SONIA RODRÍGUEZ

ANALISYC-II

CSIC-AI

5 Abril 2011

DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN, ENRIQUECIMIENTO Y ANÁLISIS

DE COMPUESTOS BIOACTIVOS A PARTIR DE PRODUCTOS VEGETALES

OBJETIVO 3. Nuevas metodologías analíticas para la determinación

de componentes naturales y/o ingredientes autorizados de los

alimentos, incluyendo cultivos de leguminosas y cereales o sus

derivados, frutos, aceites vegetales, fórmulas alimenticias, alimentos

enriquecidos y extractos alimentarios.

OBJETIVO 5. Desarrollo y optimización de metodologías de

preparación y fraccionamiento de muestras; avances en optimización

y validación de datos analíticos; integración de técnicas instrumentales

mediante la creación de una plataforma instrumental común

HITO 8. Metodologías analíticas basadas en GC-MS para la

determinación de carbohidratos bioactivos en extractos

vegetales de uso alimentario y en alimentos enriquecidos.

MATERIALES

VEGETALES

EXTRACCIÓN

ENRIQUECIMIENTO

ACTIVIDAD

IN VITRO

TOXICIDAD

ESTABILIDAD ENSAYOS

IN VIVO

CLINICOS

INGREDIENTE INDUSTRIA ALIMENTARIA

ANÁLISIS

CARACTERIZACIÓN

MATERIALES

VEGETALES

EXTRACCIÓN

ENRIQUECIMIENTO

ACTIVIDAD

IN VITRO

TOXICIDAD

ESTABILIDAD ENSAYOS

IN VIVO

CLINICOS

INGREDIENTE INDUSTRIA ALIMENTARIA

ANÁLISIS

CARACTERIZACIÓN

*IMINOAZÚCARES

DESOXINOJIRIMICINA (DNJ)

FAGOMINA

PROPIEDADES: Inhibición de glicosidasas (control de la glicemia,

anticancerígenos, antivirales, etc)

PINITOL

*INOSITOLES Y DERIVADOS

PROPIEDADES: Control de la glicemia

CARBOHIDRATOS BIOACTIVOS

*PREBIÓTICOS: carbohidratos no digeribles que

estimulan selectivamente el crecimiento de bacterias

beneficiosas de la microflora intestinal

Chiro-INOSITOL

BIOSEARCH S.A.

MORERA

TRIGO SARRACENO

FRUTOS SECOS

SOJA

LEGUMBRES

HOJAS DE ALCACHOFA

LECHUGA…

CHUFA …

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

Desarrollo de un método de extracción,

enriquecimiento y análisis de iminoazúcares a

partir de hojas de morera (Morus sp.)

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

Morus sp. IMINOAZÚCARES (DNJ, fagomina)

HPLC

GC-MS

OPTIMIZAR DERIVATIZACION

DERIVADOS

PERACETILADOS TMS DERIVADOS ALDONONITRILOS PERACETILADOS (PAAN) TMS-OXIMAS

6.00 12.00 18.00 24.00 30.00

600000

1200000

1800000

2400000

3000000

3600000

4200000

4800000

min

Abundance

TMS-OX

min 6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00

2000000

6000000

10000000

14000000

18000000

Abundance TMS

Ribosa +

fagomina

ribosa

6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

Abundance PAAN

min

fagomina

6.00 10.00 14.00 18.00 6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00

2000000

6000000

10000000

6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00

400000

800000

1200000

1600000

2000000

2400000

2800000

3200000

3600000

400000

800000

1200000

1600000

2000000

2400000

2800000

3200000

3600000

min

Abundance ACETILADOS fagomina

+ fructosa

DNJ

I.S.

Myo-inositol

fructosa

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

Myo-inositol

I.S.

DNJ

fructosa

fructosa

DNJ

Myo-inositol

I.S.

fagomina

DNJ

Myo-inositol

I.S.

MSTFA

BSTFA

HMDS

SILILACIÓN

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

* Rampa de temperaturas del horno

Columna capilar de metilsilicona

(30 m x 0.25 mm i.d.x 0.25 μm df)

100 ºC

0 min

200 ºC

300 ºC

50 min

15 min

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

7.50 8.50 9.50 10.50 11.50

200 ºC

300 ºC

7.50 8.50 9.50 10.50 11.50

* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)

10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00

200000

600000

1000000

1400000

1800000

2200000

Tiempo

AbundanceMORERA 240 ºC

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

28.50 29.00 29.50 30.00 30.50 31.00 31.50 32.00

240 ºC

28.50 29.00 29.50 30.00 30.50 31.00 31.50 32.00

200 ºC

* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)

8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00 32.00

200000

500000

800000

1100000

1400000

1700000

2000000

Tiempo

AbundanciaMORERA 240 ºC

1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

EXTRACCIÓN CONVENCIONAL

EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)

A. EXTRACCIÓN

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

* DISOLVENTE

EXTRACCIÓN CONVENCIONAL

A. EXTRACCIÓN

* CICLOS 3er ciclo ( 17% en compuestos de interés)

mg / g de MUESTRA

Disolvente FAGOMINA DNJ MYO-INOSITOL GLICOSIL-INOSITOLES

H2O 0,33 (0,04) 1,25 (0,01) 2,64 (0,13) 0,32 (0,05)

H2O AC 0,34 (0,01) 1,35 (0,02) 3,45 (0,03) 0,28 (0,02)

H2O-MEOH 50% 0,23 (0,04) 1,26 (0,06) 2,33 (0,29) 0,05 (0,01)

MEOH 0,10 (0,01) 0,59 (0,01) 1,35 (0,03) 0,01 (0,00)

H2O-ETOH 50% 0,13 (0,01) 0,80 (0,02) 1,84 (0,01) 0,03 (0,00)

ETOH tr tr 0,11 (0,01) tr

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

válvula

Celda de

extracción

Gas de secado

Vial colector

Bomba

Horno

Disolvent

válvula

e

Disolventes a altas presiones y temperaturas

A. EXTRACCIÓN

EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

Temperatura (50 ºC, 100 ºC y 150 ºC )

Tiempo (2, 5,15 y 30 min)

Cantidad (0,05 y 0,1 g)

Condiciones óptimas

50 ºC, 5 min, 0,05 g

1 ciclo

A. EXTRACCIÓN

EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)

Ciclos (1 y 2)

MUESTRA

MORERAFAGOMINA DNJ

MYO-

INOSITOL

GLICOSIL-

INOSITOLES

1-3 CICLOS

CONVENCIONAL0,47 (0,01) 2,44 (0,04) 7,88 (0,15) 0,72 (0,07)

50 ºC 5min 0,05 g

PLE (1 CICLO)0,48 (0,15) 2,52 (0,89) 8,90 (1,88) 0,35 (0,06)

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

A. EXTRACCIÓN

VENTAJAS DEL PLE: rapidez, manejo de muestra, escalado industrial

INTERCAMBIO CATIÓNICO

Extracto original

4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00

1000000

3000000

5000000

7000000

9000000

1.1e+07

Tiempo (min)

TIC

fagomina

DNJ

myo-inositol

P.I.

sacarosa

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

B. ENRIQUECIMIENTO

Lavado 1: agua

Lavado 2: 2M NH4OH

6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

Tiempo (min)

TIC

fagomina

DNJ

P.I. sacarosa

Incubación 37 ºC 5h

2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO

B. ENRIQUECIMIENTO

Saccharomyces cerevisiae

Control 0 h 5 h 8 h

Fructosa Glucosa Galactosa Sacarosa Trehalosa

CARBOHIDRATOS

Control 0 h 5 h 8 h

Fagomina DNJ

IMINOAZÚCARES E INOSITOLES

Tiempo (horas)

Fagomina Gliceril-inositoles

Tiempo (horas)

CANTIDADES (mg/ g Muestra)

MUESTRA FAGOMINA DNJ MYO-

INOSITOL

GLICERIL-

INOSITOLES FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA

CONTROL 0,47 2,44 7,88 0,72 43,89 48,10 4,36

RESINAS LAVADO 2

0,48 2,24 0 0 0 0 0,93

LEVADURAS 5 H

0,41 2,27 8,06 0,6 0 0 0

CANTIDADES (mg/ g peso seco del extracto)

MUESTRA FAGOMINA DNJ MYO-

INOSITOL

GLICERIL-

INOSITOLES FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA

CONTROL 2,55 13,8 46,08 4,25 279,69 308,16 28,13

RESINAS LAVADO 2

10,53 49,62 0 0 0 0 20,63

LEVADURAS 5 H

2,58 14,28 50,42 3,69 0 0 0

PLE

Apropiado para la extracción de carbohidratos bioactivos en hojas de morera

rápida, limpia y de fácil escalado

Aplicación a OTRAS MUESTRAS

RESINAS DE INTERCAMBIO CATIÓNICO

LEVADURAS

3. ACTIVIDAD

* PLE acoplado con resinas

1. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN

* Antiamilasa y antiglucosidasa

4. ESTUDIO COMO INGREDIENTE

toxicidad, estabilidad…

2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS

* HILIC

* Columnas Líquidos Iónicos