Tp 5. Caso clínico I: Priorización de variantes y clasificación de patogenicidad

Dr. Sergio Nemirovsky y Lic. Guadalupe BudaDpto. de Química Biológica FCEN-UBA

Parte 0: Evaluación del caso.

Parte 0: Evaluación del caso. Ejemplo:Paciente de sexo femenino, de 62 años, Argentina, con diagnóstico presuntivo: Síndrome de Cowden:

● 37 años: histerectomía y ooforectomía derecha por la presencia de miomas.● 52 años: cirugías mamarias en múltiples ocasiones, con diagnóstico de cáncer primario

mamario. ● 53 años: nefrectomía parcial por cáncer renal de células claras en el riñón izquierdo.● 54 años: tiroidectomía total por carcinoma papilar de tiroides

Parte 0: Evaluación del caso. Ejemplo:Paciente de sexo femenino, de 62 años, Argentina, con diagnóstico presuntivo: Síndrome de Cowden:

● 37 años: histerectomía y ooforectomía derecha por la presencia de miomas.● 52 años: cirugías mamarias en múltiples ocasiones, con diagnóstico de cáncer primario

mamario. ● 53 años: nefrectomía parcial por cáncer renal de células claras en el riñón izquierdo.● 54 años: tiroidectomía total por carcinoma papilar de tiroides● La familia presenta historial de distintos tipos de cáncer por lo que se infiere una

susceptibilidad genética. El diagnóstico probable es Síndrome de Cowden, aunque también se contemplan otros síndromes que generen cáncer hereditario.

Parte 0: Evaluación del caso. Familiograma:

Parte 0: Evaluación del caso. Familiograma:

Parte 0: Evaluación del caso. Genes Candidato:

Aportados por el profesional PTEN (Síndrome de Cowden)TP53 (Síndrome de Li-Fraumeni)BRCA1, BRCA2

Parte 0: Evaluación del caso. Genes Candidato:

Aportados por el profesional PTEN (Síndrome de Cowden)TP53 (Síndrome de Li-Fraumeni)BRCA1, BRCA2

Cowden Syndrome NGS PanelDDC Molecular Diagnostics Laboratory

AKT1, PIK3CA, PTEN, SDHB, SDHD

Disorders associated with Malignancy PanelCeGaT GmbH

AKT1, ATM, AXIN2, BLM, CTC1, CYLD, DDB2, DKC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERCC8, FERMT1, FLCN, GTF2H5, MLH1, MSH2, MSH6, NF1, NF2, NHP2, NOP10, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, POLH, PRKAR1A, PTCH1, PTEN, RECQL4, RHBDF2, RTEL1, SDHB, SDHD, STK11, TERC, TERT, TINF2, TSC1, TSC2, WRAP53, XPA, XPC

iGene Cancer PanelApolloGen, Inc.

APC, BMPR1A, BRCA1, BRCA2, CDH1, CDKN2A, MEN1, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, NTRK1, PMS2, PTEN, RET, SMAD4, STK11, TP53, VHL

Parte I: Priorización de variantes.

Parte I: Priorización de variantes. Resultados de la secuenciación:

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Modelo de Herencia 1

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Modelo de Herencia 1

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

A CLASIFICACIÓN

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

0 Variantes

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

0 Variantes

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

0 Variantes

A CLASIFICACIÓN

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

PTEN, etc.

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

0 Variantes

0 Variantes

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Autosómico Dominante

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Probando

Modelo de Herencia 2

Modelo de Herencia 1

Genes Candidato

Patogenicidad Reportada

Variantes no presentes en Bases de Datos, de posible impacto

Genes Candidato

ETC.

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:Probando Modelo de Herencia 1 Genes candidato Patogenicidad Reportada

Probando Modelo de Herencia 1 Genes candidato Sin registro en DB

Probando Modelo de Herencia 1 --- Patogenicidad Reportada

Probando Modelo de Herencia 1 --- Sin registro en DB

Probando Modelo de Herencia 2 Genes candidato Patogenicidad Reportada

Probando Modelo de Herencia 2 Genes candidato Sin registro en DB

Probando Modelo de Herencia 2 --- Patogenicidad Reportada

Probando Modelo de Herencia 2 --- Sin registro en DB

Probando --- Genes candidato Patogenicidad Reportada

Probando --- Genes candidato Sin registro en DB

Probando --- --- Patogenicidad Reportada

Probando --- --- Sin registro en DB

Muy Pocas Variantes

Gran Cantidad de Variantes

¿Cómo podemos priorizar las variantes en los últimos pasos del Workflow?

● No encontramos nada en pasos anteriores,● Ahora tenemos numerosas variantes,● Afectan numerosos genes,● ¿Podemos filtrarlas aún más?● ¿Podemos seleccionar genes más relevantes y

enfocar nuestra búsqueda en ellos?● ¿Aún cuando no fueron incluidos en nuestros

paneles?

Parte I: Priorización de variantes. Flujo de Trabajo:

Parte I(I): Clasificación de las variantes priorizadas:

Criterio ACMG: clasificación de variantes.

A comenzar

el TP…

Caso clínico IResumen clínico

Paciente de 4 años hijo único de padres no consanguíneos, sin antecedentes familiares de importancia. Al año de vida se internó por hepatoesplenomegalia enestudio y fue interconsultado a la división inmunología por presentar un síndrome genético en estudio junto con diarrea crónica e infecciones recurrentes. Como diagnóstico clínico tentativo se contempla Síndrome de Hiper IgM y, como alternativos, Agammaglobulinemia o Inmunodeficiencia Común Variable. Entre los síntomas principales que llevaron al diagnóstico se encuentran: infecciones recurrentes, síndrome linfoganglionar y EII. Estudios realizados: IgG:116mg/dl, IgM:373mg/dl e IgA 72mg/dl, expresión de la molécula CD40 normal. Por ausencia de variantes patogénicas en los genes CD40-L, AICDA y NEMO, se descartaron las inmunodeficiencias relacionadas con estos genes.

Criterio ACMG: clasificación de variantesDos pasos:I) Cada característica de las variantes se asocia a un código (que equivale a un puntaje) compuesto por 6 niveles (PVS, PS, PM, PP, BA y BS).

PVS1 Variante nula (sin sentido, desplazamiento de marco) en un gen donde “loss-of-function” (LOF) es un mecanismo conocido de la enfermedad.

PS3 Estudios funcionales in vitro o in vivo que apoyan un efecto dañino sobre el gen o el producto génico resultante.

BA1 La frecuencia del alelo es mayor al 5%.

Criterio ACMG: clasificación de variantesI) Clasificación de variantes:

-Patogénicas o probablemente patogénicas. El criterio se pondera como: -Muy fuerte (PVS1).

-Fuerte (PS1-4)-Moderado (PM1-6)-“De apoyo” (PP1-5).

-Benignas o probablemente benignas. El criterio se pondera como: -Independiente (BA1).

-Fuerte (BS1-4)-”De apoyo” (BP1-6).

La numeración dentro de cada categoría no conlleva ninguna diferencia de relevancia y simplemente ayuda a diferenciar los distintos criterios.

Criterio ACMG: clasificación de variantes●

●●

Criterio ACMG: clasificación de variantes

Criterio ACMG: clasificación de variantes

Criterio ACMG: clasificación de variantes

Información Se detecta en heterocigosis la variante missense c.322C>T (p.Arg108Cys), descrita previamente en la base de datos Human Gene Mutation Database (HGMD) asociada a epilepsia mioclónica progresiva, y en ClinVar como variante patogénica (PS1, PP4). La variante presenta predicción in-silico como patogénica (PP3), posee muy baja frecuencia en ExAC (sin la presencia de individuos homocigotas) (PM2) y se encuentra acompañada por una segunda variante patogénica/posiblemente patogénica en trans (PM3). De acuerdo con el criterio ACMG, la variante se clasifica como Patogénica (PS1 + 2PM + 2 PP).

Patogénica

Probablemente patogénica

BenignaPosiblemente Benigna

Significado incierto

II) La suma del puntaje (derivado de las características) determina la clasificación de la variante en:

Ejemplos:

Patogénica: 1 Muy fuerte (PVS1) Y 1 Moderada (PM1–PM6)Benigna: ≥2 Fuertes (BS1–BS4)

Patogénica≥≥

≥≥

≥≥

≥

≥≥

≥≥

≥

≥

Combinación de los criterios de acuerdo con las reglas de puntuación

Ejemplo Posición Gen Variación

nucleotídicaCambio deaminoácido

Efecto Cigosidad Cob. Info Externa

6:14600741

2

EPM2A c.322C>T p.Arg108Cys Cambio de aminoácido

HET 28/63 Patogénica:MT, CLNSIG 5,

PolyPhen

Se detecta en heterocigosis la variante missense c.322C>T (p.Arg108Cys), descrita previamente en la base de datos Human Gene Mutation Database (HGMD) asociada a epilepsia mioclónica progresiva, y en ClinVar como variante patogénica (PS1, PP5). La variante presenta predicción in-silico como patogénica (PP3), posee muy baja frecuencia en ExAC (sin la presencia de individuos homocigotas y ausente en contoles (PM2)) y se encuentra acompañada por una segunda variante patogénica/posiblemente patogénica en trans (PM3). De acuerdo con el criterio ACMG, la variante se clasifica como Patogénica (PS1 + 2PM + 2 PP).

Para el final de la clase... Herramientas que facilitarán la priorización

http://wintervar.wglab.org/

http://wintervar.wglab.org/

https://varsome.com/VarSome

VarSome

VarSome

Caso clínico I: Variante reportadaPosición Gen Cambio de

nucleótidoCambio deaminoácido

Efecto Genotipo Cob. Info Externa

1:9787030 PIK3CD G->A

c.3133G>A

p.Glu1021Lys Missense HET 41/88 rs397518423

ClinVar 5:

patogénica

La variante Missense NM_005026.4:c.3061G>A(p.Glu1021Lys) en heterocigosis en el gen PIK3CD (OMIM: 602839), sin información sobre frecuencia poblacional en la base de datos ExAC, cuenta con predicción patogénica por Mutation Taster, SIFT, PROVEAN y Polyphen (entre otros, PP3) y se encuentra reportada en ClinVar como patogénica (ClinSig 5, sin conflictos de interpretación, última entrada el 7 de Agosto del 2017, PP5). Produce un cambio de nucleótido único en la región codificante (ENST00000361110) del residuo Glutamato 1021 por Lisina, que resulta en una mutación dominante de ganancia de función en la subunidad catalítica de la fosfoinositida 3-quinasa δ (PI3Kδ, dominio funcional catalítico altamente conservado), codificada por el gen PIK3CD y asociada con un tipo de inmunodeficiencia primaria conocida como el Síndrome PI3K-δ (APDS, ACTIVATED PI3K-DELTA SYNDROME, OMIM: 615513). Se ha encontrado la variante en 17 pacientes de siete familias no relacionadas (PS1),, pero no entre 3346 sujetos sanos (PM2). La APDS se caracteriza por infecciones respiratorias recurrentes, daño progresivo de las vías respiratorias, linfopenia, aumento de las células B de transición circulantes, hiper IgM, niveles reducidos de IgG en suero, enfermedad inflamatoria intestinal y baja respuesta a vacunas. La mutación E1021K mejora la asociación de la membrana y la actividad quinasa de p110δ. Los linfocitos derivados de estos pacientes presentan niveles aumentados de fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato y proteína AKT fosforilada y son propensos a la muerte celular inducida por activación. Se ha demostrado que inhibidores selectivos de p110δ IC87114 y GS-1101 redujeron la actividad de la enzima mutante in vitro, lo que sugiere un enfoque terapéutico para pacientes con APDS (PS3). Además, la proteína PIK3CD pertenece a las PI3K y muestra una amplia especificidad de sustrato lipídico fosfoinosítido (Vanhaesebroeck et al.,

1997). De acuerdo con el criterio ACMG, la variante se clasifica como Patogénica (≥2xPS).

Caso clínico I: Variante reportada

Validación por Sanger

Validación por Sanger¿Puede confirmarse su presencia en familiares afectados?

¿Puede confirmarse su ausencia en familiares sanos?

¿Pueden realizarse experimentos que confirmen el efecto en la función del gen?

¡Gracias por su atención!

Algunas consignas resueltasPosición Gen Variación

nucleotídicaCambio deaminoácido

Efecto Cigosidad Cob.

7:2985462 CARD11 C->T p.Arg837Ter Missense HET (P) 17/38

Se encontró una variante NM_032415.5(CARD11):c.2509C>T(p.Arg837Ter) del tipo nonsense que genera un codón stop prematuro dentro de la región codificante del gen CARD11 (mecanismo conocido por ser causante de “Expansión de células B con NFKB y anergia de células T (OMIM: 616452) e inmunodeficiencia 11 (OMIM: 615206)” (PVS1). La variante se encuentra reportada en ClinVar como patogénica con última entrada en Enero 2018 (PP5), presenta predicción in-silico patogénica provista por varios predictores bioinformáticos (PP3) y posee muy baja frecuencia poblacional en ExAC (sin la presencia de individuos homocigotas) (PM2). De acuerdo con el criterio ACMG, la variante se clasifica como Patogénica (criterio Muy fuerte PVS1+ 1 Moderada (PM1-PM6) y 1 de Apoyo (PP1-PP5)).

Algunas consignas resueltas

Posición Gen Variación nucleotídica

Cambio deaminoácido

Efecto Cigosidad

Cob. Info Externa

6:146007332 EPM2A C->T p.Gly134Gly

- Synonymous HET 10/12 -

Se detecta en heterocigosis la variante sinónima NM_005670.3(EPM2A):c.402G>A (p.Gly134=) reportada en Clinvar como Benigna/Probablemente benigna (BP6). La variante presenta predicción in-silico como benigna (BP4), posee una frecuencia >5% en ExAC (BA1). La posición no se encuentra conservada evolutivamente ni forma parte de un sitio de splicing (BP7) . De acuerdo con el criterio ACMG, la variante se clasifica como Benigna (1 BA).