar

Páginas a consultar:

1)http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro_Sim.html

2)http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java/electrophoresis/

3)http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html

FIN